Şekilde, mikro Tekniği Sıçan mezenter mikrodamar geçirgenliği Yönetmelik Araştırma

Abstract

Bireysel perfüze mikrodamarlar geçirgenlik özelliklerini ölçmek için deneyler kültürlü endotel hücre mono tabakaları ve tüm mikrovasküler yatak fonksiyonel değişim özelliklerinde damar geçirgenliğini düzenleyen moleküler ve hücresel mekanizmaların araştırılması arasında bir köprü oluştururlar. Kanül ve sıçan mezenter venüler mikrodamarlar serpmek mikrodamar duvarının hidrolik iletkenliği ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Gerekli temel ekipmanları üç farklı microtools konumlandırmak için mikromanipülatörler destekleyen büyük bir modifiye sahne ile bir intravital mikroskop içerir: (1) bir eğimli cam mikropipet cannulate ve mikrodamar serpmek için; (2) bir cam mikro-tıkayıcı geçici perfüzyon blok ve ölçülü bir hidrostatik basınçta transvasküler su akış hareketinin ölçülmesine olanak tanıyan, ve (3) kör bir cam çubuk kanül yerinde mezenterik doku dengelenmesi için. Modifiye Landis mikro oklüzyon technique mikrodamarlar karşısında bu kadar deneysel koşullar değiştiğinde akımları ve hidrostatik ve kolloid osmotik basınç farkı tekrarlanan ölçümler titizlikle kontrol edilir kılar da transvasküler sıvı hareketinin belirteçleri olarak yapay perfüzat içinde asılı kırmızı hücreleri kullanır ve. Sonra ilk deneme Perfüzatlar aynı mikro damarın yeniden kanülasyondan sonra, bir kontrol perfüzyon kullanarak hidrolik iletkenlik ölçümleri bu iyi kontrollü koşullar altında mikrovasküler yanıt karşılaştırmalar eşleştirilmiş etkinleştirin. Vasküler geçirgenliği değiştirmek için beklenen genetik değişiklikler ile farelerin mezenterinde mikrodamarlar yöntemi genişletmek için girişimleri nedeniyle fare mezenterinde uzun düz ve dalsız mikrodamarlar yokluğu ciddi sınırlı, ama benzer genetik değişikliklerle sıçanların son durumu kullanarak CRISPR / Cas9 teknolojisi burada tarif edilen yöntemler uygulanabilir soruşturmanın yeni alanlar açılması bekleniyor.

Introduction

Damar sisteminde sayılı Şekilde, mikro çapı genellikle 40 um den az bir kan damarının bir mikropipet vasıtasıyla bilinen bir bileşimin, yapay bir perfüzat akışını kontrol kuran gerektirir. Perfüze gemi normal doku ortamında kalır ve Kanülasyonu zaman hayvanın kanı yukarı ile perfüze. In situ sayılı Şekilde, mikro video görüntüleme veya florometrik bir dizi teknik ile bağlantılı olarak kullanıldığında bu akışları için itici güçler bilinmektedir ve vasküler duvarın geçirgenlik özellikleri olabilir koşullar altında mikro damarların duvarları arasında, su ve çözünmüş madde akımlarının ölçümü sağlar doğrudan değerlendirildi. Bundan başka, doku mikrodamar (perfüze ve superfusate), çevreleyen sıvı bileşimlerini kontrol ederek, mikrovasküler geçirgenliğin ve değişim düzenlenmesi e maruz bırakılmış olan mikrodamar duvarı oluşturan endotelial hücreler sağlayarak araştırılabilirXperimental koşullar zaman tam ölçülen süreler (saat sn) için (agonistler, modifiye perfüzyon koşulları, floresan göstergeler içi kompozisyon ve sinyalizasyon ölçmek için). Buna ek olarak, bariyer düzenleyen önemli hücresel molekül yapılarının ultrastrüktürel ya sitokimyasal değerlendirmeler geçirgenliği ile doğrudan ölçüldüğü aynı Mikro damarların içinde araştırılabilir. Yaklaşım ve böylece kültürlü endotel hücre mono tabakaları ve bozulmamış mikrodamarlar soruşturma endotel bariyer fonksiyonunu değiştirmek için hücresel ve moleküler mekanizmalar soruşturma arasında bir köprü oluşturmaktadır. Daha fazla değerlendirme ^1-6 aşağıdaki bakın.

Şekilde, mikro bir sınırlaması, sadece ince, saydam ve bir cam mikropipet ile kanülasyon mümkün kılmak için yeterli yapısal bütünlüğe sahip mikrovasküler yatak kullanılabilir olmasıdır. Erken araştırmalar mezenter ve ince deri pektoris m kurbağa mikrodamarlar kullanılır iken^7,8 uscle, bugüne kadar memeli modellerinde en sık kullanılan hazırlama sıçan mezenter ^9-15 olduğunu. Çoğu araştırmalar 1-4 saatlik sürelerde çalışılan damar geçirgenliği akut değişiklikler üzerinde duruldu, ama daha yeni araştırmalar bir başlangıç ​​perfüzyon ^12,16 sonra bireysel damarlarda ölçümler 24-72 saat genişletilmiştir. Bu iletişimde açıklanan yöntemleri etkinleştirmeniz gerekir vasküler geçirgenlik yönetmelik ¹⁷ eğitim için daha genetiği değiştirilmiş fare modelleri kullanılabilir hale getirmek için söz yeni geliştirilen CRISPR teknolojisi, bu yeni ve önemli sıçan modellerinde mezenterin venüler mikrodamarlar uygulanacak.

Yöntem perfüze gemiye yakın ve geminin bir perfüzyon mikropipet hizalamak için pozisyon microtools için kullanılan hayvan hazırlama ve en az üç mikromanipülatörler hem alacak kadar büyük bir özel inşa mikroskop aşaması ile donatılmış bir inverted mikroskop gerektirirlümen. Örneğin, bir xy mikroskop sahnede (yaklaşık 90 × 60 cm) için özel bir platform pas geçirmez kaplama ile 1 cm kalınlığında çelik levha imal edilebilir. Sahne, bir mühendislik dizin tablosunun veya yatay düzlemde hareket için Teflon sütunlar ya da Bilya üzerinde dik açılarda monte edilir ve desteklenen iki kırlangıç ​​kuyruğu slaytlar takılır. Tipik bir teçhizat (Şekil 2), vasküler düz tek damar kan akışını ve hematokrit, kan perfüze mikrodamarlar yerel oksijen teslimat, yönetmelik ölçmek için böyle olanlar gibi intravital mikrodolaşım deneyler bir dizi için kullanılan mikroskop ve micropositioning ekipmanları ile ortak çok şey var kas tonu, ve bütün dolaşıma enjekte floresan izleyiciler yerel mikrovasküler birikimi. ^18-26

Tekniğin temel yönü mikrodamar duvarının belirlenmiş bir yüzey alanı (S) boyunca hacimsel akış (J _v) ölçülmesidir. BaşarmakBu, burada açıklanan modifiye Landis tekniği ile basit bir ters mikroskop yeterlidir. Küçük bir video kamera ilave bir zaman baz ile, bir video monitöründe gösterildi ve bir bilgisayara bir dijital formda veya bir video kayıt cihazı üzerinde dijital veya analog bir sinyal olarak kaydedilebilirler, görüntü portu ve video sinyali üzerine monte edilir. Mikrodamar kanüle sonra kamera görülebilir mikro damarın kısmı kanülasyonu bozmadan bir birim olarak sahne ve manipülatörler taşıyarak değiştirilebilir.

Transvasküler akımlarının ölçümü ^aynı zamanda, çözünmüş madde geçirgenliği, sitoplazmik kalsiyum ya da diğer hücresel mekanizmaları ve konfokal görüntüleme ^6,12,13 floresan oranı izleme ölçümleri için kullanılan donanımları olarak uygun filtreler ile gelişmiş bir floresans mikroskobu kullanılarak daha ayrıntılı inceleme ile birleştirilebilir ^27. Tüm Şekilde, mikro yaklaşımların önemli bir avantajı, aynı gemide tekrarlanan tedbirleri yapabilme yeteneği olduğunuGibi hidrostatik ve onkotik basınçları, ya da iltihabi durumların damar yanıtlarında kaynaklı değişim olarak itici güç kontrollü değişim altında. En yaygın tasarım, ikinci bir pipet ile, daha sonra bir taban çizgisi geçirgenliği durumunu tesis eden ilk bir kontrol perfüzat ve eritrosit süspansiyonu ile doldurulmuş bir mikropipet ile perfüze gemi ile aynı kap üzerinde ölçülen hidrolik iletkenliği (L _p), bir çift karşılaştırmasıdır Test maddesi ile perfüzat ilave edildi. Birden kanülasyonlar kontrol pipet ile reperfüzyon sonra tekrar çevrimi ile mümkündür.

Bu protokol, mikrodamar duvarı boyunca su akıları kayıt ve damar duvarının L _p, sağlam boyunca su ve çözünen maddelerin ortak yolunun geçirgenliği yararlı bir kırılma indeksinin ölçülmesi için sıçan mezenter bir venüler kabın kanül ve Şekilde, mikro göstermektedir endotel bariyer. Prosedür modifiye Landis techniq adlandırılırue, çünkü ²⁸ korunur bloke perfüzyona başlanmasından transvasküler sıvı alışverişi bir ölçüsü olarak, kırmızı hücrelerin göreceli hareketlerini kullanarak orijinal Landis prensibi ancak deneysel koşullar aralığı (örneğin, mikro-damar duvarı boyunca hidrostatik albumin onkotik basınç farkları) Şekilde, mikro sonra kullanılabilir uncannulated kan perfüze mikrodamarlar ^8,29 oranla çok daha fazladır.

Protocol

Etik Beyanı: Tüm prosedürler gözden geçirilecek ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.

Mikropipetler, kısıtlayıcılara ve Bloke 1. Ön Fabrikasyon

1. Çekildiğinde, tüpün uzatılmış kısmı yaklaşık 1 cm uzunluğunda ve iki yarısı biraz simetrik olmasıdır, böylece düzeltilmiş bir elektronik çektirmenin kullanarak yarısında birkaç temiz borosilikat cam kapiller tüpler çekin. . Konik Şekil 1'de boyutları ile uyumlu olduğundan emin olun mikropipetler, kısıtlayıcılara ve blokerler için iki yarısı kullanın.
   1. Konik suyla yıkanıyor 0,5 mikron zımpara kağıdı ile hava tahrikli taşlama ³⁰ ile mikropipetler. Yatay yaklaşık 30 derece olacak şekilde mikropipet tutucu açısını ayarlayın.
   2. İyice yıkayın ve bahşiş yoluyla ve şaft temizlemek aseton çekmek için emme kullanarak mikropipetler kurutun. (Mikropipetler inceleyinBir timsah klip mikropipet tutucu ve bir mercek dürbün ağı ile donatılmış 4 × 40 × hedefleri ile küçük bir dik mikroskop kullanılarak Şekil 1A).
   3. Kimin uzunluk / genişlik oranı 3.1 ila 3.5 ve mezenterinde sert kollajen lifleri nüfuz yardımcı olan bir keskin konik noktası olan bir eğim ile yaklaşık 50 mikron uzunluğunda ucu açılması ile seçin mikropipetler.
   4. Tozsuz bir kutuda hafifçe farklı boyutlarda 15-20 mikropipetler saklayın.
2. Adım 1.1 hazırlanan çekti kılcal tüpler) kullanarak kısıtlayıcılara olun. Kör bir uç (Şekil 1B) oluşturulması için bir microflame yakın kısa çekilmiş bir cam kılcal tüp tutun. Tozsuz bir kutuya birkaç saklayın.
3. Adım 1.1 hazırlanan çekti kılcal tüpler) kullanarak microoccluders olun. Eğmek hafifçe microflame altında çekti kılcal tüp tutun ve (bir boru adaptörü, örneğin kullanarak., 23G) ince uçlu (ucundan yaklaşık 4 mm) miline 120 dereceye yakın bir açı yapmak (

2. Hayvan Hazırlama ve Cerrahisi

1. Pentobarbital sodyumla erkek (350-450 g) ya da dişi Sprague-Dawley sıçanları (200-300 g) anestezisi (80-100 mg / kg, Sigma-Aldrich, P3761) deri altı enjeksiyon yoluyla; intraperitoneal kullanarak değil mezenterin korur.
2. Cerrahi prosedürler ve deney protokolleri boyunca, gerektiği gibi ilave enjeksiyonlar (30 mg / kg) ile anesteziye devam ediniz. Ayak tutam veya kornea refleksi ile anestezi derinliği belirler. Deney prosedürünün tamamlanmasından sonra, pentobarbital dozda ya da anestezi altında, doymuş potasyum klorid intrakardiyak enjeksiyonu ile sıçan euthanize.

3. Akış Markers olarak kullanılmak üzere Çözümleri ve eritrositler hazırlayın

1. Superfusate ve kontrol perfüzyon çözeltisi (tipik olarak memeli 10 mg içeren Ringer çözeltisi / ml yağ asidi için memeli Ringer çözeltisi hazırlayıniçermeyen sığır serum albumini, BSA).
   1. 0.2 mikron şırınga filtreler aracılığıyla filtre Perfüzat mikropipet ucu engelleyebilir minik parçacıkları çıkarmak için; küçük, temiz bir kap içine süzün.
2. 0,05 ml heparin (1000 U / ml) ihtiva eden küçük bir şırınga, bir 20G iğne içine anestezi uygulanmış sıçan kuyruk damarından 0.2 ml kan alınarak eritrositleri hazırlayın ve yaklaşık 14 ml, memeli Ringer çözeltisi ihtiva eden bir çözelti, 15 ml bir santrifüj tüpüne transfer .
   1. Santrifüj yavaşça (7 dakika boyunca maksimum 200 × g) hakkında kırmızı hücrelerin paketi. Süpernatant çizin ve Ringer çözeltisi içinde kırmızı hücrelerin yeniden askıya.
   2. Santrifüj ve çıkarılmasından sonra süpernatan üç kez daha sonra kullanılmak üzere, tüpün alt paketlenmiş kırmızı hücreleri bırakın. Bu işlem normal seviyelerde ³¹ daha az,% 0.1 son Perfüzatlar trombositleri azaltır unutmayın.

4. Animal üzerine Doku YerleştirTepsi

1. Kılıç şeklinde sürecine göbek altından anestezi sıçan karın Tıraş. Saç de doku dışarı superfusate çekmek için bir fitil teşkil etmeyecek şekilde traş alanı (sağ tarafına yerleştirilmiş sıçan) sağ tarafında etrafında uzanır emin olun. Bir ıslatılmış gazlı bezle veya mendille kesilmiş tüyleri temizleyin.
   1. Künt bir dişli forseps ile cildi tutun ve sağlam bir makas kullanarak deri yoluyla bir merkez-line kesi (2-3 cm uzunluğunda) yapmak. Para cezası Kullanma (iris) makas gut zarar görmesini önlemek için tırtıklı forseps ile karın duvarı kaldırarak, linea alba boyunca benzer bir kesi yapmak.
   2. Hayvan tepside yan hayvan ile hafifçe Ringer solüsyonu ve künt dişli forseps batırılmış pamuk uçlu aplikatörler (ahşap sopa) kullanarak karın boşluğundan bağırsak çekin. Mezenter mezenter dokunmamak için özen mikroskop aracılığıyla (Pote görüntülemek için ayağı üzerinde bol dökümlü böylece iyi dokuda gut düzenleyinntially forseps veya pamuk ya da birlikte) mikrodamarlar zarar.
      Not: Hayvan tepsisi (Şekil 2A) Pleksiglas inşa ve optik berrak ayağı, (yaklaşık 3 mm derinliğinde) (örneğin cilalı bir kuvars yaklaşık 2 cm'lik dia ve 5 mm yüksek.) Iyi bir ısınma pad bir doku gerektirir Hayvanın sıcaklığı muhafaza edecek şekilde ayarlanır. Ayağı kalınlığı hedefi çalışma mesafesi aşmamalıdır.
2. Mezenter göz mercekleri ile görünür böylece mikroskop sahnede hayvan tepsisini yerleştirin.
3. Sürekli 35-37 ° C de muhafaza memeli Ringer solüsyonu ile mezenter superfuse yerçekimi beslemeli damla hattı yerleştirin. Yerinde gut tutun nemi korumak yardımcı ve yüzeyden fazla Ringer çözeltisi fitil gazlı bez kullanın. Akışını ayarlamak ve tutarlı bir superfusate kalınlığı korumak için atık aspire.
4. Olan hedef venüler mikrodamarlar belirlenmesiyakınsak akışı, gerçek kılcal uzak bir ya da iki şube aşağı dallanmamış kesimleri. Dallanmamış gemiyi bul (ideal, uzunluğu 600 ila 1,000 mikron) tempolu kan akımını ve damar duvarına yapışmasını beyaz hücrelerin serbest olması.
5. Mikroskop alanının merkezinde test mikrodamar yerleştirin ve seçilen kanulasyon yakın pozisyona koruyucularını taşıyın.

5. Yuvaya Mikropipet ve Dağı Dolgu

1. Sadece kanüle önce, perfüzat kırmızı hücrelerin askıya. Temiz bir borosilikat test tüpünde 0.5 ml perfüzat için eritrosit 7 ul ekleyin. Not:% 1-3 miktarda hematokrite, kullanılabilir, fakat tutarlı hematokrit kırmızı hücrelerden salınan bir maddelerin tutarlı bir perfüzat konsantrasyonlarına neden olur.
2. Bir 23G tüp adaptörü ve PE 50 boru (5-15 cm uzunluğunda) ile 1 ml şırınga takın. Şırıngaya perfüzat / kırmızı hücre karışımı çizin. Karıştırın ve tüp tüm kabarcıklar sınırdışı şırınga ters çevirin veadaptörü. Ve deney başlamadan önce birkaç şırınga verimlilik artışı, uygun boru için tozsuz kutu veya plastik torba içinde saklayın.
3. O konik bölgeyi dayandığı kadar mikropipet büyük ucunu boru ilerleterek mikropipet doldurun. Mikropipet ucu doldurmak için şırınga pistonu hafif bir hızlı itme uygulayın. Not: Bir küçük akarsu veya damlacık tam dolum kanıtlamak için ucunda görünür olmalıdır.
4. Yavaşça pistonu iterek mikropipet milin geniş kısmını doldurmak için ise boru geri çekin. Dikkatlice mikropipet mili hafifçe vurarak geniş şaft küçük kabarcıklarını çıkarın. Not: benzer bir prosedür ³² resmedilmektedir.
5. Bir su manometre sürekli bir sıvı bağlantısı sağlayan bir yan portu ile bir pipet tutucu içine mikropipet yerleştirin. Emin olun mikropipet çok ince ilerlemesini kontrol etmek için kullanılan bir hidrolik sürücü takılı tutucu, hafif bir açıyla olduğunu (15-25 °)yatay mikropipet konik kenar gut veya tepsiyi isabet etmez ki.
6. Test kabına (Şekil 2) yakın uyum sağlamak için x, y ve z sürücüler vardır hareketli bir mikromanipülatör, hidrolik sürücü bağlama.
7. 40 cmH ₂ mezenter üzerinde O'ya manometre su sütunundaki sıvı yüksekliğini değiştirmek için bir şırınga ya da suda dolgulu kauçuk ampul kullanılarak mikropipet sıvıya uygulanan hidrostatik basıncı ayarlar.
8. Pipet doldurduktan sonra en kısa sürede mikrodamar cannulate; Bu yaklaşık 40 dakika sonra çok az kırmızı hücrelerin damar içine akacak, böylece kırmızı hücreler, pipet altına yerleşirler.

6. Microcannulation ve Mikrovasküler Basınç Ölçümü

1. Mikroskop altında doldurulmuş mikropipet yerleştirmeden önce, yumuşak kavrama doku yeterli bir kuvvet uygulamak mikro damarın yakınındaki doku üzerine koruyucularını basın. BeraberlikMezenterik kollajen liflerde gerilmeler gemi ile aynı hizaya gelecek şekilde hafifçe mikrodamarlarda doğrultusunda doku germe, geri süzgeç.
   1. Gemi ile mikropipet hizalayın ve göz mercekleri ile görünüm içine indirin. Seçilen kanulasyon sadece üst ucu yerleştirin ve kısmen geminin içindeki akışını engeller, böylece doku üzerine indirin, ama tıkamaz.
2. Hidrolik sürücüyü kullanarak damar lümenine yavaşça pipet sürerek gemiyi cannulate. Geminin alt tarafında aracılığıyla itmek için dikkatli olun.
   Not: mikropipet lümen girerken, Perfüzat hızla lümen dışında geminin kan yıkar ve perfüzat serbestçe aşağı damarlarda normal kan perfüzyon bazı displacing test mikrodamarlarda hayvanın dolaşım distalinde akar.
3. Belirtildiği gibi (kanda kadar manometre ayarlayarak perfüzyon basıncını düşürmekperfüze segmentine geri çekilir) hayvanın kırmızı hücreleri tarafından; Bu, kırmızı hücrelerin yavaşça damar lümeni salınım mikrodamar segmentinin uzak ucunda hidrostatik mikrodamar basıncı _(P c) ölçen bir denge basıncı belirler. Bu denge basıncının üzerindeki tüm basınçlarında gemi perfüzyon koruyun.

7. Microocclusion ve Veri Toplanması

1. İsteğe bağlı adım: ucu tekrarlanan mikro sırasında deneysel gemi koruyan doku ince ped birikir o ana kadar herhangi bir gemiden mezenterinde olmayan bir kullanım alanına doku bastırın, gemi engellemek için mikro-tıkayıcı kullanmadan önce tıkanıklıklar.
2. Mikroskop alanının alt kenarına yakın perfüze geminin üstünde engelleyici yerleştirin.
3. Video ve ses ile aşağıdaki kaydedilir.
   1. Sözlü blok sitenin konumu ve mercek retikül görüldüğü gibi düşük ekran kenarını kaydedin.
   2. Ucu ilesadece mikro damarın üzerine yerleştirilen bloker, geminin akım tıkalı kadar yavaşça engelleyici düşürmek için mikromanipülatör ince z denetimini kullanın. Ses üzerine manometre basıncı (P _c) unutmayın. 3-10 saniye tipik tıkanıklığı uygulayın ve daha sonra serbest perfüzyon geri, bırakın. , Zamana dayalı 5-10 mikron adımlarla (> bir yerinde ilk bloktan sonra 5 dakika), tıkanıklığı sayısı (3-5) pipet doğru geminin yukarı blok siteyi taşı blok yerinde damar duvarı hasarı önlemek için .

Veri ve L _p Ölçümü 8. Analizi (Su Geçirgenliği)

1. Video oynatımı sırasında, bir sahne mikrometre ve görüntüleri bilinen pozisyonların bir görüntünün kullanımı ile tıkanıklığı sitesine işaretleyici kırmızı hücreden ilk mesafeyi (ℓ ₀₎ belirler. Kaydedilen görüntülerin 3-10 sn boyunca çeşitli çerçevelerde konumundan işaretleyici hücrenin ilk hızı (dℓ / dt) belirleyin. CaydırmakMaden tıkanıklığı (Şekil 3) sırasında çekilen görüntülerden damar yarıçapı (r).
2. Hesapla J _v / S (dℓ / dt) × (1 / ℓ ₀₎ × (r / 2) Her tıkanıklığı için. Sürüş basıncı bölü (J _v / S) olarak sabit basınçta L _p hesaplayın (mikrovasküler basıncı - Etkili kolloid osmotik basınç, Tartışma bakın).

Representative Results

Şekil 4, dört Perfüzatlar art arda kanüle mikro damarın venüler bir sıçan L _p değişikliklerin zaman sürecini ölçmek sonuçlarını gösterir. ³³ sabit bir basınçta hesaplanan L _p büyüklüğü mikrodamar duvarı geçirgenliği değişikliklerin bir ölçüsü olarak kullanılmıştır, ilk olarak gemi 10 nM Bk içeren ikinci bir mikropipet kullanılarak enflamatuar ajan bradikinin (Bk) maruz kalmıştır sonra% 1 sığır serum albümini ihtiva eden bir perfüzat ile birlikte kontrol aşamasında. Bradikinin sonraki 10-15 dakika içinde kontrol değerinin doğru dönen L _p geçici bir artışa neden olmuştur. Bundan sonra, tekne istikrarlı bir temel yeniden kurmak için 30 dakika boyunca, kontrol perfüzat ile yeniden perfüze edildi. Mikrodamar aynı Bk konsantrasyonu yanı sıra perfüzata 1 uM sfingosin-1-fosfata (S1P) ile 4 mikropipet kullanılarak perfüze zaman, Bk yanıt önemli ölçüde zayıflatılmıştır. DerecesiBk ve S1P, aynı zamanda perfüze edildi zayıflatma S1P Bk maruz bırakılmadan önce, 20 dakika için perfüzat kadar ilave edildi, diğer deneylerde ölçülmüştür benzer olduğu tespit edildi. Bu sonuçlar, tek bir kap L _p çoklu ölçümler yapmak mümkün gücünü göstermek ve bu tür bir inflamatuar maddenin mevcudiyetinde damar duvarı stabilize S1P gibi bir maddenin etki süresi dönemlerinde dönüştürülebildiğini göstermektedir Birkaç saniye sipariş. Ayrı damarlar kontrol çalışmaları Bk cevabının hafifleme anafilaksi nedeniyle değil olduğunu göstermek için S1P yokluğunda benzer bir protokol ile gerçekleştirilmiştir.

Bazı deneysel tasarımlar için bir makromolekül (σ) ve L _p çözünen yansıma katsayısı hem de tahmin etmek önemlidir. Bu her mikrodamarlarda birden fazla basınçlarda J _v ölçerek en gerçekleştirilir. Şekil 5 bir deney göstermektedir in burada L _p ve perfüzat içindeki% 5 albümin etkin onkotik basıncı her iki (π _albümini = 27 cmH 37 ° C 'de ₂ O), sıçan mikrodamar çevreleyen dokuda Albümin varken koşullar altında tahmin edilmiştir. Bu deneyler, J _{h /} S üç farklı basınçta ölçülmüştür. L _p J _h / S ve basınç arasındaki ilişkinin eğimi ve basınç ekseninde kesişme damar duvarının (σΔπ) üzerinde etkili onkotik basınç farkıdır.

Bireysel mikrodamarlar perfüzyon için Şekil 1. Microtools. (A) bir eğimli uç sıçan mikrodamarlar kanülasyon için bir mikropipet. (B) kanül takılması yerine yakın sabit bir mezenterik doku tutmak için bir süzgeç. (C) Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekilde, mikro 2. intravital teçhizat Şekil. (A) cam ayağı üzerinde yönelik mikromanipülatörlerle ve microtools hayvan tepsisinin bakış. (B) Büyük metal sahne mühendislik masa ve destek yatakları üzerinde monte edilmiş. Bir mikro damarın bir Şekilde, mikro pozisyonunda microtools (C) Anestetize sıçan. (D) Yakın Bir deney sırasında mezenter. Bu figu büyük halini görmek için tıklayınız yeniden.

Modifiye Landis tekniğini kullanarak birim alan başına filtrasyon hızı Şekil 3. Ölçümü. Bu şematik bir mikropipet ve geminin üzerine yerleştirilen bir tıkayıcı çubuk ile kanüle tek mikrodamar gösterir. Hücre yörünge tıkanıkları sonrası 5-10 saniye takip edilebilir, böylece hemen mikrodamar, tıkalı mikro damarın bir merkez üzerinde seyahat markör RBC arasındaki mesafeyi (ℓ ₀₎ ve oklüzyon sitesi kapatılmasıy sonra kaydedilir. Ilk konum (ℓ ₀₎ ve hücre başlangıç ​​hızı (dℓ / dt) bir markalama maddesi hücre ve oklüzyon bölgesi arasındaki mikrodamar duvarının ünite alan başına ortalama süzme oranı hesaplanmasında kullanılır. Microoccluder sonra yükseltilir ve ek ölçümler yapılmadan önce serbest perfüzyon kurdu.com / files / ftp_upload / 53210 / 53210fig3large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4. Örnek veriler sfingosin-1-fosfat (S1P) inhibisyonunun, çok hızlı hareket gösterir Bradikinin (BK, 10 nM). Mikrodamar L _p geçici bir artışa neden olmuştur. S1P ilk Bk akut Bk tepki göreli inhibe ikinci bradikinin (Bk) testi ile eşzamanlı olarak uygulanır. Bu veriler, bir test maddesine maruz kalma süresi önleyici bir cevabın aktivasyonu kinetiğini değerlendirmek için modifiye edilebilir olduğunu göstermektedir. Spesifik olarak, S1P Bk güçlü Bk yanıtı inhibe yalnızca ile birlikte yapılan uygulanır. S1P 1 uM ve Bk nM. 10 yaşındayken bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

_H / çoklu basınçlarda S hem de L _{p ve} etkili bir onkotik basıncı sağlayan ölçüm J Şekil 5. ölçülecek. Filtrasyon akısı, J _h / S, BSA ile perfüzyon (50 boyunca çeşitli mikro-damar hidrostatik basınç altında, bu kap içinde ölçülmüştür mg ml ^{- 1;} mezenter protein içermeyen Ringer solüsyonu ile yıkandığı iken π = 27 _cmH2O). J _v / S ve basınç arasındaki ilişkinin eğimi L _p ve basınç ekseninde kesişme damar duvarı boyunca etkili onkotik basınç farkını gösterir olduğunu. Bu deneyde Lp 1.2 × 10 ^-7 (cm sn ^-1 _cmH2O ^-1) ve σΔπ cmH _{2 O} 24 oldu <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53210/53210fig5large.jpg" target = "_ blank"> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Gemi serbestçe perfüze iken transvasküler sıvı hareketi meydana rağmen L _p hesaplamaları Detayları., Böyle bir değişim damar perfüzyon oranının% 0.01'den az, genellikle, çünkü serbest perfüzyon sırasında ölçülecek kadar çok küçük. Perfüzyon geçici mikrodamar, transvasküler akışını kapatılmasıy durdurulur Ancak, (yani, filtrasyon) 'de gösterildiği kısaltır gibi işaretleyici kırmızı hücre ve tıkanma sitenin arasında sıvı sütun olarak lümeninde işaretleyici kırmızı hücrelerin hareketi ölçülür Şekil 3. deneysel protokol uzunluğu 600 ila 1000 um tabi dallanmamış damar karmaşıklığı ve uzunluğuna bağlı olarak.

Gemi tıkanmış değildir ve manometre basıncı mikro damarın içinden akışı sürüş zaman serbest perfüzyon sırasında mikrovasküler basınç genellikle sadece bir yani, pipet boyunca basınç düşüşü büyükaşağı basıncının üzerinde birkaç cmH _{2 0.} Bunun aksine, bir oklüzyon sırasında pipet boyunca basınç düşmesi, sıvısı artık yavaş yavaş damar duvarı boyunca sıvı filtreleme yerine damar lümeni girmeden çok azdır. Böylece oklüzyon sırasında damar lümeni (P _c) hidrostatik basınç manometre ile bu seti eşittir. Mezenterik dokuda onkotik basıncı göz ardı edilebilir, bu nedenle hidrostatik basınç bilinen damar lümeninde onkotik basıncı perfüzat bu grubu eşittir yerde hemen tıkanmasından sonra, işaret alyuvarlardan transvasküler sıvı hareketleri ölçülmektedir. L _p ardışık ölçümleri ile damar uzunluğu blok sitesi gelişmiş her zaman kaybolur. Buna ek olarak, birbirini takip eden reka- nülasyona mevcut damar uzunluğu azaltır.

Damar duvarının (J _h / S) birim alan başına transvasküler sıvı akış oranından tahmin edilmektedir microv su sütunun Ölçülen uzunlukBir işaretleyici kırmızı hücre ve tıkanma sitesinden ya kısalır (net filtrasyon) veya uzatır (net reabsorbsiyonu) arasında Essel lümen. Varsayım damar lümeninin merkez hattı boyunca hareket eden nötr batmaz alyuvarlar hücreyi (su ortalama hız kırmızı hücre hızı oranı çevreleyen su kolonunun ortalama hızı izlemek için kullanılan bir 6 um için 1,8 yakın olmasıdır engelleyici doğru mm / sn bir işaretleyici hücresinin () hız V mm / sn tıkanıklığı sonra ilk 2-5 sn bitti ve eğer bir 30 mikron çapında kabındaki eritrosit). ^8,14 Böylece damar yarıçapı r ise, yani, kırmızı hücre ve oklüzyon (J _v) yeri arasında mikrodamar duvarı boyunca filtrelenmiş sıvı hacmi, mikrodamar varsayılarak ³ / sn um πr ² V, silindirik olmasıdır. ℓ markör hücre arasındaki başlangıç ​​mesafesi olan burada daha fazla bu markör hücre ve oklüzyon arasında silindir şeklinde bir mikro damarın (S) alanı, bir 2πrℓve tıkanma sitesi. Böylece su manometre Vr / (2ℓ) tarafından belirlenen basınçta birim alanda (J _v / S) başına ortalama başlangıç ​​transvasküler akışı.

Perfüzat onkotik basıncı mikrodamar basınç (tipik olarak 3,6 _cmH2O, 10 mg / ml ile, bir kılcal kısmın bir konsantrasyonda sığır serum albümini onkotik basınca kıyasla daha düşük ayarlandığında ise damar L _p basit tahmini yapılır Basınç daha büyük 30 _cmH2O). L _p olarak hesaplanır (J _v / S) / (P _c -3) cm / sn / cm _H 2 O kontrol devlet albümin yansıma katsayısı (σ _albümin) 0.9 yakın olduğundan. 1 dakika düzeyinde bir zaman çözünürlüğü ile L _p bu yaklaşım hızlı değişimler ile / S, Şekil 4'te temsili sonuçlarda görüldüğü gibi sabit bir basınçta. Yukarıdaki yaklaşım ig J _v ardışık önlemler arasında serbest akışını oluşturulması ile ölçülebiliryansıma katsayısı altına düştüğünde 0.5 _cmH2O az 1 düşmek albümin onkotik basınç küçük değişiklikler NORES, ancak P _c O _cmH2O 30'dan olduğunda L _p tahmininde hata% 5'ten az kalır .

Hem L _p ve yansıma katsayısı doğru ölçüm gerektiğinde, J _v / S testi makromolekül beklenen etkili onkotik basıncın altında mikrovasküler baskıların bir dizi ölçülür. Basınç ekseni üzerinde J _v / S ve basınç ölçer L _{p ve} kesişim arasındaki ilişkinin eğimi net akışı sıfır tedbirler σπ (Şekil 5) olduğunda. Jv doğrusal basınç ile ilgilidir gösteri onkotik basınç farkı hidrostatik basına düşük bağıl olduğu zaman da, yukarıda tarif edilen basit protokol kullanılarak, tek bir basınç ölçümlerinin önemli bir kullanım geçerliliği (Şekil 4)ure.

Olası hata kaynakları. Doğru ölçüm uzlaşma çeşitli sorunlar vardır. Düzgün nedeniyle transvasküler alışverişi hızlı daha tıkanıklığı sitesinde doğru sıvı tıkanıklığı sitesinde geçmiş sızıntı ve işaretleyici hücrelerin hareketinde tıkanıklık sitesi sonuçlarına damar duvarına gemi veya hasar tıkamak için başarısızlık. Işaretleyici hücreleri normalde tıkanıklığı sitesinde doğru yavaş hareket, ama ulaşamayan Oysa işaretleyici hücreleri tıkayıcı tüm yol izlemek durumunda, bir sızıntı gösterilir. Öte yandan, başarısızlık kanülasyon yerinde mikrovasküler lümenine pipet mühür J _v / S küçümsenmesi sonuçları. Superfusate veya kanulasyon memba damar lümen pipetle sıvı sızıntısı pipet boyunca belirgin bir basınç düşüşü olur. Bu tür bir sızıntı tespit edildiğinde aşağı akış tankı lu göre daha yüksek bir hızda mikropipet ucu akış hücreleriTıkalı damarın erkekler. Mikropipet Dikkatli konumlandırma genellikle böyle bir sızıntı mühürler. Damar duvarının L _p, tekdüze değildir, genellikle lokalize bir hasar veya enflamasyonun, bir veya daha fazla siteye sahip olan, farklı bir sorun ortaya çıkar. En transvasküler akışı konsantre ise Marker hücreleri siteye izleyebilirsiniz. Kırmızı hücre hareketi hala transvasküler akışını ölçer, ancak tedbir J _v / S testi segmenti içindeki duvar alanının en temsilcisi değildir.

Mevcut yöntemlere göre yöntemin önemi. En sık kullanılan iki yöntemler endotel bariyer geçirgenliği ve transvasküler değişim düzenlenmesini araştırmak için vardır (1) in vitro kültüre endotel hücre mono tabakaları ve izleyici birikimi (2) ölçümünde genelinde döviz ölçümü İzleyicinin sonra bir doku numunesi tüm hayvan intravenöz olarak enjekte edilir. Kültürlü endotel hücre tek tabakalarında deneyler f edilirHücresel fonksiyonlar daha doğrudan değiştirilebilir ve endotel hücrelerinde moleküler olayların detaylı değerlendirilmesi için kullanılabilir yeterli hücresel materyal olduğundan avored. Bununla birlikte en çok kültür koşulları altında, endotel hücreleri, genellikle in vivo vasküler geçirgenliğin engelleyici temsilcisine oluşturmaz. Yukarıda açıklanan modifiye Landis tekniği bozulmadan venüler mikrodamarlar endotel bariyer fonksiyonunun düzenlenmesini araştırmak için sağlam ve güvenilir bir teknik olduğu kanıtlanmıştır. Deneyimli bir araştırmacı elinde hücre kültüründe kullanılan yaklaşımlar bazı (örneğin, hücre bileşenlerinin görüntüleme, sinyal yollarının modifikasyonu) uygulanabilir kontrol ve test koşulları altında geçirgenliği ölçümleri eşleştirilmiş. Sağlam mikrodamarlar deney önemi bireysel perfüze microve bariyer geçirgenliğini düzenleyen mekanizmalar arasında önemli farklılıklar göstererek ortaya konmuşturssels ve bu genellikle kültürlenmiş endotel mono tabakaları tarif edilmiştir. Örnekler kesme yanıtları, trombin pozlama ve inflamatuar boşluk oluşumu ^2-6,9,16 kasılma mekanizmaları katkısı bulunmaktadır. Sağlam bir damar yatağında izleyici birikim ölçümleri veya bir artış olmadan daha normal fizyolojik fonksiyonu ancak izleyici birikimi artan perfüzyon (değişimi için yüzey alanı artırılmış) sonucunda artabilir, çünkü tehlikeye damar geçirgenliği gerçek değişikliklerin doğrudan soruşturma korur Duvarın geçirgenliği. Damar genişlemesi perfüze damarlarının sayısını arttırır ve bu şekilde, toplam çözünmüş madde birikimi sadece ³⁴ vasküler geçirgenlikte artırmak için nedeniyle daha büyük olduğu zaman nedenle geçirgenlik artışının kapsamı fazla tahmin edilebilir.

Gelecekteki uygulamalar. Seçenekleri arasında indi geçirgenliği ile aynı koşullar altında hücre yapısını ve işlevini değiştirmek içinŞekilde, mikro artması bekleniyor sırasında reysel gemiler doğrudan ölçülür. Bundan başka, genetik olarak tadil edilmiş sıçan mezenter yöntemlerin uygulanması genetik olarak tadil edilmiş fareler için var olan bir uzun süreli bir sorunu çözmeye gelmesi beklenmektedir. Genetiği değiştirilmiş fareler mevcut olunca Özellikle, Şekilde, mikro onların mezenterik damarlarda mikrodamarlar araştırmak için uzun olabilir bekleniyordu. Bazı sayılı Şekilde, mikro deneyleri fare mezenter ³⁵ Mikro damarların içinde tamamlanmış olsa da, fareler genellikle farelerde daha kendi mezenterik dokusunda daha az mikrodamarlar, ve daha uygun uzun (> 500 um), düz damarları aksine, bu kaplar, genellikle kısa ve oldukça dallanmış olduğu Sıçanlarda bulunabilir. Genetik fareler gibi Miles ^{34 veya} teknik olarak zor, ama daha güvenilir izleyici deneyleri tedbir olarak deneyleri yararlanmıştır böylece deneyler transvasküler değişim modülasyonu araştırmak içinvasküler ve radyoetiketli test probları ³⁶ floresan ekstravasküler birikimi hem de değişir.

Yöntemin değişiklikleri. Yukarıdaki protokollerde, perfüzat kompozisyonunda değişiklikler mikropipetlerin değişikliği gerekli. Alternatif bir yaklaşım doldurma aparatı kullanılarak yerinde mikropipet dolum olduğunu. Ayrıntılı olarak ³⁷ de tarif edildiği gibi bu prosedür gerçekleştirilmiştir. Sınırlama pipet yerine elde olarak pipetle perfüzat kompozisyonunu değiştirme zamanı kadar hızlı olmadığı, ancak uzun süre bir mikrodamar serpmek için gerekirse prosedür özellikle yararlıdır.

Geçirgenliği katsayılarının ölçmek için uzatılabilir yaklaştı Aynı Şekilde, mikro floresan çözünen ^31,38-40 etiketlenmiş. Bu durumda tek namlulu mikropipet pipet ⁴¹ çift namlulu (teta) ile değiştirilir ve damar perfüze olandönüşümlü Test floresan çözünen ile içerik lümen doku birikimi göreceli ölçmek ve floresan çözünen olmadan aynı Perfüzat dokusunu temizlemek ve solüt birikiminin tekrarlanan ölçüm izin vermek. Transvasküler su akışlarının ölçümleri floresan etiketli Test eriyiklerin kullanarak çözünen geçirgenlik katsayısı ölçümleri ile kombine edilecek olduğunda, hücre içi bileşimi ya da hücre bileşenlerinin konfokal görüntüleme floresan göstergeleri, daha sofistike bir bilgisayar kontrollü floresan mikroskop gereklidir. Bu araştırmalar genellikle daha yüksek büyütme ve çok daha kısa çalışma mesafesi olan lensler gerektirdiğinden, mezenter tutmak için kullanılan kuvars ayağı dokusu üzerinde de mikroskop tepsisine içinde pleksiglas desteği yapıştırılmış bir cam kapak slip ile değiştirilir. 3-D yazıcılar artan kullanılabilirliği, büyük Diamete konumlandırmak için gerekli olan dar tolerans karşılayan özel tepsiler, yüksek hassasiyetli üretimi sağlayacakSeçilen mikrodamarlar daha kısa çalışma mesafesi akrabası ile r lensler.

Mezenterinde kullanılabilir mikrodamarlar kullanılabilirliği yaş, cinsiyet ve zorlanma ile değişir. Bu nedenle, sıçan zorlanma ve belirli sorulara bağlıdır erkek veya kadın kullanımının seçimler ele alınmaktadır. Bizim son çalışmaların çoğu için biz genellikle mevcut uzun, düz mezenterik mikrodamarlar var bulmak hangi zaman yaşı yaklaşık 3-4 ay kullanımdan önce en az bir hafta bizim hayvan barınağında acclimated erkek Sprague-Dawley sıçanları kullandık. Buna karşılık, bizim arkadaşlarımız başarıyla 2-3 ay yaş ¹³ dişi Sprague-Dawley sıçanları kullandık.

Kırmızı hücrelerin rolü. Yukarıda açıklandığı gibi kırmızı hücrelerin birincil rolü hücre mikrodamarlar tıkalı edildikten sonra su nötr yüzer göstergeler akar gibi atıl hareket varsayarak su hareketini transvasküler izlemek oldu. Bu temel rolüne ek olarak, buŞimdi kırmızı hücrelerin mevcut ^31,42,43 içinde albümin zaman perfüzat için S1P sağlayarak bariyerin istikrarına katkıda kabul edilmektedir. Bu gözlemlerin pek çok önemli etkileri vardır. Kırmızı kan hücreleri; ya da alternatif atıl akış markerlerinin kullanımı ile yokluğunda temel geçirgenliği daha az kararlı olma olasılığı yüksektir. Bu S1P ölçümleri sayılı Şekilde, mikro deneylerde kullanılan tüm Perfüzatlar yapılması tavsiye edilmektedir.

Acknowledgments

Bu çalışma Sağlık yardımları HL44485 ve HL28607 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MICROSCOPE, TABLE AND STAGE
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Olympus	CK-40	try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Leica	DMIL	try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
narrow diameter, long working distance objective: example	Nikon	Nikon E Plan 10×/0.25 LWD
stage platform--1/2 inch or 1 cm sheet steel	welding shop		this should be heavy to reduce vibration
Unislide x-y table: dove tail slides	Velmex	AXY4006W1
VIDEO
CCD video camera: example	Pulnix	TM-7CN (no longer available)	no color needed
video capture system with audio--generic
video playback system (completely still frame, single frame motion)
small microphone
MICROMANIPULATORS, HOLDERS
micromanipulator, XYZ (3)	Prior/Stoelting (no longer available)		look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning
hydraulic probe drive, one way	FHC	50-12-1C	need to buy either manual drive or electronic drive
manual drum drive	FHC	50-12-9-02
or hydraulic drive, 3 way	Siskiyou Corporation	MX610 (1-way) or MX630 (3-way)	great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years
connectors/rods/holders	Siskiyou Corporation	MXC-2.5, MXB etc.
pin vise	Starrett	162C	to hold restrainer
pipette holder	World Prescision Instruments	MPH3
water manometer ~120 cm
MICROSCOPE TRAY
clear Plexiglas for microscope tray for animal
3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall	Quartz Scientific Inc.	custom	(or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective
Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)
medical adhesive for tissue well	NuSil	MED-1037
All-purpose silicone rubber heat mat, 5" L x 2" W	Cole Parmer	EW-03125-20	heater for microscope tray--needs cord and controller--240V version available
Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC	Cole Parmer	EW-03122-75
STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out	Cole Parmer	EW-01575-00
PIPET MANUFACTURE
vertical pipette puller	Sutter Instrument Company	P-30 with nichrome filament
1.5 mm OD thin wall capillary tubing	Sutter Instrument Company	B150-110-10
pipette grinder air stone and dissection microscope--see reference in text			or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments
RX Honing Machine, System II	RX Honing Machine Corporation	MAC-10700 Rx System II Machine	alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle
with ceramic sharpening disc	RX Honing Machine Corporation		use "as is" or attach lapping film
lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um	3M	part no. 051144 80827	268X Imperial lapping film sheets with adhesive back--can be purchased from Amazon

References

1. Curry, F. R. Permeability measurements in an individually perfused capillary: the 'squid axon' of the microcirculation. Experimental physiology. 93, 444-446 (2008).
2. Curry, F. R., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
3. Curry, F. R., Adamson, R. H. Tonic regulation of vascular permeability. Acta physiologica. 207, 628-649 (2013).
4. Michel, C. C. Fluid exchange in the microcirculation. The Journal of physiology. 557, 701-702 (2004).
5. Tarbell, J. M., Simon, S. I., Curry, F. R. Mechanosensing at the vascular interface. Annual review of biomedical engineering. 16, 505-532 (2014).
6. Sarelius, I. H., Kuebel, J. M., Wang, J., Huxley, V. H. Macromolecule permeability of in situ and excised rodent skeletal muscle arterioles and venules. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 290, H474-H480 (2006).
7. Curry, F. E., Frokjaer-Jensen, J. Water flow across the walls of single muscle capillaries in the frog, Rana pipiens. The Journal of physiology. 350, 293-307 (1984).
8. Michel, C. C., Mason, J. C., Curry, F. E., Tooke, J. E., Hunter, P. J. A development of the Landis technique for measuring the filtration coefficient of individual capillaries in the frog mesentery. Q J Exp Physiol Cogn Med Sci. 59, 283-309 (1974).
9. Adamson, R. H., Zeng, M., Adamson, G. N., Lenz, J. F., Curry, F. E. PAF- and bradykinin-induced hyperpermeability of rat venules is independent of actin-myosin contraction. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 285, H406-H417 (2003).
10. Huxley, V. H., Rumbaut, R. E. The microvasculature as a dynamic regulator of volume and solute exchange. Clinical and experimental pharmacology, & physiology. 27, 847-854 (2000).
11. Rumbaut, R. E., Wang, J., Huxley, V. H. Differential effects of L-NAME on rat venular hydraulic conductivity. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. , 279-H2023 (2000).
12. Yuan, D., He, P. Vascular remodeling alters adhesion protein and cytoskeleton reactions to inflammatory stimuli resulting in enhanced permeability increases in rat venules. Journal of applied physiology. 113, 1110-1120 (2012).
13. Zhou, X., He, P. Temporal and spatial correlation of platelet-activating factor-induced increases in endothelial [Ca(2)(+)]i, nitric oxide, and gap formation in intact venules. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 301, H1788-H1797 (2011).
14. Adamson, R. H., et al. Oncotic pressures opposing filtration across non-fenestrated rat microvessels. The Journal of physiology. 557, 889-907 (2004).
15. Adamson, R. H., et al. Epac/Rap1 pathway regulates microvascular hyperpermeability induced by PAF in rat mesentery. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 294, H1188-H1196 (2008).
16. Curry, F. E., Zeng, M., Adamson, R. H. Thrombin increases permeability only in venules exposed to inflammatory conditions. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 294, H1188-H1196 (2003).
17. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature. 32, 347-355 (2014).
18. Bagher, P., Davis, M. J., Segal, S. S. Intravital macrozoom imaging and automated analysis of endothelial cell calcium signals coincident with arteriolar dilation in Cx40(BAC) -GCaMP2 transgenic mice. Microcirculation. 18, 331-338 (2011).
19. Duza, T., Sarelius, I. H. Increase in endothelial cell Ca(2+) in response to mouse cremaster muscle contraction. The Journal of physiology. 555, 459-469 (2004).
20. Oshiro, H., et al. L-type calcium channel blockers modulate the microvascular hyperpermeability induced by platelet-activating factor in vivo. Journal of vascular surgery. 22, 732-739 (1995).
21. Chen, W., et al. Atrial natriuretic peptide-mediated inhibition of microcirculatory endothelial Ca2+ and permeability response to histamine involves cGMP-dependent protein kinase I and TRPC6 channels. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 33, 2121-2129 (2013).
22. Harris, N. R., Whitt, S. P., Zilberberg, J., Alexander, J. S., Rumbaut, R. E. Extravascular transport of fluorescently labeled albumins in the rat mesentery. Microcirculation. 9, 177-187 (2002).
23. Yuan, W., Li, G., Zeng, M., Fu, B. M. Modulation of the blood-brain barrier permeability by plasma glycoprotein orosomucoid. Microvascular research. 80, 148-157 (2010).
24. Sugiura, Y., Morikawa, T., Takenouchi, T., Suematsu, M., Kajimura, M. Cilostazol strengthens the endothelial barrier of postcapillary venules from the rat mesentery in situ. Phlebology / Venous Forum of the Royal Society of Medicine. 29, 594-599 (2014).
25. Guo, M., et al. Fibrinogen-gamma C-terminal fragments induce endothelial barrier dysfunction and microvascular leak via integrin-mediated and RhoA-dependent mechanism. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 29, 394-400 (2009).
26. Dewar, A. M., Clark, R. A., Singer, A. J., Frame, M. D. Curcumin mediates both dilation and constriction of peripheral arterioles via adrenergic receptors. The Journal of investigative dermatology. 131, 1754-1760 (2011).
27. Lee, J. F., et al. Balance of S1P1 and S1P2 signaling regulates peripheral microvascular permeability in rat cremaster muscle vasculature. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 296, H33-H42 (2009).
28. Landis, E. M. Microinjection studies of capillary permeability. II. The relation between capillary pressure and the rate at which fluid passes through the walls of single capillaries. Am J Physiol. 82, 217-238 (1927).
29. Curry, F. E., Huxley, V. H., Sarelius, I. H. Techniques in cardiovascular physiology Part 1. Linden, R. J. P3/1, Elsevier Scientific Publishers Ireland Ltd. 1-34 (1983).
30. Vurek, G. G., Bennett, C. M., Jamison, R. L., Troy, J. L. An air-driven micropipette sharpener). J Appl Physiol. 22, 191-192 (1967).
31. Curry, F. E., Clark, J. F., Adamson, R. H. Erythrocyte-derived sphingosine-1-phosphate stabilizes basal hydraulic conductivity and solute permeability in rat microvessels. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 303, H825-H834 (2012).
32. Bagher, P., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Microiontophoresis and micromanipulation for intravital fluorescence imaging of the microcirculation. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
33. Adamson, R. H., et al. Attenuation by sphingosine-1-phosphate of rat microvessel acute permeability response to bradykinin is rapidly reversible. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 302, H1929-H1935 (2012).
34. Bates, D. O. Vascular endothelial growth factors and vascular permeability. Cardiovasc Res. 87, 262-271 (2010).
35. Adamson, R. H., et al. Rho and rho kinase modulation of barrier properties: cultured endothelial cells and intact microvessels of rats and mice. The Journal of physiology. 539, 295-308 (2002).
36. Curry, F. R., et al. Atrial natriuretic peptide modulation of albumin clearance and contrast agent permeability in mouse skeletal muscle and skin: role in regulation of plasma volume. The Journal of physiology. 588, 325-339 (2010).
37. Neal, C. R., Bates, D. O. Measurement of hydraulic conductivity of single perfused Rana mesenteric microvessels between periods of controlled shear stress. The Journal of physiology. 543, 947-957 (2002).
38. Adamson, R. H., et al. Albumin modulates S1P delivery from red blood cells in perfused microvessels: mechanism of the protein effect. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 306, H1011-H1017 (2014).
39. Huxley, V. H., Wang, J. J., Sarelius, I. H. Adaptation of coronary microvascular exchange in arterioles and venules to exercise training and a role for sex in determining permeability responses. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 293, H1196-H1205 (2007).
40. Huxley, V. H., Williams, D. A. Basal and adenosine-mediated protein flux from isolated coronary arterioles. Am J Physiol. 271, H1099-H1108 (1996).
41. Davis, M. J., Gore, R. W. Double-barrel pipette system for microinjection. Am J Physiol. 253, H965-H967 (1987).
42. Adamson, R. H., et al. Sphingosine-1-phosphate modulation of basal permeability and acute inflammatory responses in rat venular microvessels. Cardiovasc Res. 88, 344-351 (2010).
43. Zeng, Y., Adamson, R. H., Curry, F. R., Tarbell, J. M. Sphingosine-1-phosphate protects endothelial glycocalyx by inhibiting syndecan-1 shedding. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. , H306-H363 (2014).

Tags

Moleküler Biyoloji Sayı 103 Şekilde mikro sıçan mezenter hidrolik iletkenlik geçirgenlik Landis tekniği