Mikroperfusionskammerindretning Teknik at undersøge Regulering af mikrokardannelse permeabilitet i rotte mesenterium

Abstract

Eksperimenter til at måle egenskaberne permeabilitet af individuelt perfusionerede mikrokar giver en bro mellem undersøgelse af molekylære og cellulære mekanismer, der regulerer vaskulær permeabilitet i dyrkede endotheliale cellemonolag og de funktionelle valuta egenskaber af hele mikrovaskulære senge. En metode til at kanyle og perfundere venular mikrokar rotte mesenterium og måle den hydrauliske ledningsevne af mikrokar væg er beskrevet. Den vigtigste nødvendige udstyr omfatter en intravital mikroskop med et stort modificeret fase, der understøtter mikromanipulatorer at placere tre forskellige microtools: (1) en skrå glasmikropipette at kanyle og perfundere mikrokar; (2) et glas mikro-occluder til transient at blokere perfusion og muliggøre måling af transvascular vandstrøm bevægelse ved en præcis hydrostatisk tryk, og (3) en stump glasstav at stabilisere mesenteriske væv ved stedet for kanyle. Den modificerede Landis mikro-okklusion Technique bruger røde celler suspenderet i kunstig perfusatet som markører bevægelighed transvascular fluid, og gør det muligt gentagne målinger af disse strømme som eksperimentelle betingelser er ændret og hydrostatiske og kolloidosmotiske trykforskel over mikrokar er nøje kontrolleret. Målinger af hydraulisk ledningsevne først ved hjælp af en kontrol perfusat, så efter re-kanylering af samme mikrokardannelse med test perfusater muliggør parrede sammenligninger af mikrokardannelse respons under disse velkontrollerede betingelser. Forsøg på at udvide fremgangsmåden til mikrokar i mesenteriet af mus med genetiske modifikationer forventes at ændre vaskulær permeabilitet blev alvorligt begrænset på grund af fraværet af lange, lige og forgrenede mikrokar i musen mesenteriet, men nylige tilgængelighed af rotterne med lignende genetiske modifikationer ved hjælp af forventes CRISPR / Cas9 teknologi til at åbne nye områder af undersøgelse, hvor der kan anvendes de metoder, der er beskrevet heri.

Introduction

Mikroperfusionskammeret i vaskulaturen omfatter oprettelsen af ​​styret strømning af en kunstig perfusatet kendte sammensætning via en mikropipette i et blodkar normalt mindre end 40 um i diameter. Den perfunderede fartøjet forbliver inden for sit normale vævsmiljø og perfunderet med dyrets blod op til tidspunktet for kanylering. Når det bruges i forbindelse med en række video billeddannelse eller fluorometriske metoder, in situ mikroperfusionskammeret muliggør måling af vand og opløste strømmer over væggene af mikrokar under betingelser, hvor de drivende kræfter for disse strømme er kendte og egenskaberne permeabilitet af karvæggen kan være direkte evalueret. Endvidere ved at styre sammensætningen af ​​væsken omkring mikrokar i vævet (perfusatet og superfusate), regulering af mikrokardannelse permeabilitet og udvekslingen kan undersøges ved at aktivere endotelcellerne danner mikrokar væg at blive udsat for en række experimental betingelser (agonister, modificerede perfusion betingelser, fluorescerende indikatorer til at måle intracellulær sammensætning og signalering) for præcist målte perioder (sec til hr). Desuden kan ultrastrukturelle eller cytokemiske evalueringer af de vigtigste cellulære molekylære strukturer, der regulerer barrieren skal undersøges i den samme mikrokar, hvor permeabiliteten måles direkte. Tilgangen danner derved en bro mellem undersøgelse af cellulære og molekylære mekanismer til at ændre endotel barrierefunktion i dyrkede endotheliale cellemonolag og undersøgelser i intakte mikrokar. Se følgende anmeldelser for yderligere evaluering ^1-6.

En begrænsning af mikroperfusionskammeret er, at det kun kan anvendes i mikrovaskulære senge, der er tynde, transparente og har tilstrækkelig strukturel integritet til at muliggøre kanylering med et glas mikropipette. Mens tidlige undersøgelser anvendte frog mikrokar i mesenterium og tynde kutan pectoris muscle ^7,8, langt den mest anvendte præparat i mammale modeller er rotter mesenteriet ^9-15. De fleste undersøgelser har fokuseret på akutte ændringer i vaskulær permeabilitet undersøgt over perioder på 1-4 timer, men nyere undersøgelser er blevet udvidet til målinger på de enkelte fartøjer 24-72 timer efter en indledende perfusion ^12,16. Den nyligt udviklede CRISPR-teknologi, som lover at gøre mere genetisk modificerede rotte modeller til rådighed for at studere regulering vaskulær permeabilitet ¹⁷ skal gøre det muligt de metoder, der er beskrevet i denne meddelelse, der skal anvendes i venular mikrokar af mesenterium i disse vigtige nye rotte-modeller.

Metoden kræver et inverteret mikroskop udstyret med en specialbygget mikroskopobjektbord stort nok til at rumme både tilberedning af animalske og mindst tre mikromanipulatorer anvendes til at placere microtools tæt på den perfunderede fartøjet, og at tilpasse en perfusion mikropipette med beholderenlumen. For eksempel en brugerdefineret platform for et xy mikroskopobjektbord (ca. 90 x 60 cm) kan fremstilles fra en 1 cm tyk stålplade med en rust-bevis belægning. Etapen er fastgjort til en ingeniør indeks bord eller to dove-tail slides monteret vinkelret og understøttet på Teflon søjler eller ball overførsler til bevægelse i vandret plan. En typisk rig (se figur 2) har meget tilfælles med mikroskopet og micropositioning udstyr, der anvendes til en række intravital microcirculation eksperimenter såsom dem til måling af enkelt beholder blodgennemstrømning og hæmatokrit, lokale ilttilførsel af blod perfunderet mikrokar, regulering af vaskulær glat muskeltonus, og den lokale mikrovaskulære akkumulering af fluorescerende sporstoffer injiceret i hele cirkulationssystemet. ^18-26

Det grundlæggende aspekt af teknikken er måling af volumenstrøm (J _v) over et afgrænset areal (S) i mikrokardannelse væg. For at opnådette via den modificerede Landis her beskrevne teknik en simpel inverteret mikroskop er tilstrækkelig. En lille videokamera monteret på billedet havn og videosignalet med et tilsat tidsbase, vises på en videoskærm og registreres enten i digital form på en computer eller som en digital eller analog signal på en videooptager. Når mikrokar kanyle den del af mikrokar synlig for kameraet kan ændres ved at flytte scenen og manipulatorer som en enhed uden at forstyrre kanylering.

Måling af transvascular strømme kan også kombineres med mere detaljerede undersøgelser ved hjælp af en sofistikeret fluorescens mikroskop med passende filtre såsom rigge anvendes til måling af opløst stof permeabilitet, fluorescerende forhold monitorering af cytoplasmatisk calcium eller andre cellulære mekanismer, og konfokal billeddannelse ^{6,12,13, 27.} En vigtig fordel af alle mikroperfusionskamre tilgange er evnen til at foretage gentagne målinger på samme fartøj, Under kontrolleret ændring af drivkraft såsom hydrostatiske og oncotiske tryk eller inducerede ændring i svarene fartøj til inflammatoriske tilstande. Den mest almindelige design er en parret sammenligning af målte hydrauliske ledningsevne (L _p) på samme fartøj med fartøjet først perfunderet via en mikropipette fyldt med en kontrol perfusat og den røde cellesuspension at etablere en baseline permeabilitet tilstand, derefter med en anden pipette med testmidlet tilsat til perfusatet. Flere kanyleringerne er muligt med cyklussen gentages efter reperfusion med kontrolgruppen pipette.

Den foreliggende protokol viser kanylering og mikroperfusionskammeret af et venular fartøj rotter mesenteriet at optage vand flusmidler tværs af mikrokar væg og måle L _p af karvæggen, et nyttigt indeks for permeabiliteten af den fælles vej for vand og opløste stoffer på tværs af intakte endothelial barriere. Proceduren kaldes modificeret Landis technique fordi den oprindelige Landis princippet om at bruge den relative bevægelse af røde celler som et mål for transvascular fluidudskiftning efter perfusion bliver blokeret bevares ^28, men række eksperimentelle betingelser (f.eks de hydrostatiske og albumin onkogene trykforskelle over mikrokar væg) tilgængelige efter mikroperfusionskammerindretning er langt større end i uncannulated blod perfunderet mikrokar ^8,29.

Protocol

Etik Statement: Alle procedurer blev revideret og godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg.

1. Indledende Fabrikation af Mikropipetter, Restrainers og blokkere

1. Træk flere rene borosilikatglas kapillarrør i halve ved hjælp af en elektronisk aftrækker indstilles således, at, når der trækkes, den strakte del af røret er ca. 1 cm i længden og de to halvdele er noget symmetrisk. Sørg for, at konus er i overensstemmelse med dimensionerne i figur 1. Brug begge halvdele for Mikropipetter, restrainers og blokkere.
   1. Facet de mikropipetter ved hjælp af et slibeskive ³⁰ luftdrevet med 0,5 um slibepapir badet med vand. Indstille vinklen på mikropipetten holderen, så at det er omkring 30 grader fra vandret.
   2. Grundigt vaske og tørre mikropipetter ved hjælp sugning til at trække ren acetone gennem spidsen og op akslen. Efterse mikropipetter (Figur 1A) ved hjælp af en lille opretstående mikroskop med 4 × og 40 × mål udstyret med en alligator klip mikropipette holder og et okular reticle.
   3. Vælg mikropipetter med spids åbning omkring 50 um lang med en affasning, hvis længde / bredde-forholdet er mellem 3,1 og 3,5 og med et skarpt tilspidset spids, som hjælper trænge de hårde collagenfibre i mesenteriet.
   4. Opbevar 15-20 mikropipetter på lidt varierende størrelse i et støvfrit kassen.
2. Foretag restrainers hjælp trukket kapillarrør forberedt i trin 1.1). Hold en løftes glaskapillarrør kort i nærheden af en mikroflamme til dannelse af en stump ende (figur 1B). Opbevar flere i et støvfrit kassen.
3. Foretag microoccluders hjælp trukket kapillarrør forberedt i trin 1.1). Hold en trukket kapillarrør under en mikroflamme og forsigtigt bøje (ved hjælp af en slange adapter, f.eks., 23 G) den fine spids (ca. 4 mm fra spids) for at danne en vinkel på tæt ved 120 grader i forhold til akslen (

2. Animal Forberedelse og Kirurgi

1. Bedøver mænd (350-450 g) eller Sprague-Dawley-rotter (200-300 g) med pentobarbital natrium (80-100 mg / kg, Sigma-Aldrich, P3761) via subkutan injektion; beskytte mesenterium ved ikke at bruge intraperitoneal injektion.
2. Gennem kirurgiske procedurer og forsøgsprotokoller, opretholde anæstesi ved supplerende injektioner (30 mg / kg) efter behov. Bestem dybden af ​​anæstesi ved tå knivspids eller hornhinde refleks. Efter afslutning af den eksperimentelle procedure, aflive rotten via pentobarbital overdosis eller intra-kardiale injektion af mættet kaliumchlorid under anæstesi.

3. Forbered Løsninger og erythrocytter til brug som Flow Markers

1. Forbered pattedyr Ringers opløsning for superfusate og kontrol perfusatet opløsning (typisk pattedyr Ringers opløsning indeholdende 10 mg / ml fedtsyrebovint serumalbumin, BSA).
   1. Filter perfusat gennem 0,2 um sprøjtefiltre at fjerne bittesmå partikler, der kan blokere mikropipettespidsen; filtrere i små ren beholder.
2. Forbered erythrocytter ved at trække ca. 0,2 ml blod fra halevenen af ​​bedøvede rotter i en 20G nål på en lille sprøjte indeholdende 0,05 ml heparin (1.000 U / ml) og overføres til en 15 ml centrifugerør indeholdende ca. 14 ml pattedyr Ringers opløsning opløsning .
   1. Centrifuge til forsigtigt pakke røde blodlegemer (ca. max 200 × g i 7 min). Tegn fra supernatanten og re-suspendere de røde celler i Ringers opløsning.
   2. Efter centrifugering og fjernelse af supernatant tre gange forlader de pakkede røde blodlegemer i bunden af ​​røret til senere brug. Bemærk, at denne procedure reducerer blodplader i de endelige perfusater til mindre end 0,1% af det normale niveau ^31.

4. Arranger Tissue på AnimalBakke

1. Barbere maven af ​​bedøvet rotte nedefra navlen til xiphoid proces. Sikre, at det barberede område strækker sig omkring højre (for rotte placeret på højre side), således at håret ikke danner en væge til at trække superfusate ud af vævet godt. Fjern afklippet hår med en fugtet gaze eller væv.
   1. Hold huden med en stump savtakkede pincet og gøre en midterlinje indskæring (2-3 cm lang) gennem huden ved hjælp af en robust saks. Ved hjælp af en fin (iris) saks lave en lignende snit gennem linea alba, løfte bugvæggen med savtakkede pincet for at undgå at beskadige tarmen.
   2. Med dyret på sin side på dyret bakken forsigtigt trække tarmen fra bughulen ved hjælp af bomuld-tippes applikatorer (træ stick) dyppet i Ringers opløsning og stumpe savtakkede pincet. Arranger tarmen i vævet godt, så mesenterium er draperet over søjlen til visning gennem mikroskop tage sig for at undgå at røre mesenterium (potentially skadelige mikrokarrene) med enten pincet eller bomuld.
      Bemærk: Dyret bakken (figur 2A) kan konstrueres ud fra plexiglas og kræver et væv godt (ca. 3 mm dyb), en optisk klar søjle (f.eks poleret kvarts ca. 2 cm dia og 5 mm høje.), Og en varmepude tilpasset for at opretholde dyrets temperatur. Tykkelsen af ​​søjlen må ikke overstige arbejdsafstanden af ​​målet.
2. Placer dyret bakke på objektbordet så mesenteriet er synlig gennem okularerne.
3. Placer en tyngdekraft-fed drop linje til løbende superfuse mesenterium med pattedyr Ringers opløsning holdes ved 35-37 ° C. Brug gazepuder at holde tarmen på plads, hjælpe fastholde fugt og væge overskydende Ringers opløsning fra overfladen. Justér flow og suge spildevandet at fastholde en konsekvent superfusate tykkelse.
4. Identificer mål venular mikrokar, som eruforgrenede segmenter nedstrøms for konvergerende flow, en eller to grene distale til sande kapillærer. Find en uforgrenet fartøj (helst 600 til 1000 um i længden) med rask blodgennemstrømning og fri for hvide blodlegemer stikning på karvæggen.
5. Anbring prøven mikrokar i midten af ​​mikroskopfelt, og flytte harpiksstopperen i position i nærheden af ​​det valgte kanyleringssted.

5. Fyld Mikropipette og Mount i Holder

1. Lige før kanylering, suspendere de røde celler i perfusatet. Tilføj 7 pi pakkede røde blodlegemer til 0,5 ml perfusatet i et rent borsilikat reagensglas. Bemærk: Hæmatokritværdier på 1-3% kan anvendes, men konsistent hæmatokrit vil føre til ensartede Perfusatprøver koncentrationer af stoffer, der frigives fra de røde blodlegemer.
2. Monter en 1 ml sprøjte med en 23G slange adapter og PE 50 rør (5-15 cm længde). Tegn perfusatet / røde blodlegemer blandingen ind i sprøjten. Vend sprøjten at blande og udvise alle bobler fra slanger ogadapter. For øget effektivitet, fit slange til flere sprøjter før forsøget starter, og holde dem i en støvfri kasse eller plastpose.
3. Fyld mikropipette ved at fremføre slangen ind i den store ende af mikropipette, indtil den ligger an mod den tilspidsede område. Påfør en blid hurtig tryk på sprøjtens stempel til at fylde mikropipettespidsen. Bemærk: En lille strøm eller dråbe skal være synlig i spidsen for at beviser fuldstændig fyldning.
4. Trække slangen, mens forsigtigt at skubbe på stemplet for at fylde den bredere del af mikropipetten akslen. Fjerne små bobler i den brede aksel ved forsigtigt at bladre mikropipetten akslen. Bemærk: En tilsvarende procedure er blevet illustreret ^32.
5. Placer mikropipette i en pipette holder med en sideport, som tillader en kontinuerlig fluid-forbindelse til en vandmanometer. Kontroller, at holderen, som er fastgjort til et hydraulisk drev anvendes til at styre meget fin fremføring af mikropipetten, er i en lille vinkel (15-25 °)til vandret, således at kanten af ​​mikropipette konus ikke rammer tarmen eller bakke.
6. Montér det hydrauliske drev på en bevægelig mikromanipulator, der har x, y og z-drev for at muliggøre tæt tilpasning på prøve fartøj (Figur 2).
7. Juster det hydrostatiske tryk, der påføres fluidet i mikropipetten anvendelse af en sprøjte eller vandfyldt gummibolden at ændre højden af væske i vandsøjlen af manometer til ca. 40 CMH ₂ O ovenfor mesenteriet.
8. Kanyle af mikrokar så hurtigt som muligt efter påfyldning af pipetten; røde celler sedimentere til bunden af ​​pipetten, således at efter ca. 40 min meget få røde celler strømme ind i beholderen.

6. Microcannulation og Mikrovaskulære Pressure Measurement

1. Før du placerer den fyldte mikropipette under mikroskopet, tryk forsigtigt harpiksstopperen på vævet nær mikrokardannelse anvende tilstrækkelig kraft til at gribe vævet. TegnRestrainer tilbage, let strække vævet i overensstemmelse med mikrokardannelse så spændingerne i de mesenteriske kollagenfibre er på linje med beholderen.
   1. Juster mikropipette med skibet, og sænk den til syne gennem okularerne. Placer spidsen lige opstrøms for den valgte kanyleringssted og sænk den på vævet, således at det delvist hindrer strømning inden i beholderen, men ikke okkludere det.
2. Kanyle beholderen ved at køre pipettespidsen langsomt i beholderen lumen ved hjælp af hydrauliske drev. Pas på ikke at skubbe igennem den nedre side af fartøjet.
   Bemærk: Som mikropipetten ind i lumen, perfusatet hurtigt vasker blodet i karret ud af hulrummet og perfusatet frit strømmer ind i dyrets omsætning distalt for test mikrokar, forskyde nogle af de normale blodperfusion i downstream fartøjer.
3. Sænk perfusion ved at regulere manometeret, indtil blodet (som angivetaf dyrets røde blodlegemer) trækkes tilbage i den perfunderede segment; bestemmer denne balance trykket hvor de røde celler forsigtigt svinge i karhulrummet og måler det hydrostatiske tryk mikrokar (P _c) ved den distale ende af mikrokar segment. Oprethold fartøj perfusion på alle tryk over denne balance pres.

7. Microocclusion og indsamling af data

1. Valgfrit trin: Før du bruger mikro-okklusionsindretning at blokere skibet, tryk den ind i vævet i en ikke-anvendt område mesenterium langt fra et fartøj så spidsen akkumulerer en fin pude af væv, der beskytter den eksperimentelle fartøj under gentagen mikro- tilstopninger.
2. Placer blokker over perfunderet fartøj nær den nedre kant af mikroskopfelt.
3. Noter følgende med video og lyd.
   1. Verbalt registrere placeringen af ​​blokken stedet og den nedre skærmkanten som set på okularet sigtemiddel.
   2. Med spidsenaf blokerings placeret lige over mikrokardannelse bruge fine z kontrol af mikromanipulator til forsigtigt sænke blokker indtil flowet i fartøjet er tilstoppet. Bemærk manometer tryk (P _c) lyd. Ansøg okklusion typisk for 3-10 sek, og slip derefter, genoprette fri perfusion. Flyt blok websted op fartøjet mod pipettespidsen i 5-10 um trin på tid (> 5 min efter indledende blok på et sted), antal okklusioner (3-5), for at forhindre karvæggen skader på blokken websted .

8. Analyse af data og måling af L _{p (Vandtæthed)}

1. Under videoafspilning, fastlægge den indledende afstand (ℓ _{0) fra} en markør af røde blodlegemer til okklusionsområde ved brug af et billede af en scene mikrometer og de ​​kendte positioner på billederne. Bestem den indledende hastighed (dl / dt) af markøren celle fra sin position i flere rammer i løbet af 3-10 sekunder af optagede billeder. Afskrækkeminen radius fartøj (R) fra de billeder, taget under okklusion (figur 3).
2. Beregn J _v / S for hver okklusion (dl / dt) x (1 / ℓ ₀₎ × (r / 2). Beregn L _p ved et konstant tryk som (J _{v /} S) divideret med den drivende tryk (mikrokar tryk - effektiv kolloid osmotisk tryk, se Diskussion).

Representative Results

Figur 4 viser resultaterne fra måling af tidsforløbet for ændringer i L _p i en rotte venular mikrokar kanyleret successivt med fire perfusater. ³³ Størrelsen af L _{P beregnet} ved et konstant tryk blev anvendt som et mål for ændringer i mikrokardannelse permeabilitet, første i kontrolgruppen stat med en perfusatet indeholdt 1% bovint serumalbumin og derefter når beholderen blev udsat for inflammatoriske middel bradykinin (BK) anvendelse af en anden mikropipette indeholdende 10 nM Bk. Bradykinin forårsagede en forbigående stigning i L _s, der vendte tilbage til kontrol værdi over den efterfølgende 10-15 min. Beholderen blev derefter re-perfunderet med kontrol perfusatet i 30 min for at genskabe en stabil basislinie. Når mikrokar blev perfunderet ved hjælp af en fjerde mikropipette med den samme koncentration af Bk samt 1 uM sphingosin-1-phosphat (S1P) i perfusatet, var svaret på Bk væsentligt svækket. Graden afdæmpning når Bk og ​​S1P blev perfunderet samtidig fandtes at svare til den, der måles i andre eksperimenter, hvor S1P blev tilsat til perfusatet op til 20 minutter før udsættelse for Bk. Disse resultater demonstrerer magt at kunne foretage flere målinger af L _p på en enkelt fartøj, og viser, at virkningen af et middel, såsom S1P at stabilisere karvæggen i tilstedeværelse af en inflammatorisk middel kan løses til tidsperioder på størrelsesordenen nogle få sekunder. I separate skibe kontrol blev udført med en lignende protokol i fraværet af S1P at vise, at dæmpningen af ​​Bk respons ikke skyldtes anafylaksi.

For nogle eksperimentelle design er det vigtigt at vurdere både det opløste refleksion koefficient for et makromolekyle (σ) og L _s. Dette opnås bedst ved at måle J _v på flere pres på de enkelte mikrokar. Figur 5 viser et eksperiment in hvor både L _p og effektive onkotiske tryk på 5% albumin i perfusatet (π _albumin = 27 CMH ₂ O ved 37 ° C) blev anslået under betingelser, hvor der ikke var nogen albumin i væv, der omgiver rotte mikrokar. I disse forsøg J _{v /} S blev målt ved tre forskellige tryk. L _p er hældningen af forholdet mellem J _{v /} S og tryk, og skæringspunktet på trykaksen er den effektive onkotiske trykforskel over karvæggen (σΔπ).

Figur 1. Microtools til perfusion af individuelle mikrokar. (A) en mikropipette til kanylering af rotte mikrokar med en affaset spids. (B) en fastholdelsesanlæg til at holde mesenterium væv stabilt nær stedet for kanyle. (C) Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Intravital rig til mikroperfusionskammeret. (A) Oversigt over dyr bakke med mikromanipulatorer og microtools orienteret i løbet af glas søjle. (B) Stor metal scene monteret på teknik bordet og understøttende lejer. (C) bedøves rotte med microtools i position til mikroperfusionskammeret en mikrokardannelse. (D) Luk visning af mesenterium under et eksperiment. Klik her for at se en større version af denne Figu re.

Figur 3. Måling af filtreringshastighed per arealenhed brug af modificeret Landis teknik. Denne skematiske viser en enkelt mikrokar kanyleret med en mikropipette og en okkluderende stang anbragt over beholderen. Umiddelbart efter at okkludere mikrokar, afstanden (ℓ ₀₎ mellem markøren RBC rejser på centerlinien af okkluderede mikrokar og okklusionsområde registreres således at cellen bane kan følges for 5-10 sek efter okklusion. Udgangsstillingen (ℓ ₀₎ og starthastighed (dl / dt) af cellen anvendes til at beregne den gennemsnitlige filtrationshastighed per arealenhed af mikrokar mur mellem markøren cellen og stedet for okklusion. Den microoccluder hæves derefter, og gratis perfusion etableret før yderligere målinger foretages.dk / filer / ftp_upload / 53210 / 53210fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4. Repræsentative data viser, at sphingosin-1-phosphat (S1 P) inhibering virker meget hurtigt bradykinin (BK; 10 nM). Forårsagede en forbigående stigning i mikrokar L _s. S1P påføres som sideløbende med anden bradykinin (Bk) test hæmmede den akutte Bk respons i forhold til første Bk. Disse data viser, at tiden for udsættelse for et testmiddel kan modificeres til at vurdere kinetikken for aktivering af en inhiberende reaktion. Specifikt S1P anvendt samtidig kun Bk stærkt inhiberede Bk respons. S1P var 1 uM og Bk var 10 nM. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5. Måling af J _{v /} S på flere tryk giver både L _p og effektive onkotiske tryk, der skal måles. Filtreringen flux, J _{v /} S, blev målt i denne beholder ved forskellige mikrokarrør hydrostatiske tryk under perfusion med BSA (50 mg ml ^{- 1,} π = 27 CMH ₂ O), mens mesenteriet blev badet med protein-fri Ringers opløsning. Hældningen af forholdet mellem J _{v /} S og trykket er L _p og skæringspunktet af trykket aksen angiver den effektive onkotiske trykforskel over karvæggen. I dette forsøg Lp var 1,2 x 10 ^-7 (cm sec ^-1 CMH ₂ O ^-1) og σΔπ var 24 CMH ₂ O. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53210/53210fig5large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Nærmere oplysninger om L _p beregninger. Selv transvascular væske bevægelse opstår mens fartøjet frit perfusioneres, sådan udveksling er alt for lille til at blive målt ved fri perfusion, fordi det typisk er mindre end 0,01% af fartøjet perfusionshastigheden. Men når perfusion forbigående stoppes ved at okkludere mikrokar, transvascular flow (dvs. filtrering) måles, fra bevægelsen af markør røde blodlegemer i lumen som søjlen af væske mellem en markør røde blodlegemer og stedet for okklusion forkorter som vist i Figur 3. Afhængigt af kompleksiteten og længden af forsøgsprotokollen en uforgrenet fartøj 600 til 1.000 um i længden er nødvendig.

Når skibet ikke er lukket og manometer tryk drivende strømning gennem mikrokar, trykfaldet over pipettespidsen er stor, så mikrokar tryk under frie perfusion er typisk kun enfå CMH _{2 0} over det nedstrøms tryk. I modsætning hertil under en okklusion trykfaldet over pipetten er meget lille på grund af væske langsomt ind karhulrummet at erstatte væske filtrering tværs af karvæggen. Således under okklusion det hydrostatiske tryk i beholderen lumen (P _c) er lig, der er indstillet af manometer. Den onkotisk tryk i mesenteriske væv er ubetydelig, så umiddelbart efter okklusion, er transvascular flydende bevægelser fra markør røde celler målt hvor det hydrostatiske tryk er kendt og onkotiske tryk i lumen fartøjet er lig med den indstillede i perfusatet. Med successive målinger af L _p, er fartøjets længde tabt hver gang blokken websted er avanceret. Desuden successive recannulation reducerer fartøjets længde til rådighed.

Væskestrømmen transvascular per arealenhed af karvæggen (J _{v /} S) er estimeret fra den kurs, at en målt længde af søjlen af vand i microvEssel lumen mellem en markør af røde blodlegemer og okklusionsområde enten forkorter (netto filtrering) eller forlænger (netto reabsorption). Det antages, at neutralt blomstrende røde celler bevæger sig langs midterlinien af ​​karhulrummet kan bruges til at spore den gennemsnitlige hastighed af vandsøjlen der omgiver cellen (forholdet mellem røde blodlegemer hastighed til at betyde vandhastighed er tæt på 1,8 for en 6 pm røde blodlegemer i en 30 um diameter beholder). ^8,14 Så hvis hastigheden af en markør celle (i um / sek) mod blocker er V um / s i løbet af den første 2-5 sek efter okklusion, og radius fartøjet R, mængden af væske filtreres på tværs af mikrokar væg mellem denne røde blodlegemer og stedet for okklusion (J _v) er πr ² V um ³ / sek under forudsætning af mikrokar er cylindrisk. Yderligere arealet af en cylindrisk mikrokar (S) mellem denne markør celle og okklusionen site er 2πrℓ, hvor ℓ er den indledende afstanden mellem markøren celleog okklusionsområde. Således den gennemsnitlige oprindelige transvascular flow per arealenhed (J _{v /} S) ved det tryk, som den vandmanometer Vr / (2ℓ).

Den enkleste skøn over fartøjets L _p foretages, hvis onkotiske tryk af perfusatet er sat lavt i forhold til mikrokar tryk (typisk 3,6 CMH ₂ O, onkotiske tryk af bovint serumalbumin i en koncentration på 10 mg / ml og en kapillær tryk større end 30 CMH _{2 O).} L _p beregnes som (J _{v /} S) / (P _c -3) cm / sek / cm _H2O fordi albumin refleksion koefficient (σ _albumin) i kontrolgruppen tilstand er tæt på 0,9. Med denne tilgang hurtige ændringer i L _p med en tidsopløsning i størrelsesordenen 1 min kan måles ved at etablere frie strøm mellem successive foranstaltninger af J _{v /} S ved konstant tryk, som vist i de repræsentative resultater i figur 4. Ovennævnte fremgangsmåde igNores små ændringer i onkotiske tryk af albumin, som falder til mindre end 1 CMH _{2 O,} når refleksion koefficient falder til under 0,5, men fejl i estimatet af L _p forbliver mindre end 5%, når P _{c er} større end 30 CMH _{2 O} .

Når nøjagtig måling af både L _p og refleksion koefficient er påkrævet, J _{v /} S måles ved en række mikrokarrør tryk under det forventede effektive onkotiske tryk af testen makromolekyle. Hældningen af forholdet mellem J _{v /} S og tryk foranstaltninger L _p og skæringspunktet på trykaksen når Nettostrømmen nul foranstaltninger σπ (figur 5). Påvisningen af, at Jv er lineært relateret til trykket er også en vigtig validering af anvendelsen af enkelte trykmålinger ved hjælp af enklere ovenfor beskrevne protokol (figur 4), når onkotiske trykforskel er lav i forhold til hydrostatisk trykure.

Mulige fejlkilder. Der er flere problemer, der kompromitterer nøjagtig måling. Manglende korrekt okkludere karret eller beskadigelse af karvæggen på okklusionsområde resulterer i lækage forbi okklusionsområde, og bevægelse af markør celler mod okklusionsområde hurtigere end at på grund af transvascular udveksling. Henviser markør celler, der normalt bevæger sig langsomt mod okklusionsområde, men ikke når det er en lækage indiceret, hvis markør-celler spore hele vejen til okkluderen. På den anden side, at manglende forsegle pipetten i mikrokarrør lumen på kanyleringssted resultater i undervurdering af J _{v /} S. Væskelækage fra pipetten til superfusate eller karhulrummet opstrøms for kanyleringssted bevirker en betydelig trykfald over pipettespidsen. Detekteres en sådan lækage, når celler i mikropipettespidsen strømning ved en højere hastighed end i tilstødende beholder lumænd af den okkluderede fartøj. Omhyggelig repositionering af mikropipetten normalt tætner en sådan lækage. Et andet problem opstår, hvis L _p af karvæggen ikke er ensartet, sædvanligvis med et eller flere steder med lokal beskadigelse eller inflammation. Markør celler spor til stedet, hvis de fleste transvascular flow er koncentreret der. Røde blodlegemer bevægelse stadig måler transvascular flow, men foranstaltningen J _v / S er ikke repræsentativ for det meste af muren område inden testen segmentet.

Betydningen af metoden i forhold til eksisterende metoder. De to mest almindeligt anvendte metoder til at undersøge reguleringen af endotel barriere permeabilitet og transvascular udveksling er (1) in vitro-måling af udveksling på tværs af dyrkede endotel cellemonolag og (2) måling af sporstof ophobning i en vævsprøve efter sporstof injiceres intravenøst ​​i hele dyret. Forsøg i dyrkede endotheliale cellemonolag er favored fordi de cellulære funktioner kan mere direkte modificeres og der er tilstrækkelig cellulært materiale til detaljeret evaluering af molekylære begivenheder i endotelceller. Men under de fleste dyrkningsbetingelser endothelcellerne ikke normalt danner barrieren repræsenterer vaskulær permeabilitet in vivo. Den modificerede Landis teknikken beskrevet ovenfor, har vist sig at være en robust og pålidelig teknik til at undersøge reguleringen af ​​endotel barrierefunktion i intakte venular mikrokar. I hænderne på en erfaren efterforsker parret målinger af permeabilitet under kontrol og testbetingelser, hvor nogle af de tilgange, der anvendes i cellekultur (f.eks billeddannelse af cellulære komponenter, ændring af signalveje) kan anvendes. Betydningen af ​​eksperimenter i intakte mikrokar er blevet påvist ved at vise betydelige forskelle mellem de mekanismer, der regulerer barriere permeabilitet i individuelt perfunderet microvessels og dem ofte beskrevet i dyrkede endotel monolag. Eksempler omfatter reaktioner på forskydning, thrombin eksponering og bidrag kontraktile mekanismer inflammatorisk hul dannelse ^2-6,9,16. Målinger af sporstof ophobning i en intakt vaskulær seng bevarer mere normale fysiologiske funktion, men direkte undersøgelse af reelle ændringer i vaskulær permeabilitet kompromitteres fordi sporstof ophobning kan stige som følge af øget perfusion (øget overfladeareal for udveksling) med eller uden en forøgelse af permeabiliteten af ​​væggen. Således omfanget af en stigning permeabilitet kan være overvurderet, når vasodilation øger antallet af perfunderede fartøjer og dermed samlede opløste stof akkumulering er større end den på grund af øget vaskulær permeabilitet alene ^34.

Fremtidige ansøgninger. Rækken af muligheder for at ændre cellulær struktur og funktion under de samme betingelser som permeabilitet indienkelte fartøjer er direkte målt under ventes mikroperfusionskammeret at stige. Desuden forventes det, at anvendelsen af ​​metoderne i genetisk modificerede rotter mesenteriet kan løse et langsigtet problem, der har eksisteret i genetisk modificerede mus. Konkret når genmodificerede mus blev tilgængelige det var forventet, at mikroperfusionskammeret kunne udvides til at undersøge mikrokar i deres mesenteriske fartøjer. Mens nogle mikroperfusionskamre forsøg er blevet afsluttet i mikrokar af mus mesenteriet ^35, mus har generelt færre mikrokar i deres mesenterisk væv end rotter, og disse fartøjer er ofte korte og meget forgrenet, i modsætning til mere egnede længere (> 500 um) lige fartøjer, kan findes i rotter. Således eksperimenter for at undersøge modulation af transvascular udveksling i genetisk mus har påberåbt sig analyser såsom Miles ^{34 eller} de teknisk krævende, men mere pålidelige sporstofforsøg som foranstaltningændringer i både vaskulære og ekstravaskulære ophobning af fluorescerende af radioaktivt mærkede testprober ^36.

Modifikationer af fremgangsmåden. I ovenstående protokoller, ændringer i perfusatet sammensætning krævede ændring af mikropipetter. En alternativ metode er at påfylde mikropipetten in situ ved anvendelse af et apparat genopfyldning. Denne procedure er blevet udført som beskrevet i detaljer ^37. Begrænsningen er, at tiden til at ændre sammensætningen af ​​perfusatet i pipetten ikke er så hurtig som opnået med pipette erstatning, men proceduren er især nyttig, hvis det er nødvendigt at perfundere en mikrokar i længere perioder.

Det samme mikroperfusionskammeret nærmede kan udvides til at måle permeabilitet koefficienter fluorescensmærket solut ^31,38-40. I dette tilfælde den enkelte riflede mikropipette erstattes af et dobbelt barrelled (theta) pipette ^{41 og} fartøjet er perfuseresskiftevis med testen fluorescerende opløste stof til at måle vævsakkumulation forhold til lumen indhold, og det samme perfusatet uden fluorescerende opløste stof for at fjerne væv og tillade gentagen måling af opløst stof akkumulering. Når der skal kombineres med målinger af opløst stof permeabilitetskoefficienten ved hjælp fluorescensmærkede test opløste målinger af transvascular vandstrømme, fluorescerende indikatorer for intracellulær præparat eller konfokal billeddannelse af cellulære komponenter, er en mere sofistikeret computerstyret fluorescensmikroskop påkrævet. Da disse undersøgelser kræver normalt linser med højere forstørrelse og meget kortere arbejdsafstand, er kvarts søjle bruges til at holde mesenterium erstattet af et glas dækglas limet til en plexiglas støtte i vævet godt på mikroskopet bakken. Den øgede tilgængelighed af 3-D printere, vil give høj præcision fremstilling af brugerdefinerede bakker, der opfylder den smalle tolerance kræves for at positionere større diameter linser med kortere arbejdsafstand i forhold til udvalgte mikrokar.

Tilgængeligheden af ​​brugbare mikrokar i mesenterium varierer med alder, køn og stamme. Derfor, idet valg af stamme af rotter og anvendelsen af ​​mandlig eller kvindelig vil afhænge af de specifikke spørgsmål, der stilles. For mange af vores nylige undersøgelser har vi anvendt Sprague-Dawley rotter, som er akklimatiseret i vores dyrefacilitet mindst en uge før anvendelse ved ca. alder 3-4 måneder, på hvilket tidspunkt finder vi de generelt har rådighed lange, lige mesenteriske mikrokar. Derimod har vores kolleger med held anvendt Sprague-Dawley rotter af 2-3 måneder ^på 13 år.

Rollen af de røde celler. Den primære rolle af røde celler som beskrevet ovenfor var at spore transvascular vandbevægelse antager cellen fungerede som inert, neutralt opdrift indikatorer for vandstrømme efter mikrokar blev okkluderet. Ud over dette grundlæggende rolle, detanerkendes nu, at de røde celler bidrage til stabiliteten af barrieren ved at levere S1P til perfusatet, når albumin i foreliggende ^31,42,43. Der er flere vigtige implikationer af disse observationer. I mangel af røde celler eller med anvendelse af alternative inert flow markører baseline permeabilitet vil sandsynligvis være mindre stabile. Det anbefales, at målinger af S1P bør foretages i alle perfusater anvendes i mikroperfusionskamre eksperimenter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health tilskud HL44485 og HL28607.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MICROSCOPE, TABLE AND STAGE
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Olympus	CK-40	try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Leica	DMIL	try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
narrow diameter, long working distance objective: example	Nikon	Nikon E Plan 10×/0.25 LWD
stage platform--1/2 inch or 1 cm sheet steel	welding shop		this should be heavy to reduce vibration
Unislide x-y table: dove tail slides	Velmex	AXY4006W1
VIDEO
CCD video camera: example	Pulnix	TM-7CN (no longer available)	no color needed
video capture system with audio--generic
video playback system (completely still frame, single frame motion)
small microphone
MICROMANIPULATORS, HOLDERS
micromanipulator, XYZ (3)	Prior/Stoelting (no longer available)		look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning
hydraulic probe drive, one way	FHC	50-12-1C	need to buy either manual drive or electronic drive
manual drum drive	FHC	50-12-9-02
or hydraulic drive, 3 way	Siskiyou Corporation	MX610 (1-way) or MX630 (3-way)	great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years
connectors/rods/holders	Siskiyou Corporation	MXC-2.5, MXB etc.
pin vise	Starrett	162C	to hold restrainer
pipette holder	World Prescision Instruments	MPH3
water manometer ~120 cm
MICROSCOPE TRAY
clear Plexiglas for microscope tray for animal
3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall	Quartz Scientific Inc.	custom	(or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective
Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)
medical adhesive for tissue well	NuSil	MED-1037
All-purpose silicone rubber heat mat, 5" L x 2" W	Cole Parmer	EW-03125-20	heater for microscope tray--needs cord and controller--240V version available
Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC	Cole Parmer	EW-03122-75
STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out	Cole Parmer	EW-01575-00
PIPET MANUFACTURE
vertical pipette puller	Sutter Instrument Company	P-30 with nichrome filament
1.5 mm OD thin wall capillary tubing	Sutter Instrument Company	B150-110-10
pipette grinder air stone and dissection microscope--see reference in text			or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments
RX Honing Machine, System II	RX Honing Machine Corporation	MAC-10700 Rx System II Machine	alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle
with ceramic sharpening disc	RX Honing Machine Corporation		use "as is" or attach lapping film
lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um	3M	part no. 051144 80827	268X Imperial lapping film sheets with adhesive back--can be purchased from Amazon

References

1. Curry, F. R. Permeability measurements in an individually perfused capillary: the 'squid axon' of the microcirculation. Experimental physiology. 93, 444-446 (2008).
2. Curry, F. R., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
3. Curry, F. R., Adamson, R. H. Tonic regulation of vascular permeability. Acta physiologica. 207, 628-649 (2013).
4. Michel, C. C. Fluid exchange in the microcirculation. The Journal of physiology. 557, 701-702 (2004).
5. Tarbell, J. M., Simon, S. I., Curry, F. R. Mechanosensing at the vascular interface. Annual review of biomedical engineering. 16, 505-532 (2014).
6. Sarelius, I. H., Kuebel, J. M., Wang, J., Huxley, V. H. Macromolecule permeability of in situ and excised rodent skeletal muscle arterioles and venules. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 290, H474-H480 (2006).
7. Curry, F. E., Frokjaer-Jensen, J. Water flow across the walls of single muscle capillaries in the frog, Rana pipiens. The Journal of physiology. 350, 293-307 (1984).
8. Michel, C. C., Mason, J. C., Curry, F. E., Tooke, J. E., Hunter, P. J. A development of the Landis technique for measuring the filtration coefficient of individual capillaries in the frog mesentery. Q J Exp Physiol Cogn Med Sci. 59, 283-309 (1974).
9. Adamson, R. H., Zeng, M., Adamson, G. N., Lenz, J. F., Curry, F. E. PAF- and bradykinin-induced hyperpermeability of rat venules is independent of actin-myosin contraction. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 285, H406-H417 (2003).
10. Huxley, V. H., Rumbaut, R. E. The microvasculature as a dynamic regulator of volume and solute exchange. Clinical and experimental pharmacology, & physiology. 27, 847-854 (2000).
11. Rumbaut, R. E., Wang, J., Huxley, V. H. Differential effects of L-NAME on rat venular hydraulic conductivity. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. , 279-H2023 (2000).
12. Yuan, D., He, P. Vascular remodeling alters adhesion protein and cytoskeleton reactions to inflammatory stimuli resulting in enhanced permeability increases in rat venules. Journal of applied physiology. 113, 1110-1120 (2012).
13. Zhou, X., He, P. Temporal and spatial correlation of platelet-activating factor-induced increases in endothelial [Ca(2)(+)]i, nitric oxide, and gap formation in intact venules. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 301, H1788-H1797 (2011).
14. Adamson, R. H., et al. Oncotic pressures opposing filtration across non-fenestrated rat microvessels. The Journal of physiology. 557, 889-907 (2004).
15. Adamson, R. H., et al. Epac/Rap1 pathway regulates microvascular hyperpermeability induced by PAF in rat mesentery. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 294, H1188-H1196 (2008).
16. Curry, F. E., Zeng, M., Adamson, R. H. Thrombin increases permeability only in venules exposed to inflammatory conditions. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 294, H1188-H1196 (2003).
17. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature. 32, 347-355 (2014).
18. Bagher, P., Davis, M. J., Segal, S. S. Intravital macrozoom imaging and automated analysis of endothelial cell calcium signals coincident with arteriolar dilation in Cx40(BAC) -GCaMP2 transgenic mice. Microcirculation. 18, 331-338 (2011).
19. Duza, T., Sarelius, I. H. Increase in endothelial cell Ca(2+) in response to mouse cremaster muscle contraction. The Journal of physiology. 555, 459-469 (2004).
20. Oshiro, H., et al. L-type calcium channel blockers modulate the microvascular hyperpermeability induced by platelet-activating factor in vivo. Journal of vascular surgery. 22, 732-739 (1995).
21. Chen, W., et al. Atrial natriuretic peptide-mediated inhibition of microcirculatory endothelial Ca2+ and permeability response to histamine involves cGMP-dependent protein kinase I and TRPC6 channels. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 33, 2121-2129 (2013).
22. Harris, N. R., Whitt, S. P., Zilberberg, J., Alexander, J. S., Rumbaut, R. E. Extravascular transport of fluorescently labeled albumins in the rat mesentery. Microcirculation. 9, 177-187 (2002).
23. Yuan, W., Li, G., Zeng, M., Fu, B. M. Modulation of the blood-brain barrier permeability by plasma glycoprotein orosomucoid. Microvascular research. 80, 148-157 (2010).
24. Sugiura, Y., Morikawa, T., Takenouchi, T., Suematsu, M., Kajimura, M. Cilostazol strengthens the endothelial barrier of postcapillary venules from the rat mesentery in situ. Phlebology / Venous Forum of the Royal Society of Medicine. 29, 594-599 (2014).
25. Guo, M., et al. Fibrinogen-gamma C-terminal fragments induce endothelial barrier dysfunction and microvascular leak via integrin-mediated and RhoA-dependent mechanism. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 29, 394-400 (2009).
26. Dewar, A. M., Clark, R. A., Singer, A. J., Frame, M. D. Curcumin mediates both dilation and constriction of peripheral arterioles via adrenergic receptors. The Journal of investigative dermatology. 131, 1754-1760 (2011).
27. Lee, J. F., et al. Balance of S1P1 and S1P2 signaling regulates peripheral microvascular permeability in rat cremaster muscle vasculature. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 296, H33-H42 (2009).
28. Landis, E. M. Microinjection studies of capillary permeability. II. The relation between capillary pressure and the rate at which fluid passes through the walls of single capillaries. Am J Physiol. 82, 217-238 (1927).
29. Curry, F. E., Huxley, V. H., Sarelius, I. H. Techniques in cardiovascular physiology Part 1. Linden, R. J. P3/1, Elsevier Scientific Publishers Ireland Ltd. 1-34 (1983).
30. Vurek, G. G., Bennett, C. M., Jamison, R. L., Troy, J. L. An air-driven micropipette sharpener). J Appl Physiol. 22, 191-192 (1967).
31. Curry, F. E., Clark, J. F., Adamson, R. H. Erythrocyte-derived sphingosine-1-phosphate stabilizes basal hydraulic conductivity and solute permeability in rat microvessels. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 303, H825-H834 (2012).
32. Bagher, P., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Microiontophoresis and micromanipulation for intravital fluorescence imaging of the microcirculation. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
33. Adamson, R. H., et al. Attenuation by sphingosine-1-phosphate of rat microvessel acute permeability response to bradykinin is rapidly reversible. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 302, H1929-H1935 (2012).
34. Bates, D. O. Vascular endothelial growth factors and vascular permeability. Cardiovasc Res. 87, 262-271 (2010).
35. Adamson, R. H., et al. Rho and rho kinase modulation of barrier properties: cultured endothelial cells and intact microvessels of rats and mice. The Journal of physiology. 539, 295-308 (2002).
36. Curry, F. R., et al. Atrial natriuretic peptide modulation of albumin clearance and contrast agent permeability in mouse skeletal muscle and skin: role in regulation of plasma volume. The Journal of physiology. 588, 325-339 (2010).
37. Neal, C. R., Bates, D. O. Measurement of hydraulic conductivity of single perfused Rana mesenteric microvessels between periods of controlled shear stress. The Journal of physiology. 543, 947-957 (2002).
38. Adamson, R. H., et al. Albumin modulates S1P delivery from red blood cells in perfused microvessels: mechanism of the protein effect. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 306, H1011-H1017 (2014).
39. Huxley, V. H., Wang, J. J., Sarelius, I. H. Adaptation of coronary microvascular exchange in arterioles and venules to exercise training and a role for sex in determining permeability responses. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 293, H1196-H1205 (2007).
40. Huxley, V. H., Williams, D. A. Basal and adenosine-mediated protein flux from isolated coronary arterioles. Am J Physiol. 271, H1099-H1108 (1996).
41. Davis, M. J., Gore, R. W. Double-barrel pipette system for microinjection. Am J Physiol. 253, H965-H967 (1987).
42. Adamson, R. H., et al. Sphingosine-1-phosphate modulation of basal permeability and acute inflammatory responses in rat venular microvessels. Cardiovasc Res. 88, 344-351 (2010).
43. Zeng, Y., Adamson, R. H., Curry, F. R., Tarbell, J. M. Sphingosine-1-phosphate protects endothelial glycocalyx by inhibiting syndecan-1 shedding. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. , H306-H363 (2014).

Tags

Molekylær Biologi mikroperfusionskammerindretning rotte mesenterium hydraulisk ledningsevne permeabilitet Landis teknik