Microperfusion तकनीक चूहा अन्त्रपेशी में microvessel पारगम्यता के नियमन जांच

Abstract

व्यक्तिगत रूप से भरकर रखा microvessels की पारगम्यता गुणों को मापने के लिए प्रयोगों सुसंस्कृत endothelial सेल monolayers और पूरे microvascular बेड के कार्यात्मक विनिमय गुण में संवहनी पारगम्यता को विनियमित करने आणविक और सेलुलर तंत्र की जांच के बीच एक सेतु प्रदान करते हैं। Cannulate और चूहा अन्त्रपेशी की venular microvessels छिड़कना और microvessel दीवार के हाइड्रोलिक चालकता को मापने के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है। जरूरत मुख्य उपकरण तीन अलग-अलग microtools की स्थिति के लिए micromanipulators का समर्थन करता है कि एक बड़े संशोधित मंच के साथ एक intravital खुर्दबीन में शामिल हैं: (1) एक beveled कांच micropipette cannulate और microvessel छिड़कना; (2) एक गिलास सूक्ष्म occluder क्षणिक छिड़काव ब्लॉक और एक मापा हीड्रास्टाटिक दबाव में transvascular जल प्रवाह आंदोलन की माप के लिए सक्षम है, और (3) एक कुंद गिलास छड़ी केन्युलेशन के स्थल पर mesenteric ऊतकों को स्थिर करने के लिए। संशोधित लैंडिस सूक्ष्म रोड़ा techniqUE microvessels भर में इन के रूप में प्रयोगात्मक शर्तों को बदल रहे हैं प्रवाह और हीड्रास्टाटिक और कोलाइड आसमाटिक दबाव अंतर के दोहराया माप सावधानी से नियंत्रित कर रहे हैं सक्षम बनाता भी transvascular द्रव आंदोलन के मार्कर के रूप में कृत्रिम perfusate में निलंबित लाल कोशिकाओं का उपयोग करता है, और। पहले तो परीक्षा perfusates साथ ही microvessel की फिर से केन्युलेशन के बाद, एक नियंत्रण perfusate का उपयोग कर हाइड्रोलिक चालकता के माप इन अच्छी तरह से नियंत्रित परिस्थितियों में microvessel प्रतिक्रिया की तुलना की बनती सकें। संवहनी पारगम्यता को संशोधित करने की उम्मीद आनुवंशिक संशोधनों के साथ चूहों के अन्त्रपेशी में microvessels करने के लिए विधि का विस्तार करने का प्रयास क्योंकि माउस अन्त्रपेशी में लंबे समय तक सीधे और unbranched microvessels के अभाव के गंभीर रूप से सीमित थे, लेकिन इसी तरह की आनुवंशिक संशोधनों के साथ चूहों की हाल की उपलब्धता का उपयोग कर CRISPR / Cas9 प्रौद्योगिकी के साथ साथ वर्णित तरीकों से लागू किया जा सकता है, जहां जांच के नए क्षेत्रों को खोलने की उम्मीद है।

Introduction

वाहिका में microperfusion आमतौर पर व्यास में कम से कम 40 माइक्रोन एक रक्त वाहिका में एक micropipette के माध्यम से जाना जाता संरचना का एक कृत्रिम perfusate के प्रवाह को नियंत्रित की स्थापना पर जोर देता। perfused पोत अपने सामान्य ऊतक वातावरण में रहता है और केन्युलेशन के समय के लिए जानवर के खून के साथ भरकर रखा जाता है। सीटू microperfusion में वीडियो इमेजिंग या fluorometric तकनीक की एक सीमा के साथ संयोजन के रूप में प्रयोग किया जाता है जब इन प्रवाह के लिए ड्राइविंग बलों में जाना जाता है और नाड़ी की दीवार के पारगम्यता गुण हो सकता है, जहां की शर्तों के तहत microvessels की दीवारों के पार पानी और घुला हुआ पदार्थ प्रवाह की माप के लिए सक्षम बनाता है सीधे मूल्यांकन किया। इसके अलावा, ऊतकों में microvessel (perfusate और superfusate) के आसपास के तरल पदार्थ की संरचना को नियंत्रित करने से, microvessel पारगम्यता और विनिमय के नियमन ई की एक किस्म को उजागर किया microvessel दीवार बनाने endothelial कोशिकाओं को सक्रिय करने के द्वारा जांच की जा सकती हैxperimental की स्थिति समय के ठीक मापा अवधि (मानव संसाधन के लिए सेकंड) के लिए (एगोनिस्ट, संशोधित छिड़काव की स्थिति, फ्लोरोसेंट संकेतक इंट्रासेल्युलर संरचना और संकेतन को मापने के लिए)। इसके अलावा, बाधा को विनियमित कुंजी सेलुलर आणविक संरचना के Ultrastructural या cytochemical मूल्यांकन पारगम्यता सीधे मापा जाता है, जिसमें एक ही microvessels में जांच की जा सकती है। दृष्टिकोण जिससे सुसंस्कृत endothelial सेल monolayers और बरकरार microvessels में जांच में endothelial बाधा समारोह को संशोधित करने के लिए सेलुलर और आणविक तंत्र की जांच के बीच एक पुल का निर्माण करती है। आगे मूल्यांकन ^1-6 निम्नलिखित समीक्षाएं देखें।

Microperfusion की एक सीमा है कि यह केवल, पतली पारदर्शी होते हैं और एक गिलास micropipette के साथ केन्युलेशन सक्षम करने के लिए पर्याप्त संरचनात्मक अखंडता है कि microvascular बेड में इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रारंभिक जांच अन्त्रपेशी और पतली त्वचा संबंधी पेक्टोरिस मीटर में मेंढक microvessels का इस्तेमाल किया जबकि^7.8 uscle, दूर से स्तनधारी मॉडल में सबसे अधिक इस्तेमाल तैयारी चूहा अन्त्रपेशी ^9-15 है। अधिकांश जांच के 1-4 घंटे की अवधि में अध्ययन किया संवहनी पारगम्यता में तीव्र परिवर्तन पर ध्यान केंद्रित किया है, लेकिन अधिक हाल ही में जांच के लिए एक प्रारंभिक छिड़काव ^12,16 के बाद अलग-अलग जहाजों पर माप के लिए 24-72 घंटा बढ़ा दिया गया है। इस संचार में वर्णित विधि सक्षम होना चाहिए संवहनी पारगम्यता विनियमन ¹⁷ के अध्ययन के लिए अधिक आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहे मॉडल उपलब्ध बनाने के लिए वादा किया है जो हाल ही में विकसित CRISPR प्रौद्योगिकी, इन महत्वपूर्ण नए चूहे मॉडल में अन्त्रपेशी की venular microvessels में लागू किया जाएगा।

विधि perfused पोत के करीब है और पोत के साथ एक छिड़काव micropipette के लिए पंक्ति में स्थिति microtools करने के लिए इस्तेमाल जानवर तैयारी और कम से कम तीन micromanipulators दोनों पकड़ काफी बड़े एक कस्टम बनाया खुर्दबीन मंच के साथ सुसज्जित एक औंधा माइक्रोस्कोप की आवश्यकतालुमेन। उदाहरण के लिए एक XY खुर्दबीन मंच (लगभग 90 × 60 सेमी) के लिए एक कस्टम मंच एक जंग सबूत कोटिंग के साथ एक 1 सेमी मोटी स्टील प्लेट से निर्मित किया जा सकता है। मंच के एक इंजीनियरिंग सूचकांक तालिका या क्षैतिज प्लेन में आंदोलन के लिए Teflon खंभे या गेंद स्थानान्तरण पर सही कोण पर मुहिम शुरू की और समर्थित दो कबूतर पूंछ स्लाइड से जुड़ा हुआ है। एक ठेठ रिग (देखें चित्र 2) संवहनी चिकनी की एकल पोत रक्त प्रवाह और hematocrit, खून भरकर रखा microvessels द्वारा स्थानीय ऑक्सीजन वितरण, विनियमन को मापने के लिए ऐसे लोगों के रूप intravital microcirculation में प्रयोगों की एक श्रृंखला के लिए इस्तेमाल माइक्रोस्कोप और micropositioning उपकरणों के साथ आम में ज्यादा है मांसपेशियों टोन, और पूरे संचलन में इंजेक्शन फ्लोरोसेंट ट्रेसर की स्थानीय microvascular संचय। ^18-26

तकनीक की मूलभूत पहलू microvessel दीवार का एक परिभाषित सतह क्षेत्र (एस) के पार मात्रा प्रवाह (जे _वी) की माप है। पूरा करने के लिएइस के साथ साथ वर्णित संशोधित लैंडिस तकनीक के माध्यम से एक सरल औंधा माइक्रोस्कोप के लिए पर्याप्त है। एक छोटा सा वीडियो कैमरा एक जोड़ा समय आधार के साथ एक वीडियो मॉनीटर पर प्रदर्शित किया जाता है और एक कंप्यूटर पर डिजिटल रूप में या एक वीडियो रिकॉर्डर पर एक डिजिटल या एनालॉग सिग्नल के रूप में या तो दर्ज की, छवि बंदरगाह और वीडियो संकेत पर मुहिम शुरू की है। Microvessel cannulated हो जाने के बाद कैमरे को दिखाई microvessel के हिस्से केन्युलेशन बाधा पहुँचा के बिना एक इकाई के रूप में मंच और manipulators चलती द्वारा बदला जा सकता है।

Transvascular प्रवाह के मापन ^भी इस तरह घुला हुआ पदार्थ पारगम्यता, साइटोप्लास्मिक कैल्शियम या अन्य सेलुलर तंत्र, और confocal इमेजिंग ^6,12,13 के फ्लोरोसेंट अनुपात निगरानी की माप के लिए इस्तेमाल रिसाव के रूप में उपयुक्त फिल्टर के साथ एक परिष्कृत प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग अधिक विस्तृत जांच के साथ जोड़ा जा सकता है ^27। सभी microperfusion दृष्टिकोण की एक प्रमुख लाभ ही पोत पर दोहराया उपायों बनाने की क्षमता है,, इस तरह के हीड्रास्टाटिक और oncotic दबाव, या भड़काऊ शर्तों को पोत प्रतिक्रियाओं में प्रेरित परिवर्तन के रूप में बल ड्राइविंग के नियंत्रित परिवर्तन के तहत। सबसे आम डिजाइन एक दूसरे विंदुक के साथ तो एक आधारभूत पारगम्यता राज्य की स्थापना के लिए पहली बार एक नियंत्रण perfusate और लाल सेल निलंबन के साथ भरा एक micropipette के माध्यम से भरकर रखा पोत के साथ ही पोत पर मापा हाइड्रोलिक चालकता (एल _पी) के एक बनती तुलना है परीक्षण एजेंट के साथ perfusate के लिए कहा। एकाधिक cannulations नियंत्रण पिपेट साथ reperfusion के बाद दोहराया चक्र के साथ संभव हो रहे हैं।

वर्तमान प्रोटोकॉल microvessel दीवार के पार पानी अपशिष्टों रिकॉर्ड और पोत दीवार के एल _पी बरकरार भर में पानी और विलेय के लिए आम मार्ग की पारगम्यता का एक उपयोगी सूचकांक को मापने के लिए चूहा अन्त्रपेशी में एक venular पोत के केन्युलेशन और microperfusion दर्शाता endothelial बाधा। प्रक्रिया संशोधित लैंडिस techniq कहा जाता हैUE क्योंकि ²⁸ संरक्षित है अवरुद्ध है छिड़काव के बाद transvascular द्रव मुद्रा का एक उपाय के रूप में लाल कोशिकाओं के रिश्तेदार आंदोलन का उपयोग करने का मूल लैंडिस सिद्धांत है, लेकिन प्रयोगात्मक शर्तों की सीमा (जैसे, microvessel दीवार के पार हीड्रास्टाटिक और एल्बुमिन oncotic दबाव मतभेद) microperfusion के बाद उपलब्ध uncannulated खून भरकर रखा microvessels ^8,29 की तुलना में कहीं अधिक है।

Protocol

आचार कथन: सभी प्रक्रियाओं की समीक्षा की और संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

Micropipettes, Restrainers, और ब्लॉकर्स 1. प्रारंभिक निर्माण

1. खींच लिया, ट्यूब के बढ़ाकर भाग 1 के बारे में लंबाई में सेमी और दो हिस्सों को कुछ हद तक सममित हैं, तो यह है कि समायोजित एक इलेक्ट्रॉनिक डांड़ी का उपयोग छमाही में कई स्वच्छ borosilicate ग्लास केशिका ट्यूब खींचो। । शंकु चित्रा 1 में आयामों के साथ संगत है सुनिश्चित करें कि micropipettes, restrainers और ब्लॉकर्स के लिए दोनों हिस्सों का प्रयोग करें।
   1. बेवल जल से स्नान 0.5 माइक्रोन घर्षण कागज के साथ एक हवा चालित पीस पहिया ³⁰ का उपयोग micropipettes। यह क्षैतिज से लगभग 30 डिग्री है कि इतनी micropipette धारक के कोण सेट।
   2. अच्छी तरह से धोने और टिप के माध्यम से और शाफ्ट साफ एसीटोन खींचने के लिए सक्शन का उपयोग करके micropipettes सूखी। (Micropipettes का निरीक्षणएक मगरमच्छ क्लिप micropipette धारक और एक ऐपिस लजीला व्यक्ति के साथ लगे 4 × और 40 × उद्देश्यों के साथ एक छोटे से ईमानदार माइक्रोस्कोप का उपयोग चित्रा 1 ए)।
   3. जिसका लंबाई / चौड़ाई का अनुपात 3.1 के बीच और 3.5 और अन्त्रपेशी में कठिन कोलेजन फाइबर घुसना मदद करता है जो एक तेजी से पतला बिंदु के साथ है एक उठाव के साथ के बारे में 50 माइक्रोन लंबे टिप खोलने के साथ चयन micropipettes।
   4. एक धूल से मुक्त बॉक्स में थोड़ा अलग आकार के 15-20 micropipettes स्टोर।
2. 1.1 चरण में तैयार खींच लिया केशिका ट्यूब) का उपयोग restrainers बनाओ। एक कुंद अंत (चित्रा 1 बी) के रूप में एक microflame पास संक्षेप में एक खींच लिया गिलास केशिका ट्यूब पकड़ो। एक धूल से मुक्त बॉक्स में कई स्टोर।
3. 1.1 चरण में तैयार खींच लिया केशिका ट्यूब) का उपयोग microoccluders बनाओ। मोड़ धीरे एक microflame के तहत एक खींच केशिका ट्यूब पकड़ और (एक ट्यूबिंग एडाप्टर, जैसे प्रयोग से।, 23G) ठीक टिप (टिप से लगभग 4 मिमी) शाफ्ट को 120 डिग्री के करीब की एक कोण बनाने के लिए (

2. पशु तैयारी और सर्जरी

1. Pentobarbital सोडियम के साथ पुरुष (350-450 ग्राम) या महिला Sprague-Dawley चूहों (200-300 ग्राम) anesthetize (80-100 मिलीग्राम / किग्रा, सिग्मा Aldrich, P3761) चमड़े के नीचे इंजेक्शन के माध्यम से; intraperitoneal इंजेक्शन का उपयोग नहीं करके अन्त्रपेशी की रक्षा करना।
2. शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं और प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल दौरान जरूरत के रूप में पूरक इंजेक्शन (30 मिग्रा / किग्रा) द्वारा संज्ञाहरण बनाए रखें। पैर की अंगुली चुटकी या कार्निया पलटा द्वारा संज्ञाहरण की गहराई का निर्धारण। प्रयोगात्मक प्रक्रिया के पूरा होने के बाद, pentobarbital जरूरत से ज्यादा या संज्ञाहरण के तहत संतृप्त पोटेशियम क्लोराइड का इंट्रा-हृदय इंजेक्शन के माध्यम से चूहा euthanize।

3. प्रवाह मार्कर के रूप में उपयोग के लिए समाधान और एरिथ्रोसाइट्स तैयार

1. Superfusate और नियंत्रण perfusate समाधान (आमतौर स्तनधारी 10 मिलीग्राम से युक्त घंटी समाधान / एमएल फैटी एसिड के लिए स्तनधारी घंटी समाधान तैयारमुक्त गोजातीय सीरम albumin, बीएसए)।
   1. 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से फिल्टर perfusate micropipette टिप ब्लॉक हो सकता है कि छोटे कणों को दूर करने के लिए; छोटे साफ कंटेनर में फिल्टर।
2. 0.05 मिलीलीटर हेपरिन (1,000 यू / एमएल) युक्त एक छोटे से सिरिंज पर एक 20G सुई में anesthetized चूहे की पूंछ नस से लगभग 0.2 मिलीलीटर रक्त ड्राइंग द्वारा एरिथ्रोसाइट्स को तैयार है और के बारे में 14 एमएल स्तनधारी घंटी समाधान समाधान युक्त एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए स्थानांतरण ।
   1. अपकेंद्रित्र धीरे (7 मिनट के लिए अधिकतम 200 × छ) के बारे में लाल कोशिकाओं पैक करने के लिए। सतह पर तैरनेवाला बंद ड्रा और घंटी समाधान में लाल कोशिकाओं को फिर से रोक देते हैं।
   2. Centrifuging और हटाने के बाद सतह पर तैरनेवाला तीन बार बाद में उपयोग के लिए ट्यूब के नीचे में पैक लाल कोशिकाओं छोड़ दें। इस प्रक्रिया के सामान्य स्तर ³¹ के 0.1% से कम करने के लिए अंतिम perfusates में प्लेटलेट्स कम कर देता है कि ध्यान दें।

4. पशु पर ऊतक की व्यवस्थाट्रे

1. असिरूप प्रक्रिया को नाभि के नीचे से anesthetized चूहे के पेट में दाढ़ी है। बाल अच्छी तरह से ऊतक से बाहर superfusate आकर्षित करने के लिए एक बाती फार्म नहीं करता है, ताकि मुंडा क्षेत्र (सही पक्ष पर रखा चूहे के लिए) सही पक्ष के चारों ओर फैली हुई है कि सुनिश्चित करें। एक गीला धुंध पैड या ऊतक के साथ कटौती बाल निकालें।
   1. एक कुंद दाँतेदार संदंश के साथ त्वचा पकड़ो और एक मजबूत कैंची का उपयोग त्वचा के माध्यम से एक केंद्र-लाइन चीरा (2-3 सेमी लंबी) बनाते हैं। ठीक एक का उपयोग करना (आइरिस) कैंची पेट को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए दाँतेदार संदंश के साथ पेट की दीवार उठाने, लिनिया अल्बा के माध्यम से एक समान चीरा बनाते हैं।
   2. पशु ट्रे पर अपने पक्ष पर पशु के साथ, धीरे घंटी समाधान और कुंद दाँतेदार संदंश में भिगो कपास इत्तला दे दी applicators (लकड़ी की छड़ी) का उपयोग कर उदर गुहा से आंत बाहर खींच। अन्त्रपेशी अन्त्रपेशी छूने से बचने के ख्याल रख रही माइक्रोस्कोप के माध्यम से (pote देखने के लिए स्तंभ पर लिपटी है कि इतनी अच्छी तरह से ऊतक में पेट की व्यवस्थाntially संदंश या कपास के साथ या तो) microvessels को नुकसान पहुँचाए।
      नोट: पशु ट्रे (2A चित्रा) Plexiglas से निर्मित है और एक ऑप्टिकली स्पष्ट स्तंभ, (लगभग 3 मिमी गहरी) (जैसे, पॉलिश क्वार्ट्ज के बारे में 2 सेमी व्यास और 5 मिमी उच्च।) अच्छी तरह से, और एक वार्मिंग पैड एक ऊतक आवश्यकता हो सकती है जानवर के तापमान को बनाए रखने के लिए समायोजित। स्तंभ की मोटाई उद्देश्य के काम दूरी अधिक नहीं होनी चाहिए।
2. अन्त्रपेशी eyepieces के माध्यम से दिखाई दे रहा है तो यह है कि खुर्दबीन मंच पर पशु ट्रे स्थिति।
3. लगातार 35-37 डिग्री सेल्सियस पर रखा स्तनधारी घंटी समाधान के साथ अन्त्रपेशी superfuse करने के लिए एक गुरुत्वाकर्षण खिलाया ड्रिप लाइन स्थिति। जगह में पेट पकड़ नमी बनाए रखने में मदद, और सतह से अतिरिक्त घंटी समाधान बाती धुंध पैड का प्रयोग करें। प्रवाह को समायोजित और एक सुसंगत superfusate मोटाई बनाए रखने के लिए प्रवाह महाप्राण।
4. जो कर रहे हैं, लक्ष्य venular microvessels पहचानेंअभिसरण प्रवाह, सच केशिकाओं के लिए बाहर एक या दो शाखाओं के बहाव unbranched खंडों। एक unbranched पोत मिल (आदर्श, लंबाई में 600 से 1000 माइक्रोन) तेज रक्त प्रवाह और पोत दीवार पर चिपके हुए सफेद कोशिकाओं से मुक्त कर रही है।
5. माइक्रोस्कोप क्षेत्र के केंद्र में परीक्षण microvessel स्थिति और चुने केन्युलेशन स्थल के निकट स्थिति में restrainer चलते हैं।

5. धारक में micropipette और माउंट भरें

1. बस cannulating से पहले, perfusate में लाल कोशिकाओं को निलंबित। एक साफ borosilicate टेस्ट ट्यूब में 0.5 मिलीलीटर perfusate के लिए पैक लाल कोशिकाओं के 7 μl जोड़ें। नोट: 1-3% की Hematocrits इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन लगातार hematocrit लाल कोशिकाओं से जारी किसी भी पदार्थ के अनुरूप perfusate सांद्रता को बढ़ावा मिलेगा।
2. एक 23G ट्यूबिंग अनुकूलक और पीई 50 ट्यूबिंग (5-15 सेमी लंबाई) के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज से फिट है। सिरिंज में perfusate / लाल सेल मिश्रण ड्रा। मिश्रण और ट्यूबिंग से सभी बुलबुले को निष्कासित करने के लिए सिरिंज पलटना औरएडाप्टर। और प्रयोग के शुरू होने से पहले कई सीरिंज के लिए वृद्धि की दक्षता, फिट टयूबिंग के लिए एक धूल मुक्त बॉक्स या प्लास्टिक की थैली में उन्हें रखने के लिए।
3. यह पतला क्षेत्र abuts तक micropipette के बड़े अंत में टयूबिंग से आगे बढ़ कर micropipette भरें। Micropipette टिप को भरने के लिए सिरिंज सवार पर एक सज्जन त्वरित धक्का को लागू करें। नोट: एक छोटे स्ट्रीम या छोटी बूंद पूरा भरने सबूत के नोक पर दिखाई जानी चाहिए।
4. धीरे सवार पर जोर दे micropipette शाफ्ट के व्यापक हिस्से को भरने के लिए है, जबकि ट्यूबिंग वापस ले लें। ध्यान से micropipette शाफ्ट flicking द्वारा व्यापक शाफ्ट में छोटे बुलबुले निकालें। नोट: एक समान प्रक्रिया ³² सचित्र किया गया है।
5. एक पानी नापने का यंत्र के लिए एक सतत द्रव कनेक्शन की अनुमति देता है जो एक ओर बंदरगाह के साथ एक पिपेट धारक में micropipette रखें। सुनिश्चित करें micropipette के बहुत ठीक उन्नति को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल एक हाइड्रोलिक ड्राइव से जुड़ा हुआ है जो धारक, एक मामूली कोण पर है कि (15-25 डिग्री)क्षैतिज करने के लिए micropipette घटना के किनारे पेट या ट्रे को मारा नहीं है कि इतनी।
6. परीक्षण पोत (चित्रा 2) के करीब संरेखण सक्षम करने के लिए एक्स, वाई, जेड और ड्राइव है जो एक जंगम micromanipulator, पर हाइड्रोलिक ड्राइव माउंट।
7. के बारे में 40 CMH ₂ अन्त्रपेशी ऊपर हे दबाव नापने का यंत्र का पानी कॉलम में तरल पदार्थ की ऊंचाई को बदलने के लिए एक सिरिंज या पानी से भरे रबर बल्ब का उपयोग कर micropipette में तरल पदार्थ को लागू हीड्रास्टाटिक दबाव को समायोजित करें।
8. पिपेट भरने के बाद जितनी जल्दी हो सके microvessel Cannulate; उस बारे में 40 मिनट के बाद बहुत कुछ लाल कोशिकाओं पोत में बहेगा तो लाल कोशिकाओं, पिपेट के नीचे बसा।

6. Microcannulation और माईक्रवैस्कुलर दबाव माप

1. माइक्रोस्कोप के तहत भरा micropipette स्थिति से पहले, धीरे पकड़ के लिए ऊतक पर्याप्त ताकत लगाने microvessel निकट ऊतक पर restrainer दबाएँ। खींचनाmesenteric कोलेजन तंतुओं में तनाव पोत के साथ गठबंधन कर रहे हैं तो थोड़ा microvessel के साथ लाइन में ऊतक खींच, पीठ restrainer।
   1. पोत के साथ micropipette संरेखित करें और eyepieces के माध्यम से देखने में यह कम है। चुना केन्युलेशन साइट के बस नदी के ऊपर टिप प्लेस और यह आंशिक रूप से पोत के भीतर प्रवाह भी नुकसान पहुँचा है, ताकि ऊतक पर यह कम है, लेकिन यह रोक देना नहीं है।
2. हाइड्रोलिक ड्राइव का उपयोग पोत लुमेन में धीरे-धीरे विंदुक टिप ड्राइविंग द्वारा पोत cannulate। पोत के निचले पक्ष के माध्यम से पुश करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा।
   नोट: micropipette लुमेन में प्रवेश करती है, perfusate तेजी से लुमेन के बाहर बर्तन में रक्त washes और perfusate स्वतंत्र रूप से नीचे की ओर वाहिकाओं में सामान्य रक्त छिड़काव के कुछ विस्थापित, परीक्षण microvessel पशु के संचलन डिस्टल में बहती है।
3. संकेत के रूप में (रक्त जब तक दबाव नापने का यंत्र का समायोजन करके छिड़काव दबाव कमperfused खंड में वापस ली गई है) जानवर की लाल कोशिकाओं द्वारा; इस लाल कोशिकाओं को धीरे पोत लुमेन में हिलाना और microvessel खंड के बाहर अंत में हीड्रास्टाटिक microvessel दबाव (पी _सी) के उपाय जहां संतुलन दबाव निर्धारित करता है। इस संतुलन दबाव से ऊपर के सभी दबाव पर पोत छिड़काव बनाए रखें।

7. Microocclusion और डेटा का संग्रह

1. वैकल्पिक कदम: टिप दोहराया सूक्ष्म दौरान प्रायोगिक पोत की रक्षा करता है कि ऊतक का जुर्माना पैड जम जाता है कि अब तक किसी भी पोत से अन्त्रपेशी के एक गैर इस्तेमाल किया क्षेत्र में ऊतक में यह प्रेस, पोत को ब्लॉक करने के लिए माइक्रो-occluder उपयोग करने से पहले occlusions।
2. माइक्रोस्कोप क्षेत्र के निचले छोर के पास perfused पोत ऊपर अवरोधक रखें।
3. वीडियो और ऑडियो के साथ निम्नलिखित को रिकॉर्ड।
   1. मौखिक रूप से ब्लॉक साइट के स्थान और आईपीस लजीला व्यक्ति पर देखा के रूप में कम स्क्रीन बढ़त दर्ज करते हैं।
   2. टिप के साथसिर्फ microvessel ऊपर रखा अवरोधक की, पोत में प्रवाह occluded है जब तक धीरे अवरोधक कम करने के लिए micromanipulator के ठीक Z नियंत्रण का उपयोग करें। ऑडियो पर दबाव नापने का यंत्र दबाव (पी _सी) पर ध्यान दें। 3-10 सेकंड के लिए आम तौर पर रोड़ा लागू करें, और उसके बाद मुक्त छिड़काव बहाल करने, जारी। , समय के आधार पर 5-10 माइक्रोन कदम (> एक साइट पर प्रारंभिक ब्लॉक के बाद 5 मिनट), occlusions की संख्या (3-5) में पिपेट टिप की ओर पोत अप ब्लॉक साइट ब्लॉक हटो स्थल पर पोत दीवार के नुकसान को रोकने के लिए ।

डाटा और एल _पी के मापन के 8. विश्लेषण (पानी पारगम्यता)

1. वीडियो प्लेबैक के दौरान, एक मंच सुक्ष्ममापी और छवियों पर जाना जाता है पदों की एक छवि के उपयोग के द्वारा रोड़ा साइट के लिए एक मार्कर लाल कोशिका से प्रारंभिक दूरी (ℓ ₀₎ निर्धारित करते हैं। दर्ज की छवियों के 3-10 सेकंड के दौरान कई फ्रेम में अपनी स्थिति से मार्कर सेल की प्रारंभिक वेग (dℓ / डीटी) निर्धारित करते हैं। रोक रखनामेरा रोड़ा (चित्रा 3) के दौरान लिए गए चित्रों से पोत त्रिज्या (R)।
2. गणना जम्मू _v / s (dℓ / डीटी) × (1 / ℓ ₀₎ × (आर / 2) के रूप में प्रत्येक रोड़ा के लिए। ड्राइविंग दबाव से विभाजित (जे _वी / एस) के रूप में एक निरंतर दबाव में एल _पी की गणना (microvessel दबाव - प्रभावी कोलाइड आसमाटिक दबाव; चर्चा देखें)।

Representative Results

चित्रा 4 चार perfusates साथ क्रमिक cannulated microvessel venular एक चूहे में एल _पी में परिवर्तन के समय के पाठ्यक्रम को मापने से परिणामों से पता चलता है। ³³ एक निरंतर दबाव पर गणना एल _पी की भयावहता microvessel दीवार पारगम्यता में परिवर्तन का एक उपाय के रूप में इस्तेमाल किया गया था, पहले पोत 10 एनएम बीके युक्त एक दूसरे micropipette का उपयोग भड़काऊ एजेंट ब्रैडीकाइनिन (बी) के संपर्क में था जब तब 1% गोजातीय सीरम albumin युक्त एक perfusate के साथ नियंत्रण राज्य में। Bradykinin बाद में 10-15 मिनट पर नियंत्रण मूल्य की ओर लौट गया है कि _पी एल में एक क्षणिक वृद्धि का कारण बना। पोत फिर एक स्थिर आधारभूत फिर से स्थापित करने के लिए 30 मिनट के लिए नियंत्रण perfusate के साथ फिर से भरकर रखा गया था। Microvessel ही बीके की एकाग्रता के साथ ही perfusate में 1 माइक्रोन sphingosine-1-phospate (S1P) के साथ एक चौथा micropipette का उपयोग भरकर रखा गया था, बीके के जवाब काफी तनु था। की डिग्रीबीके और S1P एक ही समय में perfused थे जब क्षीणन S1P बीके करने के लिए जोखिम से पहले 20 मिनट के लिए perfusate अप करने के लिए जोड़ा गया था, जहां अन्य प्रयोगों में मापा जाता है कि इसी तरह हो पाया था। इन परिणामों के एक भी पोत पर एल _पी के कई मापन करने में सक्षम होने की शक्ति का प्रदर्शन है, और इस तरह के एक भड़काऊ एजेंट की उपस्थिति में पोत दीवार को स्थिर करने के S1P के रूप में एक एजेंट की कार्रवाई का समय समय पर करने के लिए हल किया जा सकता है कुछ सेकंड के आदेश। अलग वाहिकाओं में नियंत्रण के अध्ययन बीके प्रतिक्रिया के क्षीणन तीव्रग्राहिता के कारण नहीं था कि दिखाने के लिए S1P के अभाव में एक समान प्रोटोकॉल के साथ किए गए।

कुछ प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए यह एक macromolecule (σ) और एल _पी के लिए घुला हुआ प्रतिबिंब गुणांक दोनों अनुमान लगाने के लिए महत्वपूर्ण है। यह प्रत्येक व्यक्ति के microvessel पर कई दबावों पर जे _वी मापने के द्वारा सबसे अच्छा पूरा किया है। 5 चित्रा एक प्रयोग से पता चलता है कि मैंn जो एल _पी और perfusate में 5% एल्बुमिन के प्रभावी oncotic दबाव दोनों (π _{एल्बुमिन} = 27 CMH 37 डिग्री सेल्सियस पर ₂ ओ) चूहे microvessel आसपास के ऊतकों में कोई एल्बुमिन था जब वहाँ की शर्तों के तहत अनुमान लगाया गया था। इन प्रयोगों जे _वी / एस तीन अलग-अलग दबाव पर मापा गया था। एल _पी जे _वी / एस और दबाव के बीच संबंध की ढलान है, और दबाव धुरी पर अवरोधन पोत दीवार (σΔπ) के पार प्रभावी oncotic दबाव का अंतर है।

व्यक्तिगत microvessels के छिड़काव के लिए चित्रा 1. microtools। (ए) एक beveled टिप के साथ चूहे microvessels के केन्युलेशन के लिए एक micropipette। (बी) केन्युलेशन के स्थल के निकट स्थिर अन्त्रपेशी ऊतक कराने के लिए एक restrainer। (सी) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Microperfusion के लिए 2. intravital रिग चित्रा। (ए) कांच स्तंभ के ऊपर उन्मुख micromanipulators और microtools के साथ पशु ट्रे का अवलोकन। (बी) के बड़े धातु चरण इंजीनियरिंग की मेज और समर्थन बीयरिंग पर मुहिम शुरू की। एक microvessel की microperfusion के लिए स्थिति में microtools साथ (सी) anaesthetized चूहा। (डी) बंद दृश्य एक प्रयोग के दौरान अन्त्रपेशी की। इस figu का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें फिर से।

संशोधित लैंडिस तकनीक का उपयोग कर प्रति इकाई क्षेत्र निस्पंदन दर का आंकड़ा 3. मापन। यह योजनाबद्ध एक micropipette और पोत पर तैनात एक occluding छड़ी के साथ cannulated एक भी microvessel से पता चलता है। सेल प्रक्षेपवक्र रोड़ा बाद 5-10 सेकंड के लिए पीछा किया जा सकता है, ताकि तुरंत microvessel, अवरोधित microvessel के centerline पर यात्रा मार्कर आरबीसी के बीच की दूरी (ℓ ₀₎ और रोड़ा साइट occluding के बाद दर्ज की गई है। प्रारंभिक स्थिति (ℓ ₀₎ और सेल की प्रारंभिक वेग (dℓ / डीटी) मार्कर सेल और रोड़ा की साइट के बीच microvessel दीवार की प्रति इकाई क्षेत्र औसत निस्पंदन दर की गणना करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। microoccluder तब उठाया है, और अतिरिक्त मापन किया जाता है से पहले मुक्त छिड़काव की स्थापना की।कॉम / फ़ाइलें / ftp_upload / 53210 / 53210fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4. प्रतिनिधि डेटा sphingosine-1-फॉस्फेट (S1P) निषेध बहुत तेजी से काम करता है पता चलता है कि bradykinin (बी, 10 एनएम)। Microvessel _पी एल में एक क्षणिक वृद्धि का कारण बना। S1P पहले बीके करने के लिए तीव्र बीके प्रतिक्रिया रिश्तेदार हिचकते दूसरी ब्रैडीकाइनिन (बीके) की परीक्षा के साथ समवर्ती रूप में लागू किया। ये आंकड़े एक परीक्षण एजेंट के लिए जोखिम के समय एक निरोधात्मक प्रतिक्रिया की सक्रियता का कैनेटीक्स मूल्यांकन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है कि प्रदर्शित करता है। विशेष रूप से, S1P बीके जोरदार बीके प्रतिक्रिया हिचकते ही साथ समवर्ती आवेदन किया। S1P 1 माइक्रोन था और बीके एनएम। 10 साल का था यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

_वी / कई दबावों पर दोनों एल _पी और प्रभावी oncotic दबाव में सक्षम बनाता है मापन जम्मू की चित्रा 5. मापा जाएगा। निस्पंदन प्रवाह, जम्मू _v / s, बीएसए के साथ छिड़काव (50 के दौरान विभिन्न microvessel हीड्रास्टाटिक दबाव पर इस पोत में मापा गया था मिलीग्राम मिलीलीटर ^{- 1;} अन्त्रपेशी प्रोटीन से मुक्त घंटी समाधान के साथ स्नान कर रहा था, जबकि π = 27 CMH ₂ ओ)। जम्मू _v / s और दबाव के बीच संबंध की ढलान एल _पी और दबाव धुरी पर अवरोधन पोत दीवार के पार प्रभावी oncotic दबाव अंतर को इंगित करता है। इस प्रयोग में एल.पी. 1.2 × 10 ^-7 (सेमी सेकंड ^-1 CMH ₂ ओ ^-1) था और σΔπ CMH ₂ ओ 24 थी <एक href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53210/53210fig5large.jpg" लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

पोत को स्वतंत्र रूप से भरकर रखा जाता है, जबकि transvascular द्रव आंदोलन होता है हालांकि एल _पी गणना का विवरण।, ऐसी विनिमय यह पोत छिड़काव दर के कम से कम 0.01% आमतौर पर है क्योंकि मुक्त छिड़काव के दौरान मापा जा दूर करने के लिए बहुत छोटा है। छिड़काव क्षणिक microvessel, transvascular प्रवाह occluding द्वारा बंद कर दिया गया है लेकिन, जब (यानी, निस्पंदन) में दिखाया गया shortens के रूप में एक मार्कर लाल सेल और रोड़ा की साइट के बीच तरल पदार्थ के स्तंभ के रूप में लुमेन में मार्कर लाल कोशिकाओं के आंदोलन से मापा जाता है, चित्रा 3। प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल लंबाई में 600 से 1000 मीटर की जरूरत है एक unbranched पोत की जटिलता और लंबाई पर निर्भर करता है।

पोत occluded नहीं है और दबाव नापने का यंत्र दबाव microvessel के माध्यम से प्रवाह गाड़ी चला रहा है मुफ्त के छिड़काव के दौरान कहा कि microvessel दबाव आम तौर पर केवल एक है इसलिए, पिपेट टिप भर में दबाव ड्रॉप बड़ी हैबहाव के दबाव से ऊपर कुछ CMH ₂ 0। इसके विपरीत, एक रोड़ा दौरान पिपेट भर में दबाव ड्रॉप की वजह से तरल पदार्थ धीरे-धीरे पोत दीवार के पार तरल पदार्थ को छानने को बदलने के लिए पोत लुमेन में प्रवेश करने के लिए बहुत छोटा है। इस प्रकार रोड़ा दौरान पोत लुमेन (पी _सी) में हीड्रास्टाटिक दबाव नापने का यंत्र द्वारा उस सेट के बराबर होती है। mesenteric ऊतकों में oncotic दबाव नगण्य है, इसलिए हीड्रास्टाटिक दबाव में जाना जाता है और पोत लुमेन में oncotic दबाव perfusate में है कि सेट के बराबर है जहां तुरंत रोड़ा के बाद, मार्कर लाल कोशिकाओं से transvascular द्रव आंदोलनों मापा जाता है। एल _पी के लगातार माप के साथ, पोत की लंबाई ब्लॉक साइट उन्नत है हर बार खो दिया है। इसके अलावा, लगातार recannulation उपलब्ध पोत की लंबाई कम कर देता है।

पोत दीवार (जे _वी / एस) की प्रति इकाई क्षेत्र transvascular द्रव का प्रवाह दर से अनुमान लगाया गया है कि microv में पानी के स्तंभ के एक मापा लंबाईएक मार्कर लाल सेल और रोड़ा साइट या तो shortens (शुद्ध निस्पंदन) या lengthens (शुद्ध पुनःअवशोषण) के बीच एस्सेल लुमेन। धारणा पोत लुमेन के centerline के साथ आगे बढ़ निष्पक्षता से प्रसन्नचित्त लाल कोशिकाओं सेल (पानी वेग मतलब करने के लिए लाल सेल वेग के अनुपात से आसपास के पानी स्तंभ का मतलब वेग को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल एक 6 माइक्रोन के लिए 1.8 के करीब है किया जा सकता है अवरोधक के प्रति माइक्रोन / सेकंड में एक मार्कर सेल () के वेग वी माइक्रोन / सेकंड रोड़ा के बाद पहली 2-5 सेकंड से अधिक है, और अगर एक 30 मीटर व्यास के बर्तन में लाल सेल)। ^8,14 इस प्रकार पोत त्रिज्या है आर, कि लाल सेल और रोड़ा (जे _वी) की साइट के बीच microvessel दीवार के पार फ़िल्टर्ड तरल पदार्थ की मात्रा microvessel संभालने ³ / सेकंड माइक्रोन πr ² वी बेलनाकार है। ℓ मार्कर सेल के बीच प्रारंभिक दूरी पर है जहां आगे कि मार्कर सेल और रोड़ा साइट के बीच एक बेलनाकार microvessel (एस) के क्षेत्र, 2πrℓ हैऔर रोड़ा साइट। इस प्रकार पानी नापने का यंत्र वीआर / (2ℓ) द्वारा निर्धारित दबाव में इकाई क्षेत्र (जे _वी / एस) प्रति औसत प्रारंभिक transvascular प्रवाह।

perfusate की oncotic दबाव microvessel दबाव (आमतौर पर 3.6 CMH ₂ हे, 10 मिलीग्राम / एमएल और एक केशिका की एकाग्रता में गोजातीय सीरम albumin की oncotic दबाव के सापेक्ष कम निर्धारित किया गया है, तो पोत एल _पी का सरलतम अनुमान किया जाता है दबाव अधिक से अधिक से अधिक 30 CMH ₂ ओ)। एल _पी के रूप में गणना की जाती है (जे _वी / एस) / (पी _सी -3) सेमी / सेक / सेमी एच ₂ ओ नियंत्रण राज्य में एल्बुमिन प्रतिबिंब गुणांक (σ _{एल्बुमिन)} 0.9 के करीब है। 1 मिनट के आदेश के एक समय के संकल्प के साथ _पी एल में इस दृष्टिकोण के तेजी से बदलाव के साथ / एस चित्रा 4 में प्रतिनिधि परिणाम के रूप में दिखाया लगातार दबाव में। उपरोक्त दृष्टिकोण आईजी जम्मू _वी के लगातार उपायों के बीच मुक्त प्रवाह की स्थापना से मापा जा सकता हैप्रतिबिंब गुणांक से नीचे 0.5 गिर जाता है जब CMH ₂ हे कम से कम 1 पर गिर जो एल्बुमिन की oncotic दबाव में छोटे परिवर्तन nores, लेकिन पी _सी ओ CMH ₂ से अधिक 30 है जब एल _पी के अनुमान में त्रुटि कम से कम 5% रहता है ।

दोनों एल _पी और प्रतिबिंब गुणांक का सही माप आवश्यक है, जब जम्मू _v / s परीक्षण macromolecule की उम्मीद प्रभावी oncotic दबाव से नीचे microvessel दबावों की एक श्रृंखला पर मापा जाता है। दबाव धुरी पर जम्मू _v / s और दबाव उपायों एल _पी और अवरोधन के बीच संबंध की ढलान शुद्ध प्रवाह शून्य उपायों σπ (चित्रा 5) है। जेवी रैखिक दबाव से संबंधित है कि प्रदर्शन oncotic दबाव अंतर हीड्रास्टाटिक प्रेस करने के सापेक्ष कम है जब भी ऊपर वर्णित सरल प्रोटोकॉल का उपयोग एकल दबाव माप का उपयोग करने का एक महत्वपूर्ण मान्यता (चित्रा 4) हैUre।

त्रुटि के संभावित स्रोतों। सटीक माप समझौता है कि कई समस्याएं हैं। ठीक से कारण transvascular विनिमय करने के लिए है कि तेजी से रोड़ा साइट की ओर द्रव रोड़ा साइट अतीत रिसाव, और मार्कर कोशिकाओं के आंदोलन में रोड़ा साइट परिणाम पर पोत दीवार के लिए पोत या क्षति रोक देना विफलता। मार्कर कोशिकाओं के सामान्य रोड़ा साइट की ओर धीरे धीरे कदम है, लेकिन यह तक पहुँच नहीं है जबकि मार्कर कोशिकाओं occluder के लिए सभी तरह ट्रैक हैं, तो एक रिसाव संकेत दिया है। दूसरी ओर, विफलता केन्युलेशन स्थल पर microvessel लुमेन में पिपेट सील करने के लिए जम्मू _v / s के मूल्यवान समझना में परिणाम है। Superfusate करने के लिए या केन्युलेशन साइट के अपस्ट्रीम पोत लुमेन के लिए पिपेट से तरल पदार्थ लीक विंदुक टिप भर में एक महत्वपूर्ण दबाव ड्रॉप का कारण बनता है। इस तरह की एक रिसाव का पता चला है जब नीचे की ओर पोत लू में उन लोगों की तुलना में एक उच्च वेग में micropipette टिप प्रवाह में कोशिकाओंअवरोधित पोत का आदमी। Micropipette की सावधानी से repositioning आमतौर पर इस तरह के एक रिसाव जवानों। पोत दीवार के एल _पी, एक समान नहीं है आमतौर पर स्थानीयकृत क्षति या सूजन के एक या एक से अधिक साइटों के साथ हो रही है, तो एक अलग मुद्दा उठता है। सबसे transvascular प्रवाह ध्यान केंद्रित किया है, तो मार्कर कोशिकाओं साइट के लिए ट्रैक। रेड सेल आंदोलन अभी भी transvascular प्रवाह के उपाय, लेकिन उपाय जम्मू _v / s परीक्षण खंड के भीतर दीवार क्षेत्र के अधिकांश के प्रतिनिधि नहीं है।

मौजूदा तरीकों के संबंध में विधि का महत्व। दो सबसे अधिक इस्तेमाल किया तरीकों endothelial बाधा पारगम्यता और transvascular विनिमय के विनियमन की जांच करने के लिए कर रहे हैं (1) में इन विट्रो सुसंस्कृत endothelial सेल monolayers और दरियाफ्त संचय (2) के माप में भर में विदेशी मुद्रा का माप दरियाफ्त के बाद एक ऊतक का नमूना पूरे जानवर में नसों इंजेक्ट किया जाता है। सुसंस्कृत endothelial सेल monolayers में प्रयोगों च कर रहे हैंसेलुलर कार्यों में अधिक सीधे संशोधित किया जा सकता है और endothelial कोशिकाओं में आणविक घटनाओं का विस्तृत मूल्यांकन के लिए उपलब्ध पर्याप्त सेलुलर सामग्री है, क्योंकि वहाँ avored। हालांकि सबसे संस्कृति की शर्तों के तहत endothelial कोशिकाओं आमतौर पर इन विवो में संवहनी पारगम्यता की बाधा प्रतिनिधि फार्म नहीं है। ऊपर वर्णित संशोधित लैंडिस तकनीक बरकरार venular microvessels में endothelial बाधा समारोह के नियमन की जांच करने के लिए एक मजबूत और विश्वसनीय तकनीक होने के लिए प्रदर्शन किया गया है। एक अनुभवी अन्वेषक के हाथों में सेल संस्कृति में इस्तेमाल किया तरीकों में से कुछ (जैसे, सेलुलर घटकों की इमेजिंग, संकेत दे रास्ते के संशोधन) लागू किया जा सकता है, जहां नियंत्रण और परीक्षण परिस्थितियों में पारगम्यता की माप बनती। बरकरार microvessels में प्रयोगों के महत्व को व्यक्तिगत रूप से भरकर रखा microve में बाधा पारगम्यता को नियंत्रित करने वाले तंत्र के बीच महत्वपूर्ण अंतर दिखा कर प्रदर्शन किया गया हैssels और उन अक्सर सुसंस्कृत endothelial monolayers में वर्णित है। उदाहरण वंचित करने के लिए प्रतिक्रियाओं, थ्रोम्बिन जोखिम, और भड़काऊ खाई गठन ^2-6,9,16 सिकुड़ा तंत्र के योगदान में शामिल हैं। एक अक्षुण्ण संवहनी बिस्तर में दरियाफ्त संचय की माप के साथ या में वृद्धि के बिना अधिक सामान्य शारीरिक समारोह लेकिन दरियाफ्त संचय में वृद्धि हुई छिड़काव (विनिमय के लिए वृद्धि की सतह क्षेत्र) के परिणाम के रूप में वृद्धि हो सकती है क्योंकि समझौता कर रहे हैं संवहनी पारगम्यता में वास्तविक परिवर्तन का सीधा जांच को बरकरार रखता है दीवार की पारगम्यता। वाहिकाप्रसरण perfused जहाजों की संख्या बढ़ जाती है और इस तरह कुल घुला हुआ संचय अकेले ³⁴ संवहनी पारगम्यता में वृद्धि करने के लिए कि वजह से अधिक होता है जब इस प्रकार एक पारगम्यता वृद्धि की हद को जरुरत से ज्यादा हो सकती है।

भविष्य अनुप्रयोगों। विकल्पों की श्रेणी भारतीयों की पारगम्यता के रूप में एक ही परिस्थितियों में सेलुलर संरचना और समारोह को संशोधित करने के लिएmicroperfusion वृद्धि की संभावना है के दौरान vidual वाहिकाओं सीधे मापा जाता है। इसके अलावा यह आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहा अन्त्रपेशी में तरीकों के आवेदन आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के लिए ही अस्तित्व में है कि एक दीर्घकालिक समस्या का समाधान हो सकता है कि उम्मीद है। आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों उपलब्ध हो गया, जब विशेष रूप से, यह microperfusion उनकी mesenteric वाहिकाओं में microvessels जांच करने के लिए बढ़ाया जा सकता है कि उम्मीद थी। कुछ microperfusion प्रयोगों माउस अन्त्रपेशी ³⁵ की microvessels में पूरा किया गया है, चूहों आम तौर पर चूहों की तुलना में उनके mesenteric ऊतकों में कम microvessels है, और करने के लिए अधिक उपयुक्त लंबे समय तक (> 500 माइक्रोन) सीधे जहाजों विरोध के रूप में इन जहाजों, अक्सर छोटी और अत्यधिक branched हैं कि चूहों में पाया जा सकता है। आनुवंशिक रूप से चूहों में इस तरह के मीलों ³⁴ या तकनीकी रूप से मांग की है, लेकिन और अधिक विश्वसनीय दरियाफ्त प्रयोगों जो उपाय के रूप में assays पर भरोसा किया है में इस प्रकार के प्रयोगों transvascular विनिमय के मॉडुलन जांच करने के लिएनाड़ी और radiolabelled परीक्षण जांच ³⁶ के फ्लोरोसेंट की एक्स्ट्रावस्कुलर संचय दोनों में परिवर्तन।

विधि का संशोधन। ऊपर प्रोटोकॉल में, perfusate संरचना में परिवर्तन micropipettes के परिवर्तन की आवश्यकता है। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण एक refilling के उपकरण का उपयोग कर बगल में micropipette फिर से भरना है। विस्तार ³⁷ में वर्णित के रूप में इस प्रक्रिया को पूरा किया गया है। सीमा पिपेट प्रतिस्थापन के द्वारा प्राप्त के रूप में पिपेट में perfusate की संरचना बदलने के लिए समय के रूप में तेजी से नहीं है, लेकिन यह समय की विस्तारित अवधि के लिए एक microvessel छिड़कना के लिए आवश्यक है, तो प्रक्रिया विशेष रूप से उपयोगी है।

पारगम्यता गुणांकों को मापने के लिए बढ़ाया जा सकता है दरवाजा खटखटाया ही microperfusion fluorescently घुला हुआ ^31,38-40 लेबल करने के लिए। इस मामले में एक बैरल micropipette पिपेट ⁴¹ एक डबल बैरल (थीटा) द्वारा बदल दिया है और पोत भरकर रखा जाता हैबारी-बारी से परीक्षण फ्लोरोसेंट घुला हुआ पदार्थ के साथ सामग्री लुमेन के लिए ऊतक संचय रिश्तेदार को मापने के लिए, और फ्लोरोसेंट घुला हुआ पदार्थ के बिना ही perfusate ऊतक स्पष्ट और घुला हुआ संचय के दोहराया माप की अनुमति है। Transvascular पानी बहता की माप fluorescently लेबल परीक्षण विलेय का उपयोग कर घुला हुआ पदार्थ पारगम्यता गुणांक के मापन के साथ जोड़ा जा करने के लिए कर रहे हैं, इंट्रासेल्युलर रचना, या सेलुलर घटकों के confocal इमेजिंग के फ्लोरोसेंट संकेतक, एक और अधिक परिष्कृत कंप्यूटर नियंत्रित प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी की आवश्यकता है। इन जांच आमतौर पर उच्च बढ़ाई और बहुत कम काम दूरी के साथ लेंस की आवश्यकता है, अन्त्रपेशी धारण करने के लिए इस्तेमाल किया क्वार्ट्ज स्तंभ ऊतक अच्छी तरह पर माइक्रोस्कोप ट्रे के भीतर एक Plexiglas समर्थन से चिपके एक गिलास को कवर पर्ची की जगह है। 3-डी प्रिंटर की वृद्धि की उपलब्धता, बड़ा diamete की स्थिति के लिए आवश्यक संकीर्ण सहिष्णुता को पूरा जो कस्टम ट्रे, उच्च परिशुद्धता के निर्माण की अनुमति देगाचयनित microvessels करने के लिए कम दूरी काम रिश्तेदार के साथ आर लेंस।

अन्त्रपेशी में प्रयोग करने योग्य microvessels की उपलब्धता आयु, लिंग, और तनाव के साथ बदलता रहता है। इसलिए, चूहे के तनाव और विशिष्ट सवालों पर निर्भर करेगा पुरुष या महिला के उपयोग के विकल्पों को संबोधित किया जा रहा है। हमारे हाल के अध्ययनों से कई के लिए हम वे आम तौर पर उपलब्ध लंबे, सीधे mesenteric microvessels है लगता है, जो समय पर उम्र के बारे में 3-4 महीने में उपयोग करने से पहले कम से कम एक सप्ताह हमारे जानवरों की सुविधा में प्रयोग किया जाता है, जो पुरुष Sprague-Dawley चूहों का इस्तेमाल किया है। इसके विपरीत, हमारे सहयोगियों को सफलतापूर्वक 2-3 महीने ¹³ साल की उम्र की महिला Sprague-Dawley चूहों का इस्तेमाल किया है।

लाल कोशिकाओं की भूमिका। जैसा कि ऊपर वर्णित लाल कोशिकाओं की प्राथमिक भूमिका सेल microvessels occluded किए जाने के बाद पानी की निष्पक्षता से प्रसन्नचित्त संकेतक बहती है, के रूप में अक्रिय काम किया संभालने पानी आंदोलन transvascular ट्रैक करने के लिए किया गया था। इस मौलिक भूमिका के अलावा, यहअब लाल कोशिकाओं वर्तमान ^31,42,43 में एल्बुमिन जब perfusate को S1P की आपूर्ति से बाधा की स्थिरता के लिए योगदान है कि मान्यता प्राप्त है। इन टिप्पणियों के कई महत्वपूर्ण निहितार्थ हैं। लाल कोशिकाओं का या वैकल्पिक अक्रिय प्रवाह मार्कर के उपयोग के साथ अभाव में आधारभूत पारगम्यता कम स्थिर हो जाने की संभावना है। यह S1P की माप microperfusion प्रयोगों में इस्तेमाल सभी perfusates में किया जाना चाहिए कि सिफारिश की है।

Acknowledgments

इस काम के स्वास्थ्य अनुदान HL44485 और HL28607 के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MICROSCOPE, TABLE AND STAGE
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Olympus	CK-40	try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Leica	DMIL	try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
narrow diameter, long working distance objective: example	Nikon	Nikon E Plan 10×/0.25 LWD
stage platform--1/2 inch or 1 cm sheet steel	welding shop		this should be heavy to reduce vibration
Unislide x-y table: dove tail slides	Velmex	AXY4006W1
VIDEO
CCD video camera: example	Pulnix	TM-7CN (no longer available)	no color needed
video capture system with audio--generic
video playback system (completely still frame, single frame motion)
small microphone
MICROMANIPULATORS, HOLDERS
micromanipulator, XYZ (3)	Prior/Stoelting (no longer available)		look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning
hydraulic probe drive, one way	FHC	50-12-1C	need to buy either manual drive or electronic drive
manual drum drive	FHC	50-12-9-02
or hydraulic drive, 3 way	Siskiyou Corporation	MX610 (1-way) or MX630 (3-way)	great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years
connectors/rods/holders	Siskiyou Corporation	MXC-2.5, MXB etc.
pin vise	Starrett	162C	to hold restrainer
pipette holder	World Prescision Instruments	MPH3
water manometer ~120 cm
MICROSCOPE TRAY
clear Plexiglas for microscope tray for animal
3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall	Quartz Scientific Inc.	custom	(or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective
Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)
medical adhesive for tissue well	NuSil	MED-1037
All-purpose silicone rubber heat mat, 5" L x 2" W	Cole Parmer	EW-03125-20	heater for microscope tray--needs cord and controller--240V version available
Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC	Cole Parmer	EW-03122-75
STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out	Cole Parmer	EW-01575-00
PIPET MANUFACTURE
vertical pipette puller	Sutter Instrument Company	P-30 with nichrome filament
1.5 mm OD thin wall capillary tubing	Sutter Instrument Company	B150-110-10
pipette grinder air stone and dissection microscope--see reference in text			or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments
RX Honing Machine, System II	RX Honing Machine Corporation	MAC-10700 Rx System II Machine	alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle
with ceramic sharpening disc	RX Honing Machine Corporation		use "as is" or attach lapping film
lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um	3M	part no. 051144 80827	268X Imperial lapping film sheets with adhesive back--can be purchased from Amazon

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