Abstract
個別灌流微小血管の透過性を測定するための実験は、培養内皮細胞単層全体微小血管床の機能交換特性における血管透過性を調節する分子・細胞メカニズムの調査の間のブリッジを提供します。カニューレを挿入し、ラット腸間膜の細静脈微小血管を灌流し、微小血管壁の透水係数を測定する方法が記載されています。必要な主要機器は、3つの異なるマイクロツールを配置するためにマイクロマニピュレーターをサポートし、大きな修正段階で生体顕微鏡含まれています：微小血管にカニューレを挿入し、潅流する（1）面取りガラスマイクロピペットを、 （2）ガラスマイクロオクルーダ一過かん流を遮断し、測定された静水圧で経水流の運動の測定を可能にし、（3）鈍いガラス棒は、カニュレーション部位で腸間膜組織を安定化させることにします。修正されたランディスマイクロ閉塞techniqUEは、微小血管を横切るように、これらの実験条件は変更される流れと静水圧とコロイド浸透圧の差の繰り返し測定を慎重に制御される可能も経流体運動のマーカーとして人工灌流液中に懸濁させた赤血球を使用し、。第一制御灌流液を使用して、透水係数の測定、試験灌流液と同じ微小血管の再挿管後に、これらのよく制御された条件下での微小血管応答の一対比較を可能にします。なぜなら、マウスの腸間膜に長いストレートと分岐していない微小血管の不在で厳しく制限された血管透過性を変更することが予想遺伝子改変マウスでの腸間膜に微小血管にメソッドを拡張しようとしますが、使用して、同様の遺伝子改変ラットの最近の可用性CRISPR / Cas9技術は、本明細書に記載の方法を適用することができる研究の新しい分野を開くことが期待されます。
Introduction
血管系における微小灌流は、通常、直径が40μm未満の血管内にマイクロピペットを介し既知の組成の人工灌流液の流れを制御する確立することを伴います。灌流容器は通常の組織環境内のままで、挿管時に動物の血液を上にして灌流されます。ビデオイメージングまたは蛍光技術の範囲と併せて使用される場合、 その場での微小灌流にこれらのフローのための駆動力が知られており、血管壁の透過性特性があることができる条件下で、微小血管の壁を横切って水と溶質の流れを測定することができます直接評価。さらに、組織（灌流液とsuperfusate）で微小血管の周囲の流体の組成を制御することにより、微小血管の透過性や為替の規制は、電子の多様にさらされる微小血管の壁を形成する内皮細胞を有効にして調べることができますxperimental条件の時間の正確に測定期間（時間秒）のために（アゴニスト、修正された灌流条件、蛍光指示薬は、細胞内の組成およびシグナル伝達を測定します）。加えて、障壁を調節する重要な細胞の分子構造の超微細または細胞化学的評価は、透過性が直接測定されるのと同じ微小血管に調べることができます。アプローチは、それによって、培養内皮細胞単層および無傷の微小血管における調査に内皮バリア機能を変更するための細胞および分子メカニズムの調査の間にブリッジを形成しています。さらなる評価1-6については、以下のレビューを見ます。
微小灌流の制限は、それだけで、薄く透明であり、ガラスマイクロピペットでのカニューレ挿入を可能にするのに十分な構造的完全性を有している微小血管床で使用することができることです。初期の研究は、腸間膜と薄い皮膚狭心症Mにカエルの微小血管を使用している間7,8 uscle、はるかに哺乳動物のモデルの中で最も一般的に使用される製剤は、ラットの腸間膜9-15です。ほとんどの調査は1-4時間の期間にわたって研究し、血管透過性の急性変化に焦点を当ててきたが、より最近の研究は、初期灌流12,16の後に個々の容器での測定に24〜72時間を拡張されています。血管透過性の調節17を研究するためのより多くの遺伝的に改変されたラットモデルを利用できるようにすることを約束し、最近開発されたCRISPR技術は、これらの重要な新しいラットモデルで腸間膜の細静脈微小血管に適用されるこの通信に記載されている方法を有効にする必要があります。
方法は、動物の準備と灌流容器に近い位置のマイクロツールに使用される少なくとも三つのマイクロマニピュレーターの両方を保持するために、容器に灌流マイクロピペットを整列させるために十分な大きさの特注の顕微鏡ステージを備えた倒立顕微鏡を必要としますルーメン。例えばXY顕微鏡ステージ（約90×60センチメートル）のカスタムプラットフォームは防錆コーティングで厚さ1cmの鋼板から製造することができます。ステージは、エンジニアリングインデックステーブルまたは水平面内での移動のためにテフロンピラーやボール転送に直角に取り付けられており、サポートされている2つの鳩尾スライドに取り付けられています。典型的なリグ（図2参照）は、血管平滑の単一血管の血流およびヘマトクリット、血液灌流微小血管による局所的酸素運搬、規制を測定するものなど生体内微小循環実験の範囲に使用する顕微鏡や微細位置決め装置と多くの共通点を持っています筋緊張、および全体の循環に注入された蛍光トレーサーの局所的な微小血管の蓄積。18-26
技術の基本的な側面は、微小血管壁の定義された表面積（S）全体の体積流量（JのV）の測定です。達成するためにこれは、本明細書に記載の修正ランディス技術によって、単純な倒立顕微鏡で十分です。小型ビデオカメラは、追加された時間基準と、画像ポートとビデオ信号上に搭載されたビデオモニタに表示され、コンピュータ上のデジタル形態又はビデオレコーダのデジタルまたはアナログ信号のいずれかとして記録されています。微小血管がカニューレを挿入されると、カメラに見える微小血管の一部が挿管を中断することなくユニットとしてステージとマニピュレータを移動することによって変更することができます。
経フローの測定はまた、溶質透過性の測定に使用リグ、蛍光細胞質カルシウムまたは他の細胞機構の比率を監視し、共焦点イメージング6,12,13、などの適切なフィルタを使用して洗練された蛍光顕微鏡を使用して、より詳細な調査と組み合わせてもよいです27。すべての微小灌流アプローチの重要な利点は、同じ容器に、反復測定を行うことができることですこのような静水圧および膠質浸透圧、または炎症状態に血管応答の誘発性変化として駆動力の制御された変化の下で。最も一般的な設計は、第二のピペットで、その後、ベースラインの透過性の状態を確立するために、第一の制御灌流液と赤の細胞懸濁液を充填したマイクロピペットを介して灌流容器と同じ容器に測定透水（のL p）の一対比較であります試験薬剤と灌流液に加えます。複数のカニューレ挿入は、制御ピペットで再灌流後に繰り返しサイクルで可能です。
現在のプロトコルでは、微小血管の壁を越えた水フラックスを記録し、血管壁のL P、そのまま全体の水と溶質のための共通の経路の透過性の有用な指標を測定するために、ラットの腸間膜に小静脈血管のカニュレーションおよび微小灌流を実証内皮障壁。手順が変更されたランディスtechniqと呼ばれています灌流がブロックされた後、経流体の交換の目安として、赤血球の相対的な動きを使用して、元のランディス原理は28に保存されているので、UEが、実験条件（例えば、微小血管壁全体の静水圧およびアルブミン膠質浸透圧の差）の範囲微小灌流後に使用可能にuncannulated血液灌流微小血管8,29に比べてはるかに大きいです。
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Protocol
倫理の声明：すべての手順を検討し、施設内動物管理使用委員会によって承認されました。
マイクロピペット、レストレーナー、およびブロッカーの1予備作製
- 引っ張ったときにそのように調整電子プラーを使用して半分にいくつかのきれいなホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブを引っ張り、チューブの延伸部分の長さは約1cmであり、2つの半体がいくらか対称的です。テーパーは、 図1の寸法と一致していることを確認してください。マイクロピペット、レストレーナーとブロッカーの両方の半分を使用してください。
- ベベル水で浴び0.5μmの研磨紙で空気駆動砥石 30 を用いて、マイクロピペット。それは水平から約30度になるようにマイクロピペットホルダーの角度を設定します。
- 徹底的に先端を通って、シャフトまできれいなアセトンを引っ張るために吸引を使用してマイクロピペットを洗浄し、乾燥させます。 （マイクロピペットを点検ワニ口クリップのマイクロピペットホルダーと接眼レチクルを装着した4×40×目標に小さな直立顕微鏡を用いて図1A）。
- 約50μm、長、長さ/幅の比が3.1〜3.5と腸間膜にタフなコラーゲン繊維に浸透するのに役立ちます鋭くテーパー点であるベベルと先端開口部を持つマイクロピペットを選択します。
- 無塵箱に少し様々なサイズの15〜20マイクロピペットを格納します。
- ステップ1.1で調製した引っ張っ毛細管）を使用して、レストレーナーを作ります。平滑末端（ 図1B）を形成するためにマイクロフレームの近くに簡単に引っ張らガラスキャピラリーチューブを保持します。ダストフリーボックス内のいくつかを保管してください。
- ステップ1.1で調製した引っ張っ毛細管）を使用してmicrooccludersを行います。 （例えば、チューブアダプタを使用して、23G）マイクロフレームの下に引っ張らキャピラリーチューブを握り、ゆっくりと曲げ先端の細い（先端から約4mmに）軸に近い120度の角度を作るために（
2.動物の準備と手術
- 皮下注射を介してペントバルビタールナトリウム（80〜100ミリグラム/キログラム、Sigma-Aldrich社、P3761）と男性（350〜450グラム）または雌性Sprague-Dawleyラット（200〜300グラム）を麻酔。腹腔内注射を使用しないことで腸間膜を保護します。
- 外科的手法と実験プロトコルを通して、必要に応じて補助的な注射（30 mgの/ kg）で麻酔を維持します。つま先のピンチや角膜反射によって麻酔の深さを決定します。実験手順の完了後、ペントバルビタールの過剰投与または麻酔下で飽和塩化カリウムの心臓内注射を介してラットを安楽死させます。
3.フローマーカーとして使用するためのソリューションおよび赤血球を準備
- 10 mg / mlの脂肪酸を含むsuperfusateための哺乳類リンゲル液を調製し、灌流解決を制御する（通常は哺乳類リンゲル液無料のウシ血清アルブミン、BSA）。
- マイクロピペットチップをブロックする可能性があります小さな粒子を除去するために0.2μmのシリンジフィルターを通して灌流液フィルタ。小さなきれいな容器にフィルタリングします。
- 0.05ミリリットルのヘパリン（千U / ml）を含む小型の注射器に20G針に麻酔をかけたラットの尾静脈から約0.2ミリリットルの血液を描画することにより、赤血球を準備し、約14 mLの哺乳類リンゲル液溶液を含む15mlの遠心チューブに移します。
- 優しく（7分間最大200×gで約）赤血球をパックする遠心分離機。上清をオフに描画し、リンゲル液中の赤血球を再懸濁。
- 上清3回遠心分離し、除去した後、後で使用するために、チューブの底に詰め赤血球を残します。この手順が正常レベル31の0.1％未満に、最終的な灌流液中の血小板が減少することに注意してください。
4.動物の組織をアレンジトレイ
- 剣状突起にへそ下から麻酔したラットの腹部を剃ります。髪はよく組織の外にsuperfusateを描画するために芯を形成しないように剃った領域（右側に配置されたラットのための）右側の周りに延びていることを確認してください。濡れたガーゼパッドまたは組織でカット毛を削除します。
- 鈍鋸歯状の鉗子で皮膚を持ち、頑丈なハサミを用いて皮膚を通して（2-3センチ）中心線切開を行います。ファイン（アイリス）はさみを使用すると、腸の損傷を防ぐために、鋸歯状の鉗子で腹壁を持ち上げる、白線を通して同様の切開を行います。
- 動物トレイにその側の動物で、優しくリンゲル液及び鈍鋸歯状の鉗子に浸した綿棒アプリケーター（木の棒）を使用して腹腔から腸を引き出します。腸間膜は腸間膜に触れないように注意しながら顕微鏡で観察するための柱に掛けられるようにウェル組織で腸を配置（potentially鉗子または綿のいずれかで）微小血管を損傷させます。
注：動物トレイ（ 図2A）はプレキシグラスから構成され、（約3ミリメートルの深）組織ウェルを必要とすることができ、光学的に透明な柱（例えば、研磨石英約2cmの直径と高5ミリメートル。）、加温パッド動物の体温を維持するように調整しました。柱の厚さは、目的の作動距離を超えてはなりません。
- 腸間膜が接眼レンズを通して見えるように顕微鏡ステージ上の動物トレイを置きます。
- 連続して35〜37℃に維持哺乳類リンゲル液で腸間膜を表面かん流するために重力供給ドリップラインを配置します。 、所定の位置に腸を保持する水分を保持に役立ち、かつ表面から過剰リンゲル液を吸い上げるために、ガーゼパッドを使用してください。流れを調整し、一貫性のあるsuperfusateの厚さを維持するための廃液を吸引します。
- あるターゲット細静脈微小血管を識別収束流れ下流分岐していないセグメント、真の毛細血管の遠位に一つまたは二つの分岐。分岐していない容器を探す（理想的には、長さが600〜1000μm）の活発な血流と血管壁に付着する白血球の自由を持ちます。
- 顕微鏡視野の中心にテスト微小血管の位置を調整し、選択されたカニューレ挿入部位近くの位置に拘束具を移動します。
5.ホルダーにマイクロピペットとマウントを記入
- ただ、カニューレを挿入する前に、灌流液中の赤血球を中断。きれいなホウケイ酸試験管に0.5ミリリットル灌流液にパックされた赤血球の7μLを加えます。注意：1〜3％のヘマトクリットを使用することができますが、一貫性のヘマトクリットが赤血球から放出された任意の物質の一貫性の灌流液の濃度につながります。
- 23GチューブアダプタとPE 50チューブ（5-15センチの長さ）を1mlシリンジを取り付けます。注射器に赤/灌流液細胞混合物を描画します。ミックスし、チューブからすべての気泡を排出するために注射器を逆さにし、アダプタ。効率向上のために、実験開始前のいくつかの注射器に、フィットチューブと埃のない箱やビニール袋に保管してください。
- それはテーパ領域に当接するまでマイクロピペットの大端部にチューブを前進させることによって、マイクロピペットを埋めます。マイクロピペットチップを埋めるために、シリンジプランジャに優しい迅速なプッシュを適用します。注：小さなストリームまたは液滴が完全な充填を証拠する先端に表示されるはずです。
- 静かにマイクロピペットシャフトの広い部分を埋めるために、プランジャーを押しながらチューブを撤回。慎重にマイクロピペットシャフトをフリックすることにより、広いシャフトの小さな気泡を除去。注：同様の手順32に示されています。
- 水圧力計への連続的な流体接続を可能にするサイドポートを備えたピペットホルダーにマイクロピペットを置きます。マイクロピペットの非常に微細な進歩を制御するために使用される油圧ドライブに接続されているホルダは、わずかな角度（15〜25°）であることを確認します水平にマイクロピペットのテーパーのエッジは、腸やトレイに当たらないようにします。
- 試験容器（ 図2）に近い位置合わせを可能にするためにx、y、zのドライブが可動マイクロマニピュレーター、上油圧ドライブをマウントします。
- 約40 CMH 2腸間膜上記Oに圧力計の水柱内の流体の高さを変更するために、注射器や水を充填したゴム球を用いて、マイクロピペット内の流体に適用される静水圧を調整します。
- ピペットを充填した後、できるだけ早く微小血管にカニューレを挿入。約40分後に非常に少数の赤血球が血管内に流入するように、赤血球は、ピペットの底に沈殿。
6. Microcannulationと微小血管の圧力測定
- 顕微鏡下で満たされたマイクロピペットを配置する前に、そっと握りに組織を十分な力を付与する微小血管の近くの組織に拘束具を押してください。ドロー拘束後、腸間膜コラーゲン繊維の応力を容器に整列されるように、わずかに微小血管に沿って組織を伸ばします。
- 容器をマイクロピペットの位置を合わせ、接眼レンズを通してビューにそれを下げます。選択したカニューレ挿入部位のすぐ上流の先端を置き、それが部分的に血管内の流れを阻害するが、それを閉塞しないように、組織上にそれを下げます。
- 油圧ドライブを使用して血管内腔にゆっくりとピペットチップを駆動することにより、血管にカニューレを挿入。容器の下側を通ってプッシュしないように注意してください。
注：マイクロピペットは、内腔に入ると、灌流液が急速に内腔の外に血管内の血液を洗浄し、自由に灌流液下流の血管中の正常な血液灌流の一部を移動させる、テスト微小血管に動物の循環遠位に流れ込みます。 - 示されているように（血液まで、圧力計を調整することにより、灌流圧を下げます灌流セグメントに引き戻されている）動物の赤血球によります。これは、赤血球を穏やか血管腔に振動バランス圧を決定し、微小血管セグメントの遠位端に微小血管静水圧力（P C）を測定します。このバランス圧力以上のすべての圧力で血管灌流を維持します。
7. Microocclusionとデータの収集
- オプションの手順：先端が繰り返さマイクロ中の実験容器を保護する組織の微パッドが蓄積するように遠い任意の容器から腸間膜の未使用領域における組織にそれを押して、血管をブロックするために、マイクロ閉塞器を使用する前に閉塞。
- 顕微鏡視野の下縁部の近くに灌流容器の上にブロックを配置します。
- ビデオとオーディオを次のように記録します。
- 接眼レチクル上に見られるように口頭でブロック部位の位置と下画面の端を記録します。
- 先端でただ微小血管の上方に配置されたブロッカーの、容器内の流れが閉塞されるまで、そっとブロッカーを低下させるためにマイクロマニピュレータの細かいZコントロールを使用します。オーディオの圧力計の圧力（P cを）注意してください。 3-10秒間、通常、閉塞を適用し、その後放し、自由な灌流を復元します。時間に基づいて5〜10ミクロンのステップでピペットの先端に向かって血管までブロックサイトを移動します（>サイトの最初のブロックの後5分）閉塞の、番号（3-5）、ブロックサイトで血管壁の損傷を防ぐために。
L pのデータと測定の8解析（透水）
- ビデオの再生時には、ステージマイクロメーターと画像上の既知の位置の画像を用いて閉塞部位にマーカー赤血球から初期距離（ℓ0）を決定します 。記録画像の3-10秒の間にいくつかのフレーム内の位置からマーカーセルの初期速度（dℓ/ dt）を決定します。阻止します鉱山閉塞時に撮影した画像から血管の半径（R）（ 図3）。
- （dℓ/ dt）は、各閉塞するためのJ V / Sを算出×（1 /ℓ0）×（R / 2）。駆動圧で割った（JのV / S）などの一定の圧力で、L pを計算する（微小血管の圧力-効果的なコロイド浸透圧、ディスカッションを参照してください）。
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Representative Results
図4は、4つの灌流液で連続的にカニューレを挿入微小血管細静脈ラットにL Pにおける変化の時間経過を測定し結果を示す。33定圧で算出さL pの大きさは、微小血管壁の透過性の変化の指標として使用された、第一容器を10 nMのBkのを含む第二のマイクロピペットを用いて炎症剤のブラジキニン（BK）に暴露したときに1％ウシ血清アルブミンを含有する灌流液での制御状態です。ブラジキニンは、その後の10〜15分かけて制御値に向けて返さL pの中に一時的な増加を引き起こしました。容器はその後、安定したベースラインを再確立するために30分間制御灌流液で再潅流しました。微小血管が同じのBkの濃度だけでなく、灌流液中の1μMのスフィンゴシン-1- phospate（S1P）第4マイクロピペットを用いて灌流した場合には、Bkのへの応答が大幅に減衰しました。度BkのS1Pと同時に灌流した減衰は、BkのS1Pへの曝露の前に20分に灌流までに追加された他の実験で測定されたものと同様であることが見出されました。これらの結果は、単一の容器にL pの複数の測定を行うことができるという力を発揮し、そのような炎症剤の存在下で血管壁を安定化するためのS1Pのような薬剤の作用がオンの期間に解決され得ることを示します数秒のオーダー。別々の容器にコントロール研究は、BK応答の減衰は、アナフィラキシーによるものではなかったことを示すために、S1Pの不在下での同様のプロトコルを用いて行きました。
いくつかの実験的なデザインのためには、高分子（σ）とL pの溶質反射係数の両方を推定することが重要です。これは、個々の微小血管に複数の圧力でJ vを測定することにより、最良に達成される。 図5は、実験Iを示していますnはラットの微小血管の周囲の組織にはアルブミンが存在しなかったときに両方のL pと灌流液中の5％アルブミンの効果的な浸透圧（37℃でのπ アルブミン = 27 CMH 2 O）が条件で推定しました。これらの実験のJ Vの/ Sは、3つの異なる圧力で測定しました。 L pはJのV / Sと圧力との関係の傾きであり、圧力軸上の切片は、血管壁（σΔπ）を横切る有効な浸透圧の差です。
個々の微小血管の灌流のため図1マイクロツール。（A）斜角先端を有するラットの微小血管のカニュレーションのためのマイクロピペット。（B）カニュレーションの部位付近の安定した腸間膜組織を保持するための拘束。（C） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
微小灌流2.生体内リグ図。 （A）ガラス柱の上に指向マイクロマニピュレーターおよびマイクロツールによる動物トレイの概要。（B）大型金属ステージはエンジニアリングテーブルに設置し、ベアリングをサポートしています。微小血管の微小灌流のための位置にマイクロツールと（C）麻酔ラット。（D）を閉じるビュー実験中の腸間膜の。 このfiguの拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください再。
修正されたランディス技術を用いて、単位面積当たりの濾過速度の測定図3は、この概略図は、マイクロピペット、容器の上に配置閉塞ロッドをカニューレ挿入単一微小血管を示しています。すぐに、マーカーRBCが閉塞さ微小血管の中心線上に移動すると、セルの軌跡が閉塞した後、5〜10秒続くことができるように、閉塞部位が記録されるまでの距離（ℓ0）微小血管を閉塞した後。セルの初期位置（ℓ0）、初期速度（dℓ/ DT）は、マーカーセルと閉塞の部位との間の微小血管の壁の単位面積当たりの平均濾過速度を計算するために使用されます。 microoccluderはその後上昇し、追加の測定が行われる前に無料灌流を確立。COM /ファイル/ ftp_upload / 53210 / 53210fig3large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4.代表的なデータは、スフィンゴシン-1-リン酸（S1P）阻害が非常に速く動作することを示しているブラジキニン（BK; 10 nM）を。微小血管L pの中に一時的な増加を引き起こしました。第二ブラジキニン（BK）のテストと同時にとして適用S1Pは、最初のBkに急性Bkの応答相対を阻害しました。これらのデータは、試験薬剤への曝露時間は、阻害応答の活性化の動態を評価するために改変することができることを示しています。具体的には、S1PはBKは強くBkの応答を阻害しただけで、同時を適用しました。 S1Pは1μmであったとBKが10 nmであった。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5.複数の圧力でのJ V / Sの測定は、L pと測定すべき効果的な膠質浸透圧。ろ過流束、J V / Sの両方を可能にし 、BSAと灌流の間の種々の微小血管の静水圧力で、この容器内で測定した（50 MG mlの- 1;π= 27 CMH 2 O）腸間膜は、タンパク質を含まないリンゲル液で浸されました。 JはV / Sと圧力との関係の傾きは、L pは 、圧力軸上の切片は、血管壁を横切る効果的な膠質浸透圧の差を示しています。この実験ではLpが1.2×10 -7（センチ秒 -1 CMH 2 O -1）だったとσΔπは24 CMH 2 Oでした<HREF = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53210/53210fig5large.jpg"ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
L pの計算の詳細。容器が自由に灌流されている間経流体運動が起こるが、それは通常、血管灌流速度の0.01％未満であるため、そのような交換は無料灌流の間に測定することがあまりにも小さいです。しかし灌流は一過性微小血管を閉塞することにより停止したときのように、マーカー赤血球や閉塞部位との間の流体の列が短くなるように、経フロー（ すなわち 、ろ過）はルーメン中のマーカー赤血球の動きから測定され、 図3。実験プロトコルの長さは600〜1000ミクロンが必要とされる分岐していない血管の複雑さと長さに応じて。
容器が閉塞されておらず、圧力計の圧力が微小血管を通る流れを駆動しているときに自由灌流中の微小血管の圧力は、典型的には、唯一であるように、ピペットチップの圧力降下が大きいです下流側の圧力よりも数CMH 2 0。対照的に、閉塞中にピペットを横切る圧力降下は、流体がゆっくりと血管壁を横切る流体フィルタを交換するために血管の内腔に入ると非常に小さいです。したがって、閉塞時に血管内腔（P c）が静水圧は、圧力計が設定したことに等しいです。腸間膜組織内の浸透圧は無視できるので、静水圧が知られており、血管内腔における膠質浸透圧を灌流液中のそのセットに等しい場合は、直ちに閉塞後、マーカー赤血球からの経流体の動きを測定します。 L pの連続的な測定を、容器の長さは、ブロックサイトが前進するたびに失われます。また、連続したrecannulationは、利用可能な血管の長さを低減します。
血管壁（JはV / S）の単位面積当たりの経の流体の流れは、速度から推定されるmicrovの水の列の長さ測定マーカー赤血球や閉塞部位のいずれか短く（ネットろ過）または長く（ネット再吸収）の間エッセルルーメン。仮定は、血管内腔の中心線に沿って移動する中性浮力赤血球は細胞を囲む水柱の平均速度を追跡するために使用することができることである（水の速度を意味する赤血球速度の比は、6ミクロンのために1.8に近いです直径30μm容器内の赤血球）。8,14このようブロッカーに向かっミクロン/秒マーカーセル（）の速度は、閉塞後の最初の2〜5秒かけてのVミクロン/秒であり、血管の半径がある場合R、その赤血球および閉塞部位（JのV）との間に微小血管の壁を越え濾過された流体の量は、微小血管を想定しπR2 V から 3μm/秒は、円筒状です。 ℓマーカーセルとの間の初期距離であり、さらにそのマーカーセルと閉塞部位との間に円筒状の微小血管（S）の領域は、2πrℓありますそして、閉塞部位。このように水の圧力計Vrを/（2ℓ）によって設定された圧力で、単位面積（JのV / S）あたりの平均初期経の流れ。
灌流液の浸透圧は、微小血管の圧力（典型的には3.6 CMH 2 O、10 mg / mlのキャピラリの濃度のウシ血清アルブミンの浸透圧に比べて低く設定されている場合、L pが行われる容器の最も単純な見積もり圧力より大きい30 CMH 2 O）。制御状態におけるアルブミンの反射係数（σ アルブミン）が 0.9に近いので、L pは（P C -3）センチメートル/秒/ cmのH 2 O /（JのV / S）として算出されます。 図4の代表的な結果に示すように、このアプローチを用いて1分間のオーダーの時間分解能でL Pにおける急激な変化は、一定の圧力でのJ V / Sの連続的な措置の間の自由な流れを確立することによって測定することができる。上記の方法は、IGNORES反射係数が0.5を下回ったが、P cは30 CMH 2 Oより大きい場合にL pの推定値の誤差が5％未満のままであるときに1未満CMH 2 Oに落ちるアルブミンのコロイド浸透圧のわずかな変化。
両方のL pと反射率の正確な測定が必要な場合は、JはV / Sは、試験高分子の予想有効な浸透圧以下の微小血管圧の一連で測定されます。 JのV / Sと圧力対策のL pと圧力軸上の切片との関係の傾き正味の流れはゼロ対策σπ（ 図5）であるとき。 Jvを直線的に圧力に関連するデモは、膠質浸透圧の差は、静水圧プレスに対して低いときにも、上述の単純なプロトコルを使用して、単一の圧力測定の使用の重要な検証（ 図4）でありますURE。
エラーの発生源。正確な測定を損なういくつかの問題があります。正しく速く経交換に起因するよりも流体閉塞部位過去のリーク、および閉塞部位に向かってマーカー細胞の動きの閉塞部位の結果で血管壁に容器又は損傷を閉塞するために失敗しました。マーカー細胞は通常、閉塞部位に向かってゆっくりと移動し、それに到達しないのに対し、マーカー細胞は閉塞器へのすべての方法を追跡する場合は、リークが示されている。一方、障害がカニュレーションサイトで微小血管の内腔にピペットをシールしますJのV / Sの過小評価で結果。 superfusateまたはカニューレ挿入部位の上流の血管の内腔にピペットからの流体漏れがピペットチップ全体で大幅な圧力降下を生じさせます。このようなリークが検出されたときに下流の血管LUのものよりも高い速度でマイクロピペットチップフロー内のセル閉塞した血管の男性。マイクロピペットを慎重に再配置は、通常、漏れをシールします。血管壁のL pは、通常、局所的な損傷または炎症の1つ以上の部位とを有する、均一でない場合、別の問題が生じます。ほとんどの経血管の流れが集中している場合は、マーカーの細胞はサイトに追跡します。赤血球の動きはまだ経流れを測定するが、測定値のJ Vは/ Sは、テスト・セグメント内の壁領域のほとんどの代表的ではありません。
既存の方法に関する方法の意義。内皮関門透過性の調節および経為替培養内皮細胞単層全体の交換されている（1）in vitroでの測定とにおけるトレーサー蓄積の（2）の測定を調査するために2つの最も一般的に使用される方法トレーサー後の組織試料は、全動物に静脈内注射されます。培養内皮細胞単層での実験がfです細胞機能をより直接的に修正することができ、内皮細胞内の分子のイベントの詳細な評価のために利用可能な十分な細胞材料があるためavored。しかし、ほとんどの培養条件下で内皮細胞は通常、in vivoでの血管透過性のバリア代表を形成しません。上述の修正されたランディス技術は、無傷の細静脈の微小血管における内皮バリア機能の調節を調査する堅牢で信頼性の高い技術であることが実証されています。経験豊富な研究者の手では、細胞培養に使用されるアプローチのいくつかは（例えば、細胞成分のイメージングは、シグナル伝達経路の変更）を適用することができ、制御および試験条件の下での透過性の測定をペアリング。無傷の微小血管での実験の重要性は、個別に灌流microveに関門透過性を制御する機構との間に有意差を示すことにより実証されていますssels及びそれらは、しばしば、培養内皮細胞単層にします。例としては、せん断への応答、トロンビン曝露、および炎症性ギャップ形成2-6,9,16に対する収縮機構の寄与が含まれます。無傷の血管床におけるトレーサー蓄積の測定はとかを増加させることなく、より多くの正常な生理学的機能が、トレーサの蓄積が増加した灌流（交換のために増大した表面積）の結果として増加する可能性があるため、侵害された血管透過性の実際の変更の直接の調査を保存します壁の透過性。血管拡張は、灌流血管の数を増加させ、それによって、総溶質の蓄積が単独で34血管透過性の増加によるものよりも大きい場合にこのように透過性の増加の程度は、過大評価されてもよいです。
将来のアプリケーションは、オプションの範囲は、INDIの透磁率と同じ条件の下で細胞の構造および機能を変更します微小灌流が増加すると予想される時にvidual容器は、直接測定されます。さらに、それは遺伝的に改変されたラットの腸間膜における方法の適用は、遺伝子改変マウスのために存在していた長期的な問題を解決することが期待されます。遺伝的に改変されたマウスは、利用可能になったとき、具体的には、微小灌流は、その腸間膜血管における微小血管を調査するために拡張することができることが予想されました。いくつかの微小灌流実験は、マウスの腸間膜35の微小血管に完成されたが、マウスは、一般的にラットよりも、その腸間膜組織で少ない微細血管を持っている、とのより適切な長い（> 500ミクロン）ストレート血管を対照的に、これらの血管は、多くの場合、短くて高度に分岐していることラットで見つけることができます。このように遺伝的にマウスで経交流の変調を調査する実験は、このようなマイル34や測定技術的に厳しいが、より信頼性の高いトレーサー実験としてアッセイに依存してきました血管および放射性標識試験プローブ36の蛍光の血管外蓄積両方の変化。
方法の変更。上記のプロトコルでは、灌流液組成の変化は、マイクロピペットの変更を必要としました。別のアプローチは、再充填装置を用いてin situでマイクロピペットを補充することです。詳細37で説明したように、この手順を完成するに至りました。制限は、ピペットで灌流液の組成を変化させる時間は、ピペットの交換によって達成ほど高速ではないということですが、それは時間の長時間微小血管を灌流する必要がある場合の手順は、特に便利です。
接近同じ微小灌流は、蛍光溶質31,38-40標識する透過係数を測定するために拡張することができます。この場合、単一の銃身のマイクロピペットは、ピペット41二連（シータ）に置き換えられて、容器を灌流します交互に組織をクリアし、溶質の蓄積の繰り返し測定を可能にするために、蛍光溶質ずに組織蓄積コンテンツルーメンに対して、同じ灌流液を測定するためのテスト蛍光溶質と。経水の流れの測定が蛍光標識された試験溶質、細胞内組成の蛍光指示薬、または細胞成分の共焦点イメージングを用いて、溶質透過係数の測定と組み合わせることになっている場合には、より洗練されたコンピュータ制御された蛍光顕微鏡が必要です。これらの調査は、通常、高倍率とはるかに短い作動距離を持つレンズを必要とするので、腸間膜を保持するために使用される石英柱は、顕微鏡トレイのウェルの組織内プレキシグラス支持体に接着されたガラスカバースリップに置き換えられます。 3-Dプリンターの利用可能性の増加は、より大きなdiameteを配置するために必要な狭い許容範囲を満たすカスタムトレーの高精度の製造を可能にします選択された微小血管に比べて短い作動距離とRレンズ。
腸間膜に使用可能な微小血管の利用可能性は、年齢、性別、および歪みに応じて変化します。したがって、ラットの系統および男性または女性の使用の選択肢がアドレスされている特定の質問に依存します。我々の最近の研究の多くのために我々は、彼らが、一般に利用可能な、長い、ストレート腸間膜微小血管を持って見つけた時の年齢は約3〜4ヶ月で使用する前に少なくとも1週間私たちの動物施設に順応させる雄性Sprague-Dawleyラットを使用しています。これとは対照的に、私たちの同僚は成功し、2-3ヶ月の13歳の雌性Sprague-Dawleyラットを使用しています。
赤血球の役割。赤血球の主な役割上述したように、セルが微小血管が閉塞された後に流れる水の不活性、中性浮力の指標として作用したと仮定すると水の動きを追跡するために経ました。この基本的な役割に加えて、それを今赤血球が存在31,42,43中のアルブミン時灌流液に、S1Pを供給することにより、バリアの安定性に寄与することが認識されています。これらの観察のいくつかの重要な意味があります。赤血球の不在下で、または別の不活性流動マーカーを用いて、ベースラインの透過性は、より安定である可能性が高いです。これは、S1Pの測定は微小灌流実験で使用されるすべての灌流液中で行われるべきであることをお勧めします。
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Acknowledgments
この作品は、国立衛生研究所HL44485とHL28607を付与することによってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MICROSCOPE, TABLE AND STAGE | |||
| inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example | Olympus | CK-40 | try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators |
| inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example | Leica | DMIL | try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators |
| narrow diameter, long working distance objective: example | Nikon | Nikon E Plan 10×/0.25 LWD | |
| stage platform--1/2 inch or 1 cm sheet steel | welding shop | this should be heavy to reduce vibration | |
| Unislide x-y table: dove tail slides | Velmex | AXY4006W1 | |
| VIDEO | |||
| CCD video camera: example | Pulnix | TM-7CN (no longer available) | no color needed |
| video capture system with audio--generic | |||
| video playback system (completely still frame, single frame motion) | |||
| small microphone | |||
| MICROMANIPULATORS, HOLDERS | |||
| micromanipulator, XYZ (3) | Prior/Stoelting (no longer available) | look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning | |
| hydraulic probe drive, one way | FHC | 50-12-1C | need to buy either manual drive or electronic drive |
| manual drum drive | FHC | 50-12-9-02 | |
| or hydraulic drive, 3 way | Siskiyou Corporation | MX610 (1-way) or MX630 (3-way) | great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years |
| connectors/rods/holders | Siskiyou Corporation | MXC-2.5, MXB etc. | |
| pin vise | Starrett | 162C | to hold restrainer |
| pipette holder | World Prescision Instruments | MPH3 | |
| water manometer ~120 cm | |||
| MICROSCOPE TRAY | |||
| clear Plexiglas for microscope tray for animal | |||
| 3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall | Quartz Scientific Inc. | custom | (or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective |
| Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN) | |||
| medical adhesive for tissue well | NuSil | MED-1037 | |
| All-purpose silicone rubber heat mat, 5" L x 2" W | Cole Parmer | EW-03125-20 | heater for microscope tray--needs cord and controller--240V version available |
| Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC | Cole Parmer | EW-03122-75 | |
| STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out | Cole Parmer | EW-01575-00 | |
| PIPET MANUFACTURE | |||
| vertical pipette puller | Sutter Instrument Company | P-30 with nichrome filament | |
| 1.5 mm OD thin wall capillary tubing | Sutter Instrument Company | B150-110-10 | |
| pipette grinder air stone and dissection microscope--see reference in text | or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments | ||
| RX Honing Machine, System II | RX Honing Machine Corporation | MAC-10700 Rx System II Machine | alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle |
| with ceramic sharpening disc | RX Honing Machine Corporation | use "as is" or attach lapping film | |
| lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um | 3M | part no. 051144 80827 | 268X Imperial lapping film sheets with adhesive back--can be purchased from Amazon |
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