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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Identificação de patógenos bacterianos raras, seqüência do gene 16rRNA e MALDI-TOF MS

Published: July 11, 2016 doi: 10.3791/53176
Automatic Translation
1, 1, 2, 2
1Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, TU Dresden, 2Institut für Virologie, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, TU Dresden

Abstract

Há um certo número de agentes patogénicos bacterianos raras e, por conseguinte, suficientemente descritas, que são relatados para causar infecções graves, especialmente em pacientes imunocomprometidos. Na maioria dos casos, apenas alguns dados, em sua maioria publicados como relatos de casos, estão disponíveis que investigar o papel desses agentes patogênicos que um agente infeccioso. Por conseguinte, a fim de clarificar o carácter patogénico dos referidos microorganismos, é necessário levar a cabo estudos epidemiológicos os quais incluem um grande número dessas bactérias. Os métodos utilizados em tal estudo de vigilância tem que seguir os seguintes critérios: a identificação das estirpes tem que ser precisos de acordo com a nomenclatura válida, devem ser fácil de manusear (robustez), econômico em diagnósticos de rotina e eles têm para gerar comparáveis resultados entre diferentes laboratórios. De um modo geral, existem três estratégias para a identificação de estirpes bacterianas num local de rotina: 1) identificação fenotípica caracterizar o Biochemical e metabólicas propriedades das bactérias, 2) técnicas moleculares como a sequenciação do gene 16S rRNA e 3) espectrometria de massa como uma abordagem baseada em romance proteoma. Uma vez que a espectrometria de massa e abordagens moleculares são as ferramentas mais promissores para a identificação de uma grande variedade de espécies bacterianas, são descritos estes dois métodos. Avanços, limitações e potenciais problemas ao utilizar estas técnicas são discutidas.

Introduction

identificação segura de agentes patogénicos raros em diagnósticos de rotina é dificultada pelo fato de que os métodos culturais e bioquímicos clássicos são complicados e, por vezes questionável. Além disso, um laboratório de diagnóstico microbiologia tem de processar um grande número de agentes patogénicos, que vão desde algumas centenas a vários milhares, diariamente, o que requer o uso de sistemas automatizados. Em adição à gestão de um alto rendimento diária, é necessária a identificação precisa de espécies bacterianas. Isso se justifica, uma vez que diferem em seu padrão de susceptibilidade antimicrobiana e identificação, portanto, correta fornece o clínico com informações essenciais para escolher antibióticos apropriados (por exemplo, Enterococcus spp., Acinetobacter spp.) 12,43.

sistemas de identificação microbiana automatizados (AMIS) aplicar conjuntos padronizados de reações enzimáticas para caracterizar as propriedades metabólicas de isolados bacterianos por exemplo, 47 na placa de GN da amis utilizado neste estudo 52, esta estratégia permite a identificação segura apenas para um conjunto limitado de bactérias. Além disso, o banco de dados, um sistema especialista avançado, está claramente centrado na detecção de bactérias relevantes e altamente relevantes de importância médica 13,15,16,36. Dois outros sistemas, amplamente utilizado em laboratórios, também se aplicam esta abordagem bioquímica para a identificação de bactérias. Estudos recentes demonstram uma precisão de identificação comparáveis ​​entre os Amis utilizados neste estudo e um dos concorrentes (93,7% e 93,0%, respectivamente), enquanto que o 3º Amis tem uma precisão de apenas 82,4% de identificação em nível de espécie 35. Tais discrepâncias podem ser explicadas pela qualidade das referências de dados de identificação subjacentes, as versões de kits e software, diferenças em metabolismo e competência do pessoal técnico 35,36.

Dois sistemas de MALDI-TOF MS automatizado (sistema de identificação microbiana MALDI-TOF, IHMs) são usados ​​principalmente. Estes sistemas permitem a detecção de um grande número de espécies bacterianas com base no seu espectro de massa de proteína de impressões digitais. Por exemplo, a base de dados dos MMIs utilizadas contém 6000 espectros de referência. Sistemas de identificação baseados em espectrometria de massa oferecem detecção rápida e confiável de uma grande variedade de microorganismos, incluindo raros patógenos 11,48,51. Até à data apenas algumas comparações diretas estão disponíveis entre as MMIs utilizados neste estudo e sua concorrente 19,33. De acordo com Daek et al., Ambos os sistemas fornecem uma elevada taxa de precisão semelhante a identificação, mas os MMIs utilizados neste estudo parece ser mais fiável na identificação de espécies 19.

genes distintos Do mesmo modo, técnicas de biologia molecular endereçamento bem conservados mas também ( rpoB) permitir a identificação das espécies clara 3,22,61. Entre estes, o 16S ADNr é o gene de manutenção mais amplamente utilizado devido à sua presença em todas as bactérias 34. Sua função permanece inalterada e, finalmente, com cerca de 1.500 pb, é longo o suficiente para ser adequado para bio-informática 14,34. Muitos pesquisadores consideram análise do gene 16S rRNA como o "padrão-ouro" para a identificação bacteriana 21. Isto é devido ao facto de alguns laboratórios utilizam técnicas de hibridação DNA-DNA até à data para a identificação de bactérias raros ou novos 14,34. Além disso, mais e mais bases de dados estão disponíveis, que podem ser utilizados para análise do gene 16S rRNA 50. No entanto, tem que ser tomado em conta que os sistemas de detecção à base de ADNr 16S tem uma sensibilidade limitada em comparação com protocolos de PCR convencionais. Além disso, a abordagem molecular é sofisticado, consumindo tempo e requer pessoal altamente treinado, bem comodedicados instalações laboratoriais e é, portanto, não é facilmente implementado em diagnósticos de rotina 55. Além disso, tem sido demonstrado que a combinação de, pelo menos, dois métodos diferentes para a identificação de bactérias conduz a identificação da estirpe de elevada precisão. A combinação de MALDI-TOF MS e sequenciação de 16S ADNr permite a identificação de um grande número de diferentes espécies bacterianas com alta precisão. Recentemente, a combinação de análise genética MALDI-TOF MS e 16S rRNA foi apresentada para a identificação de bactérias estudar questões epidemiológicas e agentes patogénicos raros 56.

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Protocol

1. Extracção de DNA bacteriano

  1. Preparação de solução de PBS
    1. Pesar 1,65 g de Na 2 HPO 4 x 2H 2 O, 0,22 g de NaH 2 PO 4 x 2H 2 O e 8,80 g de NaCl, num balão e encher com água destilada para um volume final de 1000 ml. Ajustar o pH para 7,4. Para utilização final filtrar a solução através de uma bactéria-proof (0,22) filtro.
  2. Bactérias Extracção de DNA de bactérias Gram-negativas
    1. Streak o material do paciente em meio de cultura adequado (por exemplo, Columbia ágar sangue), identificar e isolar patógenos potenciais.
    2. Prepare cultura pura e executar coloração de Gram, a fim de determinar morfotipo e para confirmar a pureza e a cultura de 49.
    3. Escolher uma única colónia bacteriana e transferi-lo com uma ansa de inoculação de utilização única 1 ul num tubo de reacção de 2,0 ml estéril que contém 1 ml de solução de PBS.
    4. Incubar esta suspensão em um Thermomixer a 95 ° C durante 10 min. Após a incubação, deixar o extracto bacteriano (contendo o DNA dissolvido) arrefecer à temperatura ambiente, utilizando-a directamente para a amplificação ou armazenar a -20 ° C para utilização posterior (Figura 1a).
  3. Bactérias Extracção de DNA de bactérias Gram-positivas
    1. Streak o material do paciente em meio de cultura adequado (por exemplo, Columbia ágar sangue), identificar e isolar patógenos potenciais. Realizar coloração de Gram, a fim de confirmar morfotipo da cultura.
    2. Prepare cultura pura e executar coloração de Gram, a fim de determinar morfotipo e para confirmar a pureza da cultura.
    3. Escolha uma única colônia de bactérias com 1 ml de loop de inoculação estéril e suspendê-la em 500 solução de PBS em um tubo de 2,0 ml reação.
    4. Adicionar 500 mL de vidro-esferas e transferir o tubo para um homogeneizador oscilante, operado a frequência máxima e a amplitude (50 Hz), durante 5 min. Use vidro-esferas de 1,0 mm de diâmetropara romper as paredes das células bacterianas.
    5. Incubar este tubo durante 10 minutos a 95 ° C e arrefecer à temperatura ambiente. Utilizar o extracto, quer directamente para a reacção de PCR ou armazenar a -20 ° C para posterior utilização.

2. 16S rDNA PCR

  1. Preparação de iniciadores de amplificação
    1. Use o TPU1 primers (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3 '[M = A / C]) como iniciador directo e RTU4 (5'-TAC CAG GGT ATC AT CTP TGT T-3') como iniciador reverso 25. Prepara-se uma solução stock de iniciador com DNAse e RNAse água livre, com uma concentração de 100 pmol / ul (100 uM) e dilui-se ainda mais para uma solução de trabalho a 10 pmol / uL. Armazenar o iniciador e da solução de trabalho à temperatura de -20 ° C ou utilizar directamente.
  2. Preparação da Mistura de Reacção de PCR
    1. Pipetar 1 mL de cada iniciador, 1 ul de dNTP-Mix (100 mM), 2,5 ul do extracto de DNA, 5? L de 10x tampão PCR (25 mM contendo MgCl 2), 0,25 mL de Taq-polimerase (5 unidades / mL) e 39,25 mL DNase e RNase água PCR livre em um tubo de reacção 200 mL estéril.
  3. Protocolo de PCR
    1. Inicie o programa de PCR construído como se segue: Em primeiro lugar, um passo de incubação inicial a 95 ° C durante 5 min que é necessário para activar a polimerase de Taq-. Em segundo lugar, 35 ciclos de amplificação, que contém um 1 min. passo de desnaturação a 95 ° C, um 1 min. iniciador passo de recozimento a 50 ° C, e um passo de extensão do primer 1,5 min a 72 ° C. Em terceiro lugar, uma extensão final de 10 min a 72 ° C. Finalmente, a reacção de PCR é arrefecida a 4 ° C.
      NOTA: Staphylococcus aureus e H2O servir como controlo positivo e negativo (Figura 1b).
    2. Colocar o tubo contendo a mistura reaccional de PCR no termociclador e iniciar o programa.
  4. A purificação do produto de PCR
    NOTA: De modo a purificar o produto de PCR, ambos os vários protocolospode ser usado de enzima à base ou com uma matriz de adsorção de sílica. A limpeza de um só passo de PCR utilizado aqui utiliza duas reacções enzimáticas hidrolíticas. Enquanto exonuclease I (Exo I) remove DNA de cadeia simples, fosfatase alcalina de camarão (SAP) hidrolisa dNTPs não incorporados. O segundo procedimento é baseado em uma técnica de adsorção com membrana de sílica com um sal de alta rápida ligação - lavar - baixo teor de sal ciclo de eluição.
    1. Adicionar 1,5 uL de uma mistura enzimática contendo tanto Exo I e a SAP a 25 uL do produto de PCR, misturar cuidadosamente e transferir para um termociclador aplicação de um protocolo simples de primeiro 15 min a 37 ° C, seguido de 15 min a 80 ° C. Armazenar o produto de PCR purificado, quer à temperatura de -20 ° C ou usá-lo directamente como alvo para a marcação de PCR.

3. DNA de agarose eletroforese em gel

  1. Preparação do tampão de electroforese (TBE-tampão)
    1. Titula-se 54,0 g (445 mM) de base Tris, 27,5 g (445 mM) de ácido bórico e 20 ml de uma 0,5 M de EDTA (10mM) solução a pH 8,0 com NaOH num frasco e preenchê-lo com água destilada até um volume total de 1.000 ml. Em seguida, diluir esta tampão 5x 1:10 com água destilada (0,5x TBE) para eletroforese.
  2. Preparação do tampão de carregamento
    1. Misturar 250 mg de azul de bromofenol, 250 mg de xileno cianol FF e 15 g de polissacarose (Tabela Materiais) para um frasco. Em seguida, preenchê-lo com tampão 0,5x TBE para um volume total de 100 ml. Alíquota o corante de carga a porções de 1 ml e armazenar a -20 ° C para posterior utilização.
  3. Fundição do gel de agarose
    1. Pesar 6 g de electroforese de agarose padrão de 300 ml de tampão TBE 0,5x (ver secção 3.1.1) num balão, para se preparar a 2% (w / v) de gel de agarose. Em seguida, coloque a mistura de agarose em um forno de micro-ondas, aquecê-lo ponto próximo de ebulição até que a agarose esteja completamente dissolvido ea solução parece clara.
    2. Deixe as agarose fundida arrefeça suficientemente e adicionar 10 ul de uma solução 1% (w / v) de brometo de etidio da solução. Verter a solução em um molde e colocar um pente de gel (permitindo 30 poços) no molde. Remover o pente quando o gel é completamente solidificada e colocar o gel dentro da câmara de electroforese contendo tampão TBE 0,5x.
      NOTA: O brometo de etídio é tóxico e mutagênico. Por isso, devem ser manuseados com cuidado. É aconselhável usar luvas de borracha nitrílica. Há manchas de ácidos nucleicos intercalante alternativos que podem ser utilizados como uma alternativa não tóxica.
  4. Electroforese em gel de agarose dos produtos de PCR
    NOTA: A fim de verificar o tamanho correcto dos produtos de amplificação de PCR e para estimar a concentração de ADN do produto de PCR purificado é separado num gel de agarose.
    1. Pipeta 2 ul do tampão de carga para um tubo de reacção de PCR e adicionar 8 ul do produto de PCR. Pipetar esta mistura nas cavidades do gel. Adicionar 8 mL de um marcador de tamanho-peso molecular (escada de DNA) em um poço separado para estimar o tamanho do produto de PCR.
    2. Apliqueuma voltagem constante de 10 V / cm e parar a electroforese, logo que o marcador de azul de bromofenol atingiu cerca de ¾ do comprimento total do gel. Visualizar os fragmentos de PCR separadas usando um UV-transilluminator (comprimento de onda 302 nm) e documentá-los usando um sistema de gel documentação. Estimar a quantidade de DNA por comparação visual com a escada de DNA. Use cerca de 10 ng como alvo para a rotulagem PCR.

4. O sequenciamento Sanger

  1. Cycle Sequencing PCR
    NOTA: Executar a rotulagem PCR em uma reação de 10 mL usando um kit comercial (Materials Table).
    1. Adicionar 2 mL de mastermix reacção 5x, 2 ul da preparação de ADN, 1,5 ul de solução TPU1 ou RTU4 de trabalho (10 pmoles / ul) e 4,5 ul de DNase e RNase água livre.
    2. Coloque esta mistura reacção de sequenciação em um termociclador e executar outra PCR. No total, 25 ciclos de processo que consiste em um passo de desnaturação (96 ° C,10 seg), um passo de recozimento (45-60 ° C, 5 segundos) e um passo de extensão (60 ° C, 2 min). Finalmente, arrefece-se a reacção a 4 ° C.
  2. A purificação da reacção de sequenciação
    1. Purifica-se a mistura de reacção de marcação utilizando colunas de centrifugação comerciais para a purificação de PCR (Tabela Materiais).
    2. Carga de 10 uL da reacção de sequenciação para a matriz de gel-filtração pré-hidratado e realizar um passo de centrifugação a 750 xg durante 3 min.
      NOTA: Através da utilização do presente procedimento de terminadores corantes não incorporadas são retidos na matriz de gel.
    3. Em seguida, secar o eluído aquoso num concentrador de vácuo. Centrifugar a 2.500 xg durante 20 a 30 min a 40 ° C para completar a secura.
    4. Adicionar 10 ul de formamida desionizada, em seguida, altamente desnaturar a 90 ° C durante 2 min e arrefece-se a mistura em gelo. Pipetar 10 ul das amostras desnaturadas numa placa de 96 ul. Armazenar o produto de PCR seca e limpa-se a -20 ° C, se a análise épara ser realizada a uma hora mais tarde.
  3. 16S rRNA gene seqüenciamento e análise da sequência de ADN
    NOTA: Realizar análise de sequência em um sequenciador automático (Tabela de Materiais). O sequenciador usado aqui é um sistema de electroforese capilar à base de fluorescência automatizada que analisa 4 amostras simultaneamente (matriz de 50 centímetros 4-capilar) com um líquido de polímero 67 (Figura 1C).
    1. Colocar a placa de microtitulação no sequenciador. Escrever uma folha de amostra (registro placa), conforme estabelecido em 2, guardá-lo e iniciar o sequenciamento run / análise a seguir os passos indicados em 1.
      NOTA: Duração de uma corrida sequência é de 2 horas e fornece dados de 800 a 1.000 pb.
    2. Abra o software de análise de sequenciação (Materials Table). dados de sequência são dados como um arquivo de texto (.seq) e um arquivo contendo o electrofograma incluindo os valores de qualidade (QV) (.ab1).
      Observação: chamar Base é automaticamente performado pelo software de análise de sequenciação e eletroferograma subjacente é verificado visualmente (por exemplo, altura do pico, a separação de pico) antes que a sequência é usada para outras aplicações.
    3. Compare o arquivo de seqüência de DNA armazenada com o algoritmo BLAST NCBI banco de dados nr usando (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide).

5. MALDI-TOF MS

NOTA: O espectrómetro de massa utiliza um laser de 337 nm, N2 e é operado por um software de controlo específico (Tabela Materiais). Spectra são registrados no modo linear e uma gama de massa entre 2.000 a 20.000 Da é coberto. A interpretação dos dados e a atribuição de pontuações para as amostras é efectuada em tempo real por um programa de análise (Tabela Materiais) (Figura 1D).

  1. Preparação de Bactérias por MALDI-TOF MS Análise
    1. Crescer as bactérias de interesse (por exemplo, Myroides odoratimimus) sobre Colagar de sangue umbia contendo 5% de sangue de cavalo a 37 ° C durante 18 a 24 horas, dependendo da estirpe bacteriana (Figura 2a). Realizar coloração de Gram para verificar a morfotipo do organismo sob investigação, bem como a pureza da cultura.
    2. Usar um palito de madeira para a transferência de uma única colónia bacteriana para um poço de um alvo de aço de 96 poços (Figura 2b e 2c). Ponto 1 ml de ácido fórmico 70% em cima do organismo seca ao ar no alvo de aço e deixar secar por cerca de 2-3 min.
    3. Em seguida, sobrepor o local com solução de matriz 1 ul, contendo 50 mg / ml de CHCA (α-ciano-4-hidroxicinâmico) num solvente orgânico (50% de acetonitrilo, 2,5% ácido trifluoroacético, 47,5% de H2O).
      NOTA: O método da sobrecamada de ácido (no método de preparação placa) pode ser usado para melhorar a qualidade dos espectros de massa. Tem sido demonstrado que, para as bactérias Gram-positivas, um "ataque ácido" VA aumenta a pontuaçãolues do espectro medido 45.
      NOTA: Alternativamente, um sistema de preparação de amostras automatizado (Tabela Materiais) pode ser utilizado no qual os pontos de contacto livre de 1 ul de 70% de solução de ácido fórmico e, após um primeiro ciclo de secagem, a solução de matriz 1 ul são aplicados sobre a mancha bacteriana. As amostras são então secas sob condições padronizadas a 60% de umidade relativa e está pronto para usar para análise.
    4. Deixe o esfregaço com uma matriz revestida seca ao ar novamente por cerca de 5 minutos em uma capa. Esta mancha bacteriana com a matriz aplicada é agora estável por muitas horas.
      NOTA: manchas bacterianas sem matriz pode não ser estável devido à degradação de proteínas.
  2. Executando a MS Análise de MALDI-TOF
    1. Introdução de amostras
      1. Abra o software de nossas IHMs (Materiais Tabela) controle.
      2. Arejar a porta de carregamento de amostra do espectrómetro de massa, premindo o botão IN / OUT do instrumento.
      3. Abra a porta de carregamento após um clique e insira a placa-alvo MALDI-TOF MS com a mancha bacteriana seca mais matriz.
      4. Feche a porta e evacuar novamente. Observar vácuo e quando se chega a 4,5 x 10 -6 mbar iniciar a medição.
    2. Análise de amostras
      1. Abra o software de análise de nossas IHMs (Tabela de Materiais) e clique no menu "Arquivo". Selecione "Nova classificação" e um novo "assistente de classificação em tempo real MALDI biotyper" janela se abre. Digite o nome do projeto, por exemplo "project_1 medição Myroides, no campo" Nome do projeto "e pressione o botão" Novo ". De acordo com a nova caixa de diálogo denominada" Novo projeto "nome do projeto de seleção e continue pressionando o botão" OK ".
      2. No "Assistente de classificação em tempo real biotyper MALDI" observar a janela "colocação Analito" aberto. Selecionar posições de destino (por exemplo, A1, A2, A3 ...), bem-click qualquer posição selecionada (indicada por um quadrado azul) e selecione "Adicionar amostras". Na tabela aberta automaticamente tipo de vista em nome da amostra, ID da amostra e, opcionalmente, um comentário. Clique no botão "Next" para prosseguir.
      3. No "Assistente de classificação em tempo real biotyper MALDI" observar a "Seleção de MALDI métodos biotyper" janela aberta. Selecione "Bruker Taxonomia" de "MSPs de árvores de taxonomia" e clique em "Next" para continuar.
      4. No "Assistente de classificação em tempo real biotyper MALDI" observar a janela "Resumo do Projeto" aberto. Verifique as entradas inseridas dadas acima para o projeto de classificação real. Comece a classificação executado pressionando o botão "Finish" (Figura 2d - f). A medição inicia-se automaticamente quando o vácuo adequada seja atingida.
      5. Siga a classificação de execução até que a medição é concluída com êxito. Veja a tabela de resultados em tele "MALDI Biotyper Realtime Myroides classificação do projeto de medição project_1" abrir o menu "Visualizar" e clique em "Resultados".
      6. Ver os "Bruker Daltonics MALDI Biotyper Classificação Resultados" como arquivo HTML no navegador padrão web. Imprimir e salvar os resultados.
    3. Medida de um padrão de teste diariamente antes da amostra de análise para calibrar o instrumento e executar instrumento semanal de validação (instrumento de auto-teste).
      Nota: Durante a medição MALDI-TOF Os espectros são analisados ​​em tempo real pelo software de análise (Tabela Materiais). A lista de dez espécies com suas respectivas pontuações é dado e é alimentada no sistema de informação laboratorial (LIS) para relatórios.
    4. Avaliar criticamente os resultados MALDI-TOF MS (ver resultados representativos) e, se necessário, incluir outros testes, tais como perfis biochemical- e antibióticos suscetibilidade ou 16S rRNA sequenciamento de genes e, se necessário, coloração de Gram paraa atribuição de uma espécie bacteriana para o relatório microbiológica.

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Representative Results

MALDI-TOF MS é um método rápido e barato para diagnósticos de rotina microbiológicos romance,. Identificação de espécies bacterianas por MALDI-TOF MS produz espectros composta principalmente de proteínas ribossomais, mas também outras "proteínas muito conservadas com funções casa de manutenção afetados o menos possível e por condições ambientais" 17 banco de dados .A deste MMIs contém um grande conjunto de espectros de referência e até mesmo bactérias, que raramente são encontrados em isolados clínicos podem ser seguramente identificados 7,56,57. valores de pontuação de mostrar a confiabilidade das espécies identificadas. Escores acima de 2.300 representam uma altamente provável identificação das espécies, uma pontuação entre 2.000 e 2.300 indica uma identificação de espécies seguro, uma pontuação entre 1.700 e 2.000 estandes para uma provável identificação de espécies e uma pontuação abaixo de 1.700 é não-confiável. No caso de mais de uma espécie a ser identificado com uma pontuação acima de 2.000, tes adicionaists têm de ser aplicadas e esta é a razão pela qual há uma combinação entre métodos diferentes, tais como 16S rDNA, API e técnicas que abordam a morfológicas e / ou fenótipo bacteriana, tais como coloração de Gram, motilidade etc. No caso em que a pontuação está abaixo 1.700 os testes acima mencionados têm de ser usadas para conseguir a identificação da espécie de confiança. Uma combinação de MALDI-TOF MS e 16S rDNA foi demonstrado recentemente 56-58. Deve-se salientar que as orientações claras para a determinação de espécies com base em homologias de sequência 16S rDNA ainda faltam 22,61. Para interpretação prática, homologias de ≥97%, como proposto por Stackebrandt e Göbel 61, são usados ​​56. Os avanços na sequenciação de ADN permite a determinação de genomas bacterianos completos por técnicas de nova geração a custo relativamente baixo e, portanto, em princípio, a identificação de bactérias com base na sua sequência de genoma. Esta técnica já tem sido utilizada emgenoma gestão de surto ou baseado em epidemiologia 9,29. No entanto, a limitação mais forte hoje é a falta de fácil de utilizar pacotes de software para o utilizador final 65.

Sete exemplos de bactérias que ocorrem raras, isoladas a partir de amostras de pacientes durante o diagnóstico de rotina e analisadas tanto por MALDI-TOF de sequenciação do gene de MS e 16S rRNA estão listados na Tabela 1. MALDI-TOF Os espectros da estirpe # 1 a # 6 são mostrados na Figura 3 e um espectro de estirpe # 7, Sphingobacterium spiritivorum, é mostrado na Figura 1E. Todos os isolados mostram altas pontuações na análise de MS MALDI-TOF e 99 a 100 homologias de sequência% 16S rDNA. Assim, ambas as técnicas de conduzir a garantir género e espécie de identificação. No entanto, como apontado em uma publicação recente sobre a comparação de métodos de Myroides sp identificação., A combinação de sequenciação genética MALDI-TOF MS e 16S rRNA levou a r mais confiávelesultados 56. Estes dados ilustram que um único método usado pode não ser sempre suficiente para se conseguir um resultado de identificação fiável. A combinação dos dois métodos independentes conduz a uma maior precisão e expande-se a base de dados comercial de MALDI-TOF MS com in-house entradas resultou em uma identificação inequívoca 56 espécies.

A estirpe # 1 foi identificado como Chryseobacterium gleum (MALDI-TOF MS pontuação 2.490, homologia de sequência de 99%). Chryseobacteria são, bastonetes gram-negativos não fermentadores e relacionado a Myroides spp. Chryseobacterium spp. são considerados como patógenos emergentes, associadas a septicemia, pneumonia e infecções do trato urinário. O Chryseobacterium gênero compreende um grande número de espécies e as espécies mais estudadas é indologenes Chryseobacterium. Semelhante a infecções causadas por Myroides sp., Os pacientes imunocomprometidos são principalmente afectados6,10,60. A estirpe # 2 foi identificado como Myroides odoratimimus (MALDI-TOF MS pontuação 2.436, homologia de sequência de 99%) e a estirpe # 3 como Myroides odoratus (MALDI-TOF MS pontuação 2.237, homologia de sequência de 99%) Myroides sp. são Gram-negativas, varas não-fermentadoras, que estão associados com doenças graves, tais como sepsia, celulite ou pneumonia. Principalmente pacientes imunocomprometidos com doenças hematológicas ou oncológicas subjacentes são afetados 8,18,42. A estirpe # 4 foi identificado como Sphingobacterium multivorum 32,71 (MALDI-TOF MS pontuação 2.092, homologia de sequência de 99%).

As bactérias são hastes não fermentadoras Gram-negativos, que podem causar septicemia em pacientes imunocomprometidos 5,24,44,53. Além disso, um caso de meningoencefalite fatal foi avaliado 70. As manchas # 5 (MALDI-TOF MS marcar 2.282, homologia de sequência de 100%) e nº 6 (MALDI-TOF MS marcar 2.289, homólogo sequênciay 100%) foram identificadas como Wohlfahrtiimonas chitiniclastica. Estas bactérias são curtos, não-móveis, bacilos Gram-negativos que foram isolados primeira a partir de larvas da mosca parasita Wohlfahrtia magnifica e descritos em 2008 66. Estas bactérias zoonóticas são considerados como patógenos emergentes e agentes causadores de bacteremia, septicemia ou infecção dos tecidos moles 4,40,64. Curiosamente, a maioria dos pacientes reportados eram ou sem abrigo e / ou sofreu de alcoolismo e, por conseguinte, a ocorrência destes agentes patogénicos raros, pode ser explicado pela maior taxa de ectoparasitas na população de rua 4,54. A estirpe # 7, Sphingobacterium spiritivorum (MALDI-TOF MS pontuação 2.269, homologia de sequência de 100%), é raro um agente patogénico. Isto pode causar infecções em doentes imunocomprometidos e primeiros isolados de humanos foram descritos em 1982 31,71. Um recente relatório identifica como agente causador Sphingobacterium spiritivorum para um caso fatal de bacteremia e sepse em um paciente com leucemia mielóide aguda 38.

figura 1
Figura 1:. Fluxo de trabalho para o ácido nucleico e / ou espectrometria de detecção baseada em massa de bactérias clinicamente relevantes no laboratório de microbiologia médica Partindo de uma cultura pura (a), o DNA alvo é amplificado em um termociclador (b). Amplicons de PCR são sequenciados num sequenciador de quatro capilar utilizando tecnologia de Sanger (c). Os resultados da sequenciação são determinados como porcentual de homologias de sequências de consulta para as entradas do banco de dados por comparação assistida por computador. Um segundo método baseado proteómica, utiliza espectrometria de massa (d), e no centro um resultado espectroscopia de massa da estirpe # 1 na Tabela 1, Sphingobacterium spiritivorum, incluindo a sua pontuação de MALDI-TOF MS, é dada (E </ Strong>). Uma combinação de espectrometria de massa e 16S rRNA sequenciamento de genes pode ser necessário, a fim de alcançar uma identificação das espécies mais confiável e precisa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2:. Análise procedimento usando MALDI-TOF MS para a identificação de bactérias clinicamente relevantes O operador converte material de célula completa bacteriana (a) com um palito de dentes a partir de uma cultura pura (b) e coloca esfregaços bacterianas sobre um alvo de aço (c). O alvo de aço é inserida na porta de carga do espectrómetro de massa. Quando o vácuo adequada de 5 x 10 -6 mbar é atingido, o alvo será movido para a câmara de ionização. Usando um -lase N2R, iões são criados por dessorção macia que são depois aceleradas num campo electrostático (d) e separadas no tubo de voo (e). O tempo de voo (TOF) necessário para que os iões para atingir o detector do lanço de tubo (F) está directamente relacionada com a sua massa e forma a base de cálculos subsequentes de picos de massa. Software de identificação específico (Materials Table), em seguida, atribui valores de pontuação com a impressão digital espectro de massa de proteínas bacterianas ionizados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: MALDI-TOF espectros e atribuídas dezenas de agentes patogénicos raros nesta figura, representante espectros MALDI-TOF dos primeiros seis agentes patogénicos lis raras.Ted na Tabela 1 são mostrados. Nome da espécie e pontuação MALDI-TOF MS correspondente são anotados em cada espectro. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

# 3
Tensão identificação MALDI pontuação MALDI Resultado 16s rDNA homologia BLAST
# 1 Chryseobacterium gleum 2.211 Chryseobacterium gleum 99% de identidade
# 2 Myroides odoratimimus 2.397 Myroides odoratimimus 99% de identidade
Myroides odoratus 2.237 Myroides odoratus 99% de identidade
# 4 Sphingobacterium multivorum 2.093 Sphingobacterium multivorum 99% de identidade
# 5 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 2.282 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 100% de identidade
# 6 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 2.289 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 100% de identidade
# 7 Sphingobacterium spiritivorum 2.269 Sphingobacterium spiritivorum

Tabela 1: Resultados Representante MALDI-TOFS de bactérias que ocorrem raras em comparação com 16s rRNA sequenciação genética.

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Discussion

Ambos MALDI-TOF MS e 16S rRNA sequenciação genética oferecem a possibilidade de identificar um grande número de diferentes bactérias. MALDI-TOF MS é um método rápido e barato, o que é fácil de manusear e de grandes bases de dados de espectros de massa bacteriana estão disponíveis. Por esta razão, MALDI-TOF MS é um custo método rápido, eficaz e de confiança para realizar os estudos de rastreio focados em agentes patogénicos bacterianos raras 17,20,39,51. Em um estudo prospectivo comparando MALDI-TOF MS com outros métodos de identificação fenotípica, Seng et al. Eficácia de custo demonstrada e velocidade de MALDI-TOF MS 59 e Tan et al. Relataram uma redução dos custos de reagentes e de trabalho para a identificação de bactérias em seu ambiente de laboratório de 56,9% ao ano 62. Estas reduções de custos são suportados por uma nota de Gaillot et al 28.

Por outro lado, 16S rDNA é mais demorado, laborioso e garante especializada Personnel para realizar a análise 34. No entanto, ambas as abordagens são adequados para o diagnóstico de rotina e pode ser demonstrado que a combinação destes dois métodos conduz a uma maior fiabilidade e precisão de identificação mais seguro, o que é particularmente benéfico no caso de resultados duvidosos 56. Assim, propomos a combinação de ambos os métodos como a melhor abordagem para verificar a identificação de bactérias que ocorrem raros em diagnósticos de rotina. Para identificação de espécies de confiança, é absolutamente imperativo para usar culturas bacterianas puras, porque culturas mistas evitar determinação das espécies. Como uma verificação de plausibilidade, identificação de espécies obtida com qualquer MALDI TOF MS ou 16S rDNA tem que estar de acordo com os resultados de coloração de Gram, caracterização bioquímica e a apresentação clínica 49.

espectrometria de massa como uma ferramenta analítica para a identificação bacteriana foi proposto pela primeira vez em 197551. No entanto, levou até o final de 1980 para estabelecer uma abordagem viável para a análise de proteínas. A tecnologia "soft dessorção de ionização" foi introduzido por Koichi Tanaka em 1985 63, que recebeu o Prêmio Nobel de Química em 2002, permitindo a análise de proteínas intactas. Ao mesmo tempo, o tempo de ionização assistida por matriz de voo de espectrometria de massa foi introduzida pela Hillenkamp e Karas, que foram os primeiros a usar um ácido orgânico para analisar biomoléculas 37 e este é o método que ainda hoje é utilizado. Embora a tecnologia MALDI foi usado esporadicamente 23,30,41, demorou até 2004, quando Bruker Daltonics introduziu seu microflex sistema MALDI Biotyper (Pittcon Conference & Expo 2004, press release), que a identificação microbiana baseada MALDI-TOF MS tornou-se uma rotina técnica de diagnóstico 46. Abordagens recentes nas técnicas de MALDI-TOF MS deu a oportunidade de identificar leveduras, detectar bactérias multirresistentese realizar antimicrobiana 17,51 testes de sensibilidade. Além disso, certos procedimentos oferecem a possibilidade de analisar diretamente as bactérias a partir de amostras primários, como urina ou sangue culturas 17,51.

Embora a utilização deste sistema é principalmente fácil, existem algumas desvantagens que possam influenciar os resultados. A idade dos microrganismos, por exemplo afecta a expressão da proteína bacteriana e, portanto, a reprodutibilidade dos resultados. Em primeiro lugar, as condições de crescimento pode ser um problema. Como um exemplo, enterobactérias tais como Escherichia coli crescer mais rapidamente do que as bactérias não-fermentação (por exemplo, Pseudomonas aeruginos a) e, consequentemente, têm que ser analisados ​​anterior 17. Em segundo lugar, a matriz utilizada para MALDI-TOF MS consiste de moléculas de ácidos orgânicos pequenos que têm uma absorção óptica a laser forte para o comprimento de onda do laser usado. Antes da análise da matriz é adicionado à amostra e ambos os componentes de submeter a um crystallizatioprocesso n formando uma solução sólida.

Isso explica por que mudanças na matriz pode afetar a precisão da identificação bacteriana 17. Portanto, as soluções da matriz, não mais de 7 dias preparada na hora, deve ser usado. Em terceiro lugar, o meio a partir do qual as bactérias são colhidas podem influenciar a identificação resulta 17,68. Por exemplo, violeta de cristal, que é um componente de ágar de MacConkey, interfere com os espectros de massa 17. Além disso, muitas bactérias aplicadas no alvo de aço vai levar a menor pontuação e, portanto, afetar a precisão de identificação. Portanto, é aconselhável definir critérios claros quanto à forma como a análise é realizada. No entanto, resultados enganosos realizados por MALDI-TOF MS são causados ​​por espectros de referência insuficientes contidas no banco de dados. (Atualmente, a base de dados contém> 6.000 entradas.) Isto é especialmente o caso ainda para a identificação de bactérias anaeróbias 17. No entanto, umaOs espectros de es adicionais podem ser adicionadas pelo utilizador. Biblioteca MALDI-TOF MS, por exemplo, contém 98 espectros de referência adicional de isolados que não são adequadamente abordados pelo banco de dados original, tais como Mycoplasma sp., Myroides sp., Legionella sp., Roseomonas sp., Comamonas sp. E Chryseobacterium sp. Consequentemente, espectros de referência adicional vai levar a uma precisão de identificação mais elevada 59,69. Finalmente, em alguns casos, os espectros de espécies diferentes são muito semelhantes. Isso pode levar a erros de identificação em casos como a discriminação de Escherichia coli e Shigella spp. ou Streptococcus pneumoniae e Streptococcus mitis 17,51.

Seqüenciamento do 16S rDNA e genes adicionais, tais como rpoB simplificaram a identificação molecular de bactérias raras ou desconhecidas. Estes genes são comuns na maioria das bactérias e a sua função é indivíduoidêntico. No entanto, uma vez que eles possuem variabilidade genética suficiente para produzir resultados que permitem uma diferenciação no género e nível de espécies, que podem ser utilizados para a identificação de bactérias 34. De acordo com Stackebrandt e Gobel, homologias <97% representam 61 espécies diferentes. No entanto, homologias> 97% não conduz necessariamente a uma identificação de espécies seguro 34,47. Estas incertezas têm várias razões.

A qualidade dos bancos de dados que são utilizados para calcular as homologias às vezes é questionável 34. Nos casos em que existem altas homologias ao nível 16S rDNA, as incertezas podem resultar na identificação das espécies. Uma combinação de diferentes regiões genéticas podem, portanto, levar a resultados mais seguros. Além disso, não existem orientações gerais para a interpretação do 16S rDNA 22,34,61 dados de sequenciamento. No entanto, o aumento da fiabilidade das bases de dados existentes levará a uma maior Accuatrevido para a identificação de bactérias usando esta abordagem molecular 34. Em relação à reacção de sequenciação é preciso mencionar que a precisão dos resultados da sequenciação depende principalmente da qualidade da PCR subjacente. Além disso, uma vez que os resultados estão sendo adquirida por comparando-as com as entradas listadas em bancos de dados públicos, a qualidade de entradas de seqüência e de manutenção dos dados é de importância crucial.

Em geral, embora ambas as abordagens, de MALDI-TOF MS e sequenciação do gene de rRNA 16S, tem vantagens mas também têm pontos fracos. A combinação de ambos os métodos, no entanto, conduz a uma alta precisão para a identificação de bactérias. Por exemplo, em um estudo anterior podemos demonstrar que MALDI-TOF MS é capaz de distinguir entre Myroides odoratimimus e Myroides odoratus 56. Em alguns casos, a pontuação MALDI sugeriu a identificação de espécies não confiável, enquanto que os resultados obtidos por 16S rDNA poderia confirmar a espécieidentidade. impressões digitais espectrais de massa destes isolados foram então criado e introduzido no nosso banco de dados de referência espectros MALDI. Futuras pesquisas com foco em outras bactérias raros, podem demonstrar a aplicabilidade da estratégia proposta.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
CHROMASOLV, HPLC grade water, 1 L Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany 270733
Tissue Lyser LT Qiagen, Hilden, Germany 85600 Oscillating homogenizer
Glass-beads 1.0 mm VWR International, Darmstadt, Germany 412-2917
Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg, Germany 2050-100-05
QIAamp DNA Mini Kit (250) Qiagen, Hilden, Germany 51306
Taq PCR Core Kit (1,000 U) Qiagen, Hilden, Germany 201225
Forward Primer TPU1 (5´-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’) biomers.net, Ulm, Germany  -
Reverse Primer RTU4 (5´-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3´) biomers.net, Ulm, Germany  -
Mastercycler  Eppendorf, Hamburg, Germany -  Thermocylcer
Reaction tube 1.5 ml SARSTEDT, Nümbrecht, Germany 72,692
Reaction tube 2 ml SARSTEDT, Nümbrecht, Germany 72,693,005
PCR 8er-CapStrips Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 711040X
PCR 8er-SoftStrips Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 711030X
Sharp R-ZV11  Sharp Electronics, Hamburg, Germany - Microwave
Titriplex III (EDTA Na2-salt dehydrate; 1 kg) Merck, Darmstadt, Germany 1084211000
SeaKem LE Agarose Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 849006
SmartLadder SF - 100 to 1,000 bp Eurogentec, Lüttich, Belgium MW-1800-04
Bromophenol blue (25 g) Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany B0126
Xylene cyanol FF (10 g) Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany X4126
ComPhor L Maxi  Biozym, Hessisch Oldendorf, Germany -
Ethidium bromide solution 1% (10 ml) Carl Roth, Karlsruhe, Germany 2218.1
Gel Doc 2000 Bio-Rad Laboratories, München, Germany - Gel-documentation system 
ExoSAP-IT (500 reactions) Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, United Kingdom 78201
Buffer (10x) with EDTA  Life Technologies, Darmstadt, Germany 402824
BigDye Terminator Kit v1.1 Life Technologies, Darmstadt, Germany 4337450
Hi-Di formamide (25 ml) Life Technologies, Darmstadt, Germany 4311320
DyeEx 2.0 Spin Kit (250) Qiagen, Hilden, Germany 63206
3130 Genetic Analyzer Life Technologies, Darmstadt, Germany - Sequencer
MicroAmp optical 96-well reaction plate with barcode Life Technologies, Darmstadt, Germany 4306737
3130 Genetic Analyzer, plate base 96-well Life Technologies, Darmstadt, Germany 4317237
3130 Genetic Analyzer, plate retainer 96-well Life Technologies, Darmstadt, Germany 4317241
3130 Genetic Analyzer, well plate septa Life Technologies, Darmstadt, Germany 4315933
3130 Genetic Analyzer, POP-7 Polymer, 7 ml Life Technologies, Darmstadt, Germany 4352759
3130 Genetic Analyzer, 4-Capillary Array, 50 cm Life Technologies, Darmstadt, Germany 4333466
Sequencing Analysis Software 5.4 Life Technologies, Darmstadt, Germany -
microflex Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Our mMIS
VITEK MS bioMérieux, Nürtingen, Germany  2nd mMIS
flexControl 3.4 Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Device control software
Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC) Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Analysis software
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA, 1 g Bruker Daltonik, Bremen, Germany 201344
Peptide Calibration Standard II Bruker Daltonik, Bremen, Germany 222570
MSP 96 target polished steel Bruker Daltonik, Bremen, Germany 8224989
peqGREEN peqlab  37-5010
MALDI Biotyper Galaxy  Bruker Daltonik, Bremen, Germany Part No. 1836007  Automated sample preparation system
Vitek 2  bioMérieux, Nürtingen, Germany  Our aMIS
MicroScan  Beckman Coulter, Krefeld, Germany 2nd aMIS
BD Phoenix™ Automated Microbiology System BD, Heidelberg, Germany 3rd aMIS
Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC® 25923™) American Type Culture Collection (ATCC), LGC Standards, Molsheim, France Positive control for PCR 

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Identificação de patógenos bacterianos raras, seqüência do gene 16rRNA e MALDI-TOF MS
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Schröttner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS. J. Vis. Exp. (113), e53176, doi:10.3791/53176 (2016).

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