Microperfusion Technique å etterforske Regulering av microvessel Permeabilitet i Rat mesenterium

Abstract

Eksperimenter for å måle permeabilitet egenskaper individuelt perfuserte microvessels gi en bro mellom etterforskning av molekylære og cellulære mekanismene som regulerer vaskulær permeabilitet i dyrkede endotelceller cellemonolag og funksjonelle utvekslings egenskapene til hele mikrovaskulære senger. En fremgangsmåte for å cannulate og perfuse venular microvessels av rotte mesenteriet og måle den hydrauliske ledningsevnen til microvessel vegg er beskrevet. De viktigste utstyret som trengs inkluderer en intra mikroskop med en stor modifisert scene som støtter micromanipulators å plassere tre forskjellige Mikro: (1) en skrå glass mikropipette til cannulate og perfuse den microvessel; (2) en glassmikrosperreinnretningen for å blokkere forbigående perfusjon og muliggjøre måling av transvascular vannstrømmen bevegelse ved et målt hydrostatisk trykk, og (3) en butt glasstav for å stabilisere den mesenteriske vev på stedet av kanylering. Den modifiserte Landis mikro-okklusjon technique benytter røde celler suspendert i kunstig perfusatet som markører for transvascular fluidbevegelse, og også gjør det mulig gjentatte målinger av disse strømmene som forsøksbetingelsene endres, og hydrostatiske og kolloid osmotisk trykkforskjell på tvers av mikrokar er nøye kontrollert. Målinger av hydraulisk ledningsevne først ved hjelp av en kontroll perfusatet, deretter etter re-kanylering av samme microvessel med test perfusates muliggjør sammenkoblet sammenligninger av microvessel responsen under disse godt kontrollerte forhold. Forsøk på å utvide metoden til mikrokar i mesenteriet av mus med genetiske modifikasjoner antas å modifisere vaskulær permeabilitet var sterkt begrenset på grunn av fraværet av lange, rette og forgrenede mikrokar i mus mesenteriet, men den siste tilgjengeligheten av rotter med tilsvarende genetiske modifikasjoner ved hjelp den CRISPR / Cas9 teknologi forventes å åpne nye områder av etterforskningen hvor metodene som er beskrevet her kan brukes.

Introduction

Microperfusion i vaskulaturen omfatter å opprette kontrollert strøm av en kunstig perfusat av kjent sammensetning ved hjelp av en mikropipette i et blodkar vanligvis mindre enn 40 mikrometer i diameter. Den perfundert skipet oppholder seg innenfor sin normale vev miljø og er dynket med dyrets blod opp til tidspunktet for kanylering. Når den brukes sammen med en rekke videobilled eller fluorometriske metoder, in situ microperfusion muliggjør måling av vann og oppløste strømmer på tvers av veggene i mikrokar under betingelser hvor drivkreftene for disse strømmer er kjent og permeabilitetsegenskaper i den vaskulære veggen kan bli direkte evaluert. Videre, ved å kontrollere sammensetningen av væsken som omgir microvessel i vevet (perfusatet og superfusate), regulering av microvessel permeabilitet og utveksling kan bli undersøkt ved å aktivere endotelcellene som danner microvessel veggen å bli utsatt for en rekke experimental forhold (agonister, modifiserte perfusjon forhold, fluorescerende indikatorer for å måle intracellulær sammensetning og signalering) for nøyaktig målt perioder (sek til hr). Dessuten kan ultra eller cytokjemiske evalueringer av viktige cellulære molekylære strukturer som regulerer barrieren skal undersøkes i de samme microvessels hvor permeabiliteten er direkte måles. Tilnærmingen dermed danner en bro mellom etterforskning av de cellulære og molekylære mekanismer for å endre endothelial barrierefunksjon i dyrkede endotelceller cellemonolag og etterforskning i intakte microvessels. Se følgende anmeldelser for videre evaluering ^1-6.

En begrensning av microperfusion er at den bare kan brukes i mikrovaskulære senger som er tynn, transparent og har tilstrekkelig strukturell integritet til å muliggjøre kanylering med et glass mikropipette. Mens tidlige undersøkelser brukes frosk microvessels i mesenteriet og tynn hud pectoris muscle ^7,8, den klart mest brukte preparatet i pattedyr modeller er rotte mesenterium ^9-15. De fleste undersøkelser har fokusert på akutte endringer i vaskulær permeabilitet studert over perioder på 1-4 timer, men nyere undersøkelser har blitt utvidet til målinger på enkelte skip av 24-72 timer etter en innledende perfusjon ^12,16. Den nylig utviklet CRISPR teknologi, som lover å gjøre mer genmodifiserte rottemodeller tilgjengelig for å studere regulering av vaskulær permeabilitet ¹⁷ bør gjøre det mulig metodene beskrevet i denne kommunikasjonen som skal anvendes i venular microvessels av mesenteriet i disse viktige nye rottemodeller.

Metoden krever et invertert mikroskop utstyrt med en tilpasset bygget objektbord stor nok til å holde både dyr preparatet og minst tre micromanipulators anvendes for å posisjonsMikro nær perfusert fartøyet og for å justere en perfusjon mikropipette med fartøyetlumen. For eksempel en tilpasset plattform for et xy mikroskop scenen (ca 90 × 60 cm) kan fremstilles av en 1 cm tykk stålplate med en rust belegg. Scenen er festet til en ingeniør indeks tabell eller to due-tail slides montert i rett vinkel og støttes på Teflon søyler eller ball overføringer for bevegelse i horisontalplanet. En typisk rigg (se figur 2) har mye til felles med mikroskop og mikroposisjonering utstyr som brukes for en rekke intravital mikrosirkulasjon eksperimenter slik som de for å måle ett fartøy blodstrøm og hematokrit, lokal oksygentilførsel ved blod perfundert mikrokar, regulering av vaskulær glatt muskeltonus, og den lokale mikrovaskulær akkumulering av fluorescerende tracere injiseres i hele omløp. ^18-26

Den grunnleggende trekk ved den teknikk som er måling av volumstrømmen (J _v) over et definert overflateareal (S) av microvessel veggen. Å oppnådette via den modifiserte Landis teknikk som er beskrevet heri en enkel invertert mikroskop er tilstrekkelig. En liten video kameraet er montert på bildet port og videosignalet, med en ekstra gang base, vises på en videoskjerm og registreres enten i digital form på en datamaskin eller som en digital eller analog signal på en videoopptaker. Når microvessel kanyleres den del av microvessel synlig for kameraet, kan endres ved å bevege scenen og manipulatorer som en enhet uten å forstyrre kanylering.

Måling av transvascular strømmer kan også kombineres med mer detaljerte undersøkelser ved hjelp av en sofistikert fluorescensmikroskop med passende filtre som rigger som brukes for måling av oppløst stoff permeabilitet, fluorescerende forholdet overvåking av cytoplasmisk kalsium eller andre cellulære mekanismer, og konfokalt avbildnings ^{6,12,13, 27.} En viktig fordel med alle microperfusion tilnærminger er evnen til å gjøre gjentatte tiltak, på samme fartøyUnder kontrollert endring av drivkraften som hydrostatiske og kolloidosmotiske press, eller indusert endring i fartøy svar på betennelsestilstander. Den mest vanlige utforming er en sammenkoblet sammenligning av målt hydraulisk ledningsevne (L _p) på samme fartøy med fartøyet første perfuseres via en mikropipette fylt med en kontroll perfusatet og den røde cellesuspensjonen for å etablere en basislinje permeabilitet tilstand, og deretter med en andre pipette med testmidlet tilsatt til perfusatet. Flere cannulations er mulig med syklusen gjentas etter reperfusjon med kontroll pipette.

Den foreliggende protokoll demonstrerer kanylering og microperfusion av en venular fartøy i rotte mesenteriet til å ta opp vann flukser på tvers av microvessel veggen og måle L _{p av} karveggen, en nyttig indeks av permeabiliteten til felles bane for vann og oppløste stoffer på tvers av intakt endothelial barriere. Fremgangsmåten blir kalt den modifiserte Landis technique fordi den opprinnelige Landis prinsippet om å bruke den relative bevegelse av røde blodceller som et mål på transvascular fluid utveksling etter perfusjon blokkert er bevart ^28, men omfanget av eksperimentelle betingelser (for eksempel, hydrostatiske og albumin kolloidosmotiske trykkforskjeller på tvers av microvessel veggen) tilgjengelig etter microperfusion er langt større enn i uncannulated blod perfusert microvessels ^8,29.

Protocol

Etikk Uttalelse: Alle prosedyrer ble gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité.

1. Innledende Fabrikasjon av Mikropipetter, Restrainers, og stopper

1. Trekk flere rene borsilikatglass kapillarrør i halvparten ved hjelp av en elektronisk avtrekker justeres slik at, når trukket, er det strukkede parti av røret omtrent 1 cm i lengde, og de to halvdelene er noe symmetrisk. Sørg for at taper er i samsvar med målene i figur 1. Bruk begge omganger for Mikropipetter, restrainers og blokkere.
   1. Bevel de mikropipetter ved hjelp av en luftdrevet slipeskiven ^{30 med} 0,5 mikrometer slipepapir badet med vann. Still vinkelen på mikropipette holderen slik at det er ca 30 grader fra horisontalen.
   2. Vask og tørk mikropipetter ved hjelp av suge å trekke ren aceton gjennom tuppen og opp skaftet. Inspiser mikropipetter (Figur 1A) med en liten oppreist mikroskop med 4 × og 40 × målene som er utstyrt med en alligator klipp mikropipette holder og et okular retikkel.
   3. Velg mikropipetter med tips åpning ca 50 mikrometer lang med en skråkant hvis lengde / bredde-forholdet er mellom 3,1 og 3,5, og med et kraftig konisk punkt som hjelper trenge inn i tøffe kollagen fibrene i mesenterium.
   4. Lagre 15-20 mikropipetter av litt varierende størrelse i et støvfritt boks.
2. Gjør restrainers bruker trukket kapillarrørene utarbeidet i trinn 1.1). Holder et trukket glass kapillarrør kort nær en MICROFLAM for å danne en butt ende (figur 1B). Lagre flere i et støvfritt boks.
3. Gjør microoccluders bruker trukket kapillarrørene utarbeidet i trinn 1.1). Hold en trukket kapillarrør under en MICROFLAM og forsiktig bøye (ved hjelp av en slangeadapter, f.eks., 23G) den fine spiss (omtrent 4 mm fra spissen) som danner en vinkel på nær 120 grader i forhold til akselen (

2. Animal Forberedelse og kirurgi

1. Bedøve hann (350-450 g) eller hunnrotter Sprague-Dawley (200-300 g) med natrium-pentobarbital (80 til 100 mg / kg, Sigma-Aldrich, P3761) via subkutan injeksjon; beskytte mesenterium ved å ikke bruke intraperitoneal injeksjon.
2. Gjennom kirurgiske prosedyrer og eksperimentelle protokoller, opprettholde anestesi ved supplerende injeksjoner (30 mg / kg) etter behov. Bestem anestesidybden ved tå klype eller hornhinnen refleks. Etter fullføring av den eksperimentelle prosedyren, avlive rotte via pentobarbital overdose eller intra-kardial injeksjon av mettet kaliumklorid under anestesi.

3. Forbered Solutions og Erytrocytter for bruk som Flow Markers

1. Forbered pattedyr Ringers oppløsning for superfusate og kontroll perfusatet oppløsning (typisk pattedyr Ringers oppløsning inneholdende 10 mg / ml fettsyrebovint serumalbumin, BSA).
   1. Filter perfusatet gjennom 0,2 mikrometer sprøytefilter for å fjerne små partikler som kan blokkere mikropipette tips; filtrere i liten ren beholder.
2. Forbered erytrocytter ved å tegne 0,2 ml blod fra halevenen til en bedøvet rotte i en 20G nål på en liten sprøyte inneholdende 0,05 ml heparin (1000 U / ml) og overfør til et 15 ml sentrifugerør inneholdende ca. 14 ml pattedyr Ringers løsning oppløsning .
   1. Sentrifuger til forsiktig pakke røde celler (ca max 200 × g for 7 min). Tegn av supernatant og re-suspen de røde blodcellene i Ringers løsning.
   2. Etter sentrifugering og supernatanten fjernet tre ganger gitt de pakkede røde celler i bunnen av røret for senere bruk. Legg merke til at denne fremgangsmåten reduserer blodplater i de endelige perfusates til mindre enn 0,1% av normale nivåer ^31.

4. Ordne Tissue på AnimalTray

1. Barbere magen av bedøvet rotte nedenfra navlen til xiphoid prosessen. Sørge for at det barberte området strekker seg rundt den høyre side (på rotte plassert på høyre side), slik at håret ikke danner en veke for å trekke superfusate ut av vevet brønnen. Fjern opp hår med en fuktet kompress eller vev.
   1. Hold huden med en stump taggete tang og foreta en senterlinje snitt (2-3 cm lang) gjennom huden ved hjelp av en solid saks. Ved hjelp av en fin (iris) saks lage en lignende snitt gjennom linea alba, løfte bukveggen med taggete tang for å unngå å skade tarmen.
   2. Med dyret på sin side på dyret skuffen, trekk forsiktig ut tarmen fra bukhulen ved hjelp av bomull-tipped applikatorer (tre stick) dynket i Ringers løsning og sløve taggete tang. Ordne gut i vevet godt slik at mesenterium er drapert over pilar for visning gjennom mikroskopet ta vare å unngå å berøre mesenterium (potentially skade microvessels) med enten tang eller bomull.
      Merk: Dyret skuffen (figur 2A) kan være konstruert av plexiglass og krever en vev brønn (ca. 3 mm dyp), en optisk klar søyle (for eksempel polert kvarts ca 2 cm diameter og 5 mm høyde.), Og en varmepute justert for å opprettholde dyrets temperatur. Tykkelsen på søyle må ikke overstige arbeidsavstanden på objektivet.
2. Plasser dyret skuffen på mikroskopet scenen slik at mesenterium er synlig gjennom okularene.
3. Plasser en gravitasjonsmatet drypp linje til kontinuerlig superfuse mesenterium med pattedyr Ringers løsning holdt ved 35-37 ° C. Bruk gasbind pads for å holde tarmen på plass, bidra til å beholde fuktighet, og transportere overflødig Ringer løsning av overflaten. Justere strømningen og aspireres avløpet for å opprettholde en konsistent superfusate tykkelse.
4. Identifisere målet venular microvessels, som eruforgrenede segmenter nedstrøms av konvergent strømning, en eller to grener distale til sann kapillærer. Finne en uforgrenet beholder (helst 600 til 1000 um i lengde) med rask blodstrøm og fri for hvite celler stikker på karveggen.
5. Plasser prøven microvessel i midten av mikroskopet feltet og flytte den rainer i stilling nær det valgte kanylering området.

5. Fyll Mikropipette og Mount i Holder

1. Like før kanylerør, suspendere de røde cellene i perfusatet. Legg 7 mL av pakkede røde blodceller til 0,5 ml perfusatet i en ren borsilikat prøverør. Merk: Hematocrits på 1-3% kan anvendes, men konsekvent hematokrit vil føre til konsistente perfusatkonsentrasjonene av eventuelle stoffer fra de røde cellene.
2. Monter en 1 ml sprøyte med en 23G slange adapter og PE 50 rør (5-15 cm lengde). Tegn perfusatet / rød celleblanding inn i sprøyten. Vend sprøyten å mikse og utvise alle bobler fra slanger ogadapter. For økt effektivitet, passer rør til flere sprøyter før forsøket starter og holde dem på et støvfritt boks eller plastpose.
3. Fyll mikropipette ved å fremme slangen inn i den store enden av mikropipette inntil det ligger an mot det avsmalnende område. Påfør en mild raskt trykk på sprøytestempelet for å fylle mikropipette spissen. Merk: En liten bekk eller dråpe skal være synlig på tuppen å bevis fullstendig fylling.
4. Trekk slangen mens du forsiktig presser på stempelet for å fylle den bredere delen av mikropipette skaftet. Fjern små bobler i det brede skaftet ved forsiktig flicking mikropipette skaftet. Merk: En lignende prosedyre har blitt vist ^32.
5. Plasser mikropipette inn i en pipette holder med en sideåpning som tillater en kontinuerlig fluidforbindelse til et vannmanometer. Sørge for at holderen, som er festet til en hydraulisk driv brukes til å styre meget fin fremføring av mikropipette, er i en liten vinkel (15-25 °)til horisontal slik at kanten av mikropipette taper ikke treffer gut eller skuffen.
6. Monter hydraulisk drift på en bevegelig micromanipulator, som har x, y og z-stasjoner for å aktivere lukket innretting på prøve fartøy (figur 2).
7. Juster det hydrostatiske trykk som påføres fluidet i mikropipette ved hjelp av en sprøyte eller vannfylt gummi pære for å endre høyden av væske i vannsøylen på manometeret til omtrent 40 CMH _{2 O} ovenfor mesenterium.
8. Cannulate microvessel så snart som mulig etter å fylle pipetten; røde celler avsettes på bunnen av pipetten, slik at etter ca. 40 min svært få røde cellene vil strømme inn i beholderen.

6. Microcannulation og Mikrovaskulær Trykkmåling

1. Før du plasserer fylt mikropipette under mikroskop, trykk forsiktig rainer på vev nær microvessel påføre tilstrekkelig kraft til å gripe vevet. Tegnrainer tilbake, noe strekking av vev på linje med microvessel slik at spenningene i de mesenteriske kollagenfibre er på linje med fartøyet.
   1. Juster mikropipette med fartøyet og senk den til syne gjennom okularene. Plasser like oppstrøms for det valgte området kanylering spiss og senke den ned på vev, slik at den delvis hindrer strømningen i beholderen, men ikke tilstoppe den.
2. Cannulate fartøyet ved å kjøre pipettespissen sakte inn årehulrommet ved hjelp av hydraulisk drift. Være forsiktig med å presse gjennom den nedre side av fartøyet.
   Merk: Når mikropipette kommer inn i lumen, vasker perfusatet hurtig blodet i beholderen ut av hulrommet og perfusatet fritt strømmer inn i dyrets blodsirkulasjonen distalt til testmicrovessel, fortrenge noe av den normale blodperfusjon i nedstrøms fartøy.
3. Senk Perfusjonstrykket ved å justere manometeret til blodet (som indikertav dyret er røde blodlegemer) er trukket tilbake inn i den perfunderte segmentet; dette bestemmer balansen trykk hvor de røde cellene forsiktig oscillerer i årehulrommet og måler det hydrostatiske trykket microvessel (P _c) ved den distale enden av microvessel segmentet. Oppretthold fartøy perfusjon på alle trykk over denne balansen press.

7. Microocclusion og samle inn data

1. Valgfritt trinn: Før bruk av mikro-sperreinnretningen for å sperre beholderen ved å trykke den inn i vevet i et ikke-brukte delen av mesenteriet langt fra et fartøy, slik at spissen akkumulerer et fint lag av vev som beskytter den eksperimentelle fartøyet under gjentatt mikro- okklusjoner.
2. Plasser blokker ovenfor perfusert fartøyet i nærheten av den nedre kanten av et mikroskop-feltet.
3. Spill følgende med video og lyd.
   1. Verbalt notere plasseringen av blokken området og den nedre skjermen kanten som sett på okularet retikkel.
   2. Med spissenav blokkerings plassert rett ovenfor microvessel, bruker den fine z kontroll av mikromanipulator for å senk blokker inntil strømningen i beholderen blir gjenlukket. Legg merke til manometeret trykk (P _c) på lyd. Påfør okklusjon typisk for 3-10 sek, og slipp, gjenopprette fri perfusjon. Flytte blokken området opp fartøyet mot pipettespissen i 5-10 mikrometer trinn basert på tid (> 5 min etter første kvartal på et område), antall okklusjoner (3-5), for å hindre åreveggen skade på blokken nettstedet .

8. Analyse av data og måling av L _{p (Vanngjennomtrengelighet)}

1. Under videoavspilling, bestemme innledende avstand (ℓ ₀₎ fra en markør av røde blodlegemer til okklusjon nettstedet ved bruk av et bilde av en scene mikrometer og de ​​kjente posisjoner på bildene. Bestem utgangshastighet (dℓ / dt) av markøren celle fra sin posisjon i flere rammer i løpet av 3-10 sek av innspilte bilder. Avskrekkegruven fartøyet radius (r) fra bildene som ble tatt under okklusjon (figur 3).
2. Beregn J _v / S for hver okklusjon as (dℓ / dt) × (1 / ℓ ₀₎ × (r / 2). Beregn L _p ved et konstant trykk som (J _{v /} S) dividert med det drivende trykk (microvessel trykk - effektiv kolloid osmotisk trykk, se diskusjon).

Representative Results

Figur 4 viser resultater fra måling av tidsforløpet for forandringer i L _p i en rotte venular microvessel kanylert suksessivt med fire perfusates. ³³ Størrelsen av L _p beregnes ved et konstant trykk ble benyttet som mål på endringer i microvessel vegg permeabilitet, først i styretilstand med et perfusat inneholdende 1% bovint serum albumin og når fartøyet er utsatt for inflammatorisk middel bradykinin (BK) ved hjelp av en mikropipette andre inneholdende 10 nM Bk. Bradykinin forårsaket en forbigående økning i L _p som returnerte til kontrollverdien i løpet av den påfølgende 10 til 15 min. Beholderen ble deretter perfusert med kontroll perfusatet i 30 min for å re-etablere en stabil basislinje. Når microvessel ble perfusert ved hjelp av et fjerde mikropipette med den samme konsentrasjon av Bk samt 1 uM sfingosin-1-fosfat (S1P) i perfusatet ble responsen på Bk betydelig dempet. Graden avdempning når Bk og ​​S1P ble perfusert på samme tid ble funnet å være lik den som er målt i andre forsøk hvor S1P ble tilsatt til perfusatet opp til 20 minutter før eksponering til Bk. Disse resultater viser kraften i å være i stand til å foreta flere målinger av L _p på et enkelt fartøy, og viser at virkningen av et middel slik som S1P å stabilbeholderveggen, i nærvær av en inflammatorisk middel kan oppløses i tidsperioder på i størrelsesorden noen få sekunder. I separate beholdere kontrollstudier ble utført med et lignende protokoll i fravær av S1P å vise at dempningen av den Bk responsen var ikke på grunn av anafylaksi.

For noen eksperimentelle design er det viktig å anslå både det oppløste refleksjonskoeffisienten for et makromolekyl (σ) og L _s. Dette gjøres best ved å måle J _v på flere presset på hver enkelt microvessel. Figur 5 viser et eksperiment in hvor både _p L og den effektive kolloidosmotiske trykk på 5% albumin i perfusatet (π _albumin = 27 CMH _{2 O} ved 37 ° C), ble beregnet under forhold da det ikke var noen albumin i vevet som omgir rotte microvessel. I disse eksperimenter J _{v /} S ble målt ved tre forskjellige trykk. L _p er helningen av forholdet mellom J _{v /} S og trykk, og skjæringspunktet på trykk aksen er den effektive kolloidosmotiske trykkforskjellen over karveggen (σΔπ).

Figur 1. Mikro for perfusjon av individuelle microvessels. (A) En mikropipette for kanylering av rotte microvessels med skrå spiss. (B) En rainer for å holde mesenterium vev stabil nærheten av stedet for kanylering. (C) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. intra rigg for microperfusion. (A) Oversikt over dyr brett med micromanipulators og Mikro orienterte løpet glass søyle. (B) Stor metall scenen montert på ingeniør bord og støttelager. (C) bedøvet rotte med Mikro i posisjon for microperfusion av en microvessel. (D) Lukk view av mesentery under et eksperiment. Klikk her for å se en større versjon av denne Figu re.

Figur 3. Måling av filtreringshastighet per arealenhet ved å bruke modifisert Landis teknikk. Denne skjematisk viser en enkelt microvessel kanylert med en mikropipette, og en lukkestang plassert over karet. Umiddelbart etter at denne avsperres microvessel, avstanden (ℓ ₀₎ mellom markør RBC reiser på senterlinjen for det okkluderte microvessel og okklusjon området er registrert slik at cellen bane kan følges i 5-10 sekunder etter okklusjon. Utgangsposisjonen (ℓ ₀₎ og utgangshastighet (dℓ / dt) av cellen benyttes for å beregne den gjennomsnittlige filtreringshastighet per arealenhet av microvessel vegg mellom markør cellen og stedet for okklusjon. Den microoccluder deretter hevet, og gratis perfusjon etablert før ytterligere målinger er gjort.com / filer / ftp_upload / 53210 / 53210fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4. Representative data viser at sfingosin-1-fosfat (S1P) hemming fungerer veldig fort bradykinin (Bk; 10 nM). Forårsaket en forbigående økning i microvessel L _s. S1P påføres som sammenfallende med andre bradykinin (Bk) test hemmet den akutte Bk respons i forhold til første Bk. Disse data viser at tiden for eksponering for en testmiddel kan modifiseres for å evaluere kinetikken til aktivering av en hemmende respons. Spesielt S1P brukes samtidig bare med Bk hemmet sterkt Bk respons. S1P var 1fiM og Bk var 10 nM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5. Måling av J _{v /} S på flere trykk muliggjør både L _p og den effektive kolloidosmotiske trykk som skal måles. Filtrerings fluks, J _{v /} S, ble målt i denne beholder ved forskjellige microvessel hydrostatiske trykk under perfusjon med BSA (50 mg ml ^{- 1;} π = 27 CMH _{2 O)} mens mesenterium var badet med proteinfritt Ringers løsning. Helningen av forholdet mellom J _{v /} S, og trykket er L _p og skjæringen av trykk aksen angir effektive kolloidosmotiske trykkforskjellen over karveggen. I dette forsøket ble Lp var 1,2 × 10 ^-7 (cm sek ^-1 CMH _{2 O} ^-1) og σΔπ var 24 CMH _{2 O.} <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53210/53210fig5large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Detaljer angå L beregninger _s. Selv om transvascular bevegelse fluid inntreffer mens fartøyet fritt perfundert, er en slik utveksling langt for små til å måles ved fri perfusjon, fordi det normalt er mindre enn 0,01% av fartøyets perfusjonshastighet. Men når perfusjonen blir forbigående stoppet ved okkludering av den microvessel, transvascular strømning (dvs. filtrering) måles fra bevegelsen av markør røde celler i lumen som søylen av fluid mellom en markør av røde blodlegemer og området av okklusjon kortere, som vist i Figur 3. Avhengig av kompleksiteten og lengden av den eksperimentelle protokollen en uforgrenet fartøy 600 til 1000 um i lengde er nødvendig.

Når fartøyet ikke er blokkert, og manometeret trykket driver strømningen gjennom microvessel, er trykkfallet over pipettespissen store, slik at microvessel trykk under fri perfusjon er vanligvis bare enNoen CMH _{2 0} over nedstrøms trykk. I motsetning til dette i løpet av en okklusjon trykkfallet over pipetten er meget liten på grunn av væsken sakte inn i beholderen lumen for å erstatte fluid filtrering på tvers av beholderveggen. Dermed under okklusjon det hydrostatiske trykket i årehulrommet (P _c) er lik den som er innstilt av manometeret. Det kolloidosmotiske trykk i den mesenteriske vev er ubetydelig, slik at umiddelbart etter okklusjon, blir transvascular flytende bevegelser fra markeringen røde celler målt hvor det hydrostatiske trykk er kjent og kolloidosmotiske trykk i årehulrommet er lik den som er innstilt i perfusatet. Med suksessive målinger av L _p, er fartøyets lengde tapt hver gang blokken nettstedet er avansert. I tillegg reduserer suksessive recannulation tilgjengelige fartøy lengde.

Den transvascular fluidstrømning per arealenhet av beholderveggen (J _{v /} S) er beregnet fra hastigheten som en målt lengde av søylen av vann i microvEssel lumen mellom en markør av røde blodlegemer og okklusjon området enten kortere (netto filtrering) eller forlenger (netto reabsorpsjon). Forutsetningen er at nøytral oppdrift røde celler som beveger seg langs senterlinjen av fartøyet lumen kan anvendes for å spore den midlere hastighet av vannsøylen som omgir cellen (forholdet mellom røde celler hastighet til å bety vannhastigheten er nær 1,8 for en 6 um røde celler i en 30 um diameter fartøy). ^8,14 Således hvis hastigheten av en markør celle (i pm / sek) mot blokkeren er V um / sek over de første 2-5 sekunder etter okklusjon, og fartøyet er radius r, er volumet av væske filtreres over microvessel veggen mellom det røde blodlegemer og åsted for okklusjon (J _v) πr ^{2 V} mikrometer ^{3 /} sek forutsatt at microvessel er sylindrisk. Ytterligere arealet av en sylindrisk microvessel (S) mellom den markør cellen og okklusjon området er 2πrℓ, hvor ℓ er den opprinnelige avstand mellom markøren cellenog okklusjon nettstedet. Således den gjennomsnittlige opprinnelige transvascular strøm pr flateenhet (J _{v /} S) ved det trykk som er fastsatt av vannmanometer Vr / (2ℓ).

Den enkleste estimat av fartøyet L _p er gjort dersom kolloidosmotiske trykk av perfusatet ble satt lavt i forhold til microvessel trykk (typisk 3,6 CMH _{2 O,} den kolloidosmotiske trykk av bovint serumalbumin i en konsentrasjon på 10 mg / ml og en kapillær trykk som er større enn 30 CMH ₂ O). L _p blir beregnet som (J _{v /} S) / (P _c -3) cm / sek / cm H _{2 O} fordi albumin refleksjonskoeffisienten (σ _albumin) i kontrolltilstanden er nær 0,9. Med denne tilnærming raske endringer i L _p med en tidsoppløsning av størrelsesorden ett minutt kan måles ved å etablere fri flyt mellom suksessive målinger av J _{v /} S ved konstant trykk, som vist i de representative resultater i figur 4. Ovennevnte tilnærming igNores små endringer i kolloidosmotiske trykk av albumin som faller til mindre enn 1 CMH _{2 O} når refleksjonskoeffisienten faller under 0,5, men den feil i estimatet av L _p er fortsatt mindre enn 5% når P _c er større enn 30 CMH _{2 O} .

Når det kreves nøyaktig måling av både L _p og refleksjonskoeffisienten, J _{v /} S måles ved en serie av microvessel trykk under den forventede effektive kolloidosmotiske trykk av testmakromolekylet. Helningen av forholdet mellom J _{v /} S og trykk-måler L _p og skjæringen av trykkaksen når nettostrømmen er null måler σπ (figur 5). Demonstrasjonen at Jv er lineært relatert til trykket er også en viktig validering av bruk av enkelttrykkmålinger ved å bruke enklere protokollen beskrevet ovenfor (figur 4) når den kolloidosmotiske trykkforskjellen er liten i forhold til hydrostatisk trykkure.

Mulige feilkilder. Det er flere problemer som kompromitterer nøyaktig måling. Unnlatelse av å okkludere karet, eller skade på karveggen ved okklusjon språk resulterer i fluidlekkasje forbi okklusjon området, og bevegelse av markør celler mot okklusjon området raskere enn det som følge av transvascular utveksling. Mens markør celler som normalt beveger seg langsomt mot okklusjon området, men ikke når det er en lekkasje indikert dersom markerings celler spore helt til sperreinnretningen. På den annen side, til svikt forsegle pipetten inn i microvessel lumen ved kanylering stedet resultater i undervurdering av J _{v /} S. Fluid lekkasje fra pipetten til superfusate eller årehulrommet oppstrøms for kanylering stedet medfører et betydelig trykkfall over pipettespissen. En slik lekkasje er detektert når cellene i mikropipette spissen strøm ved en høyere hastighet enn de i den nedstrøms fartøyet lumenn av okkludert kar. Forsiktig reposisjonering av mikropipette forsegler vanligvis slik lekkasje. Et annet problem oppstår dersom L _{p av} beholderveggen ikke er jevn, som vanligvis har en eller flere lokaliserte områder av skade eller inflammasjon. Marker cellene spore til området hvis de transvascular flyt er konsentrert der. Rød celle bevegelse fremdeles måler transvascular flyte, men tiltaket J _{v /} S ikke er representativ for det meste av veggen området innenfor testsegmentet.

Betydningen av metoden i forhold til eksisterende metoder. De to mest vanlig brukte metoder for å undersøke reguleringen av endotelial barriere permeabilitet og transvascular utveksling er (1) in vitro måling av veksling gjennom dyrkede endoteliale cellemonolagene og (2) måling av tracer akkumulering i en vevsprøve etter at sporstoffet injiseres intravenøst ​​inn i hele dyret. Eksperimenter i dyrkede endotelceller cellemonolag er favored fordi de cellulære funksjoner kan mer direkte endret og det er nok cellemateriale tilgjengelig for detaljert evaluering av molekylære hendelser i endotelceller. Men under de fleste kulturbetingelser endotelcellene vanligvis ikke danner barrieren representativ for vaskulær permeabilitet in vivo. Den modifiserte Landis teknikk som er beskrevet ovenfor har vist seg å være et robust og pålitelig teknikk for å undersøke reguleringen av endotelial barrierefunksjonen i intakte venular mikrokar. I hendene på en erfaren etterforsker paret målinger av permeabilitet under kontroll og testforhold hvor noen av de tilnærminger som brukes i cellekultur (f.eks avbildning av cellulære komponenter, endring av signalveier) kan brukes. Betydningen av eksperimenter i intakte microvessels har blitt demonstrert ved å vise betydelige forskjeller mellom de mekanismene som regulerer barriere permeabilitet i individuelt perfusert microvessels og de ofte beskrevet i dyrkede endotelceller monosjiktene. Eksempler på dette er svar å klippe, trombin eksponering, og bidraget fra kontraktile mekanismer for å inflammatorisk gap formasjon ^2-6,9,16. Målinger av tracer opphopning i en intakt karseng bevarer mer normal fysiologisk funksjon, men direkte undersøkelse av reelle endringer i vaskulær permeabilitet er kompromittert på grunn tracer akkumulering kan øke som følge av øket perfusjon (større overflate for utveksling) med eller uten en økning i permeabiliteten av veggen. Således kan omfanget av en permeabilitet Utvidelsen kan overvurderes da vasodilatasjon øker antallet perfuserte fartøy og derved totalt oppløst stoff akkumulering er større enn den som på grunn av økningen i vaskulær permeabilitet ³⁴ alene.

Fremtidige søknader. Utvalget av alternativer for å endre cellestruktur og funksjon under de samme betingelsene som permeabilitet av indiduelle fartøy er direkte målt under microperfusion forventes å øke. Videre forventes det at kan løses ved anvendelse av metodene i genetisk modifisert rotte mesenteriet et langvarig problem som har eksistert i genetisk modifiserte mus. Spesielt når genetisk modifiserte mus ble tilgjengelig, ble det forventet at microperfusion kan utvides til å undersøke mikrokar i sine mesenteriale fartøy. Mens noen microperfusion eksperimenter har blitt gjennomført i mikrokar av mus mesenteriet ^35, mus har generelt færre mikrokar i sin mesenteriske vev enn rotter, og disse fartøyene er ofte korte og svært forgrenet, i motsetning til mer egnede lengre (> 500 um) rette fartøy som kan bli funnet i rotter. Således eksperimenter for å undersøke modulering av transvascular utveksling i genetisk mus har stolt på assays slik som Miles ³⁴ eller teknisk krevende, men mer pålitelig tracer-eksperimenter som målerendringer i både vaskulær og ekstravaskulær opphopning av fluorescerende av radiomerkede testprober ^36.

Modifikasjoner av fremgangsmåten. I de ovennevnte protokoller, forandringer i perfusatet sammensetning kreves endring av mikropipetter. En alternativ tilnærming er å fylle mikropipette in situ ved hjelp av en påfylling apparat. Denne fremgangsmåten er blitt utført som beskrevet i detalj ^37. Begrensningen er at tiden for å endre sammensetningen av perfusatet i pipetten er ikke så raskt som oppnås ved hjelp av pipette erstatning, men fremgangsmåten er spesielt nyttig når det er nødvendig å gjennomstrømme en microvessel i lengre perioder av gangen.

Den samme microperfusion nærmet kan utvides til å måle permeabilitet koeffisienter til fluorescensmerkede oppløst stoff ^31,38-40. I dette tilfelle er enkeltløpet mikropipette er erstattet av en dobbeltløpet (theta) pipette ⁴¹ og fartøyet er perfusertvekselvis med prøven fluorescerende oppløsningsmaterialet for å måle i vev i forhold til lumen innhold, og det samme perfusatet uten at det fluorescerende oppløsningsmaterialet for å fjerne vev og tillate gjentatte målinger av oppløst substans akkumulering. Når målinger av transvascular vannstrømmer, kombineres med målinger av oppløst stoff permeabilitetskoeffisient ved hjelp av fluorescensmerkede test oppløste stoffer, fluorescerende indikatorer for intracellulær sammensetning, eller konfokal avbildning av cellulære komponenter, er en mer avansert datastyrt fluorescensmikroskop nødvendig. Siden disse undersøkelser vanligvis krever linser med større forstørrelse og meget kortere arbeidsavstand blir kvartsen søyle brukes til å holde mesenteriet erstattet med et glass dekkglass limt til en pleksiglass støtte i vevet godt på mikroskopet skuffen. Den økte tilgjengeligheten av 3-D skrivere, vil gi høy presisjon produksjon av tilpassede skuffer, som tilfredsstiller den smale toleranse som kreves for å plassere større diameter objektiver med kortere arbeidsavstand i forhold til utvalgte microvessels.

Tilgjengeligheten av bruk microvessels i mesenterium varierer med alder, kjønn, og belastning. Derfor er valg av stamme av rotte og bruk av mannlig eller kvinnelig vil avhenge av de spesifikke spørsmål blir adressert. For mange av våre nyere studier har vi brukt Sprague-Dawley rotter som er aklimatisert i vår dyre anlegget minst en uke før bruk på ca alder 3-4 måneder og da finner vi de generelt har ledige lange, rette tarmens microvessels. I motsetning til dette har kolleger med hell brukt hunn Sprague-Dawley rotter av 2-3 måneder ^er 13 år.

Rollen til de røde cellene. Den primære rolle røde celler som beskrevet ovenfor, var å spore transvascular vannbevegelse forutsatt at cellen handlet som inert, nøytral oppdrift indikatorer på vannet strømmer etter microvessels var okkludert. I tillegg til denne grunnleggende rolle, deter nå erkjent at de røde cellene bidra til stabiliteten av barrieren ved å tilføre S1P til perfusatet når albumin i foreliggende ^31,42,43. Det er flere viktige implikasjoner av disse observasjonene. I fravær av røde celler, eller ved bruk av alternative inert strømnings markører referanse permeabilitet er sannsynlig å være mindre stabil. Det anbefales at målinger av S1P bør gjøres i alle perfusates brukt i microperfusion eksperimenter.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health tilskudd HL44485 og HL28607.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MICROSCOPE, TABLE AND STAGE
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Olympus	CK-40	try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Leica	DMIL	try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
narrow diameter, long working distance objective: example	Nikon	Nikon E Plan 10×/0.25 LWD
stage platform--1/2 inch or 1 cm sheet steel	welding shop		this should be heavy to reduce vibration
Unislide x-y table: dove tail slides	Velmex	AXY4006W1
VIDEO
CCD video camera: example	Pulnix	TM-7CN (no longer available)	no color needed
video capture system with audio--generic
video playback system (completely still frame, single frame motion)
small microphone
MICROMANIPULATORS, HOLDERS
micromanipulator, XYZ (3)	Prior/Stoelting (no longer available)		look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning
hydraulic probe drive, one way	FHC	50-12-1C	need to buy either manual drive or electronic drive
manual drum drive	FHC	50-12-9-02
or hydraulic drive, 3 way	Siskiyou Corporation	MX610 (1-way) or MX630 (3-way)	great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years
connectors/rods/holders	Siskiyou Corporation	MXC-2.5, MXB etc.
pin vise	Starrett	162C	to hold restrainer
pipette holder	World Prescision Instruments	MPH3
water manometer ~120 cm
MICROSCOPE TRAY
clear Plexiglas for microscope tray for animal
3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall	Quartz Scientific Inc.	custom	(or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective
Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)
medical adhesive for tissue well	NuSil	MED-1037
All-purpose silicone rubber heat mat, 5" L x 2" W	Cole Parmer	EW-03125-20	heater for microscope tray--needs cord and controller--240V version available
Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC	Cole Parmer	EW-03122-75
STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out	Cole Parmer	EW-01575-00
PIPET MANUFACTURE
vertical pipette puller	Sutter Instrument Company	P-30 with nichrome filament
1.5 mm OD thin wall capillary tubing	Sutter Instrument Company	B150-110-10
pipette grinder air stone and dissection microscope--see reference in text			or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments
RX Honing Machine, System II	RX Honing Machine Corporation	MAC-10700 Rx System II Machine	alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle
with ceramic sharpening disc	RX Honing Machine Corporation		use "as is" or attach lapping film
lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um	3M	part no. 051144 80827	268X Imperial lapping film sheets with adhesive back--can be purchased from Amazon

References

1. Curry, F. R. Permeability measurements in an individually perfused capillary: the 'squid axon' of the microcirculation. Experimental physiology. 93, 444-446 (2008).
2. Curry, F. R., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
3. Curry, F. R., Adamson, R. H. Tonic regulation of vascular permeability. Acta physiologica. 207, 628-649 (2013).
4. Michel, C. C. Fluid exchange in the microcirculation. The Journal of physiology. 557, 701-702 (2004).
5. Tarbell, J. M., Simon, S. I., Curry, F. R. Mechanosensing at the vascular interface. Annual review of biomedical engineering. 16, 505-532 (2014).
6. Sarelius, I. H., Kuebel, J. M., Wang, J., Huxley, V. H. Macromolecule permeability of in situ and excised rodent skeletal muscle arterioles and venules. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 290, H474-H480 (2006).
7. Curry, F. E., Frokjaer-Jensen, J. Water flow across the walls of single muscle capillaries in the frog, Rana pipiens. The Journal of physiology. 350, 293-307 (1984).
8. Michel, C. C., Mason, J. C., Curry, F. E., Tooke, J. E., Hunter, P. J. A development of the Landis technique for measuring the filtration coefficient of individual capillaries in the frog mesentery. Q J Exp Physiol Cogn Med Sci. 59, 283-309 (1974).
9. Adamson, R. H., Zeng, M., Adamson, G. N., Lenz, J. F., Curry, F. E. PAF- and bradykinin-induced hyperpermeability of rat venules is independent of actin-myosin contraction. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 285, H406-H417 (2003).
10. Huxley, V. H., Rumbaut, R. E. The microvasculature as a dynamic regulator of volume and solute exchange. Clinical and experimental pharmacology, & physiology. 27, 847-854 (2000).
11. Rumbaut, R. E., Wang, J., Huxley, V. H. Differential effects of L-NAME on rat venular hydraulic conductivity. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. , 279-H2023 (2000).
12. Yuan, D., He, P. Vascular remodeling alters adhesion protein and cytoskeleton reactions to inflammatory stimuli resulting in enhanced permeability increases in rat venules. Journal of applied physiology. 113, 1110-1120 (2012).
13. Zhou, X., He, P. Temporal and spatial correlation of platelet-activating factor-induced increases in endothelial [Ca(2)(+)]i, nitric oxide, and gap formation in intact venules. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 301, H1788-H1797 (2011).
14. Adamson, R. H., et al. Oncotic pressures opposing filtration across non-fenestrated rat microvessels. The Journal of physiology. 557, 889-907 (2004).
15. Adamson, R. H., et al. Epac/Rap1 pathway regulates microvascular hyperpermeability induced by PAF in rat mesentery. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 294, H1188-H1196 (2008).
16. Curry, F. E., Zeng, M., Adamson, R. H. Thrombin increases permeability only in venules exposed to inflammatory conditions. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 294, H1188-H1196 (2003).
17. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature. 32, 347-355 (2014).
18. Bagher, P., Davis, M. J., Segal, S. S. Intravital macrozoom imaging and automated analysis of endothelial cell calcium signals coincident with arteriolar dilation in Cx40(BAC) -GCaMP2 transgenic mice. Microcirculation. 18, 331-338 (2011).
19. Duza, T., Sarelius, I. H. Increase in endothelial cell Ca(2+) in response to mouse cremaster muscle contraction. The Journal of physiology. 555, 459-469 (2004).
20. Oshiro, H., et al. L-type calcium channel blockers modulate the microvascular hyperpermeability induced by platelet-activating factor in vivo. Journal of vascular surgery. 22, 732-739 (1995).
21. Chen, W., et al. Atrial natriuretic peptide-mediated inhibition of microcirculatory endothelial Ca2+ and permeability response to histamine involves cGMP-dependent protein kinase I and TRPC6 channels. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 33, 2121-2129 (2013).
22. Harris, N. R., Whitt, S. P., Zilberberg, J., Alexander, J. S., Rumbaut, R. E. Extravascular transport of fluorescently labeled albumins in the rat mesentery. Microcirculation. 9, 177-187 (2002).
23. Yuan, W., Li, G., Zeng, M., Fu, B. M. Modulation of the blood-brain barrier permeability by plasma glycoprotein orosomucoid. Microvascular research. 80, 148-157 (2010).
24. Sugiura, Y., Morikawa, T., Takenouchi, T., Suematsu, M., Kajimura, M. Cilostazol strengthens the endothelial barrier of postcapillary venules from the rat mesentery in situ. Phlebology / Venous Forum of the Royal Society of Medicine. 29, 594-599 (2014).
25. Guo, M., et al. Fibrinogen-gamma C-terminal fragments induce endothelial barrier dysfunction and microvascular leak via integrin-mediated and RhoA-dependent mechanism. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 29, 394-400 (2009).
26. Dewar, A. M., Clark, R. A., Singer, A. J., Frame, M. D. Curcumin mediates both dilation and constriction of peripheral arterioles via adrenergic receptors. The Journal of investigative dermatology. 131, 1754-1760 (2011).
27. Lee, J. F., et al. Balance of S1P1 and S1P2 signaling regulates peripheral microvascular permeability in rat cremaster muscle vasculature. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 296, H33-H42 (2009).
28. Landis, E. M. Microinjection studies of capillary permeability. II. The relation between capillary pressure and the rate at which fluid passes through the walls of single capillaries. Am J Physiol. 82, 217-238 (1927).
29. Curry, F. E., Huxley, V. H., Sarelius, I. H. Techniques in cardiovascular physiology Part 1. Linden, R. J. P3/1, Elsevier Scientific Publishers Ireland Ltd. 1-34 (1983).
30. Vurek, G. G., Bennett, C. M., Jamison, R. L., Troy, J. L. An air-driven micropipette sharpener). J Appl Physiol. 22, 191-192 (1967).
31. Curry, F. E., Clark, J. F., Adamson, R. H. Erythrocyte-derived sphingosine-1-phosphate stabilizes basal hydraulic conductivity and solute permeability in rat microvessels. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 303, H825-H834 (2012).
32. Bagher, P., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Microiontophoresis and micromanipulation for intravital fluorescence imaging of the microcirculation. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
33. Adamson, R. H., et al. Attenuation by sphingosine-1-phosphate of rat microvessel acute permeability response to bradykinin is rapidly reversible. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 302, H1929-H1935 (2012).
34. Bates, D. O. Vascular endothelial growth factors and vascular permeability. Cardiovasc Res. 87, 262-271 (2010).
35. Adamson, R. H., et al. Rho and rho kinase modulation of barrier properties: cultured endothelial cells and intact microvessels of rats and mice. The Journal of physiology. 539, 295-308 (2002).
36. Curry, F. R., et al. Atrial natriuretic peptide modulation of albumin clearance and contrast agent permeability in mouse skeletal muscle and skin: role in regulation of plasma volume. The Journal of physiology. 588, 325-339 (2010).
37. Neal, C. R., Bates, D. O. Measurement of hydraulic conductivity of single perfused Rana mesenteric microvessels between periods of controlled shear stress. The Journal of physiology. 543, 947-957 (2002).
38. Adamson, R. H., et al. Albumin modulates S1P delivery from red blood cells in perfused microvessels: mechanism of the protein effect. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 306, H1011-H1017 (2014).
39. Huxley, V. H., Wang, J. J., Sarelius, I. H. Adaptation of coronary microvascular exchange in arterioles and venules to exercise training and a role for sex in determining permeability responses. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 293, H1196-H1205 (2007).
40. Huxley, V. H., Williams, D. A. Basal and adenosine-mediated protein flux from isolated coronary arterioles. Am J Physiol. 271, H1099-H1108 (1996).
41. Davis, M. J., Gore, R. W. Double-barrel pipette system for microinjection. Am J Physiol. 253, H965-H967 (1987).
42. Adamson, R. H., et al. Sphingosine-1-phosphate modulation of basal permeability and acute inflammatory responses in rat venular microvessels. Cardiovasc Res. 88, 344-351 (2010).
43. Zeng, Y., Adamson, R. H., Curry, F. R., Tarbell, J. M. Sphingosine-1-phosphate protects endothelial glycocalyx by inhibiting syndecan-1 shedding. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. , H306-H363 (2014).

Tags

Molecular Biology Microperfusion rotte mesentery hydraulisk ledningsevne permeabilitet Landis teknikk