Summary
هذا البروتوكول يعيد الفسيولوجية أو المرضية تدفق الدم في المختبر للمساعدة في تحديد استجابة الخلايا في أمراض المرض. عن طريق إدخال ضغط التخميد غرفة المصب مضخة الدم، وتدفق الدم عبر الأوعية الدموية ويمكن تلخيصها وفرضت على أحادي الطبقة من بطانة الأوعية الدموية أو المحاكاة ثقافة مشتركة.
Abstract
أمراض الأوعية الدموية هو سبب شائع للوفاة في الولايات المتحدة. هنا، فإننا نقدم وسيلة لدراسة مساهمة ديناميكية تدفق نحو الأمراض أمراض الأوعية الدموية. الشرايين غير صحية غالبا ما تكون موجودة مع تشنج الجدار، تندب، أو تضيق جزئي والتي قد تؤثر على جميع معدلات تدفق السوائل، وحجم تدفق نابض، أو مؤشر pulsatility. تكرار ظروف تدفق مختلف هو نتيجة لضبط ضغط تدفق التخميد غرفة المصب مضخة الدم. إدخال الهواء داخل نظام تدفق مغلقة تسمح وسيلة للانضغاط على امتصاص ضغط نابض من المضخة، وبالتالي تختلف مؤشر pulsatility. الطريقة الموضحة في هذه الوثيقة ويرد بكل بساطة، مع إدخال السيطرة عليها إلى حد كبير، ونتائج قابلة للقياس بسهولة. بعض القيود هي الترفيه من التعقيد الفسيولوجية الموجي النبض، والذي يقترب فقط من قبل النظام. تتأثر الخلايا البطانية، وخلايا العضلات الملساء، والخلايا الليفية من قبل عبتي تدفق الدمough الشريان. يتم تحديد العنصر الديناميكي لتدفق الدم عن طريق الانتاج وجدران الشرايين القلبية الامتثال. الأوعية الدموية خلية والميكانيكية تنبيغ ديناميكية تدفق قد تؤدي إلى إطلاق سراح خلوى وعبر الحديث بين أنواع الخلايا داخل الشريان. شارك في ثقافة من خلايا الأوعية الدموية هي صورة تعكس أكثر دقة التفاعل خلية خلية على جدار الأوعية الدموية والأوعية الدموية استجابة لإشارات الميكانيكية. مساهمة ديناميكية تدفق، بما في ذلك استجابة الخلية إلى عناصر دينامية ويعني (أو ثابتة) من التدفق، وبالتالي فهو مقياس مهم في تحديد علم الأمراض وفعالية العلاج. من خلال إدخال في المختبر نموذج التعاون ثقافة وضغط التخميد المصب من ضخ الدم الذي ينتج النتاج القلبي محاكاة، قد يتم التحقيق مختلف الأمراض مرض الشرايين.
Introduction
معدلات الإصابة بالأمراض لأمراض القلب والشرايين هي الأكبر في أميركا، مع ما يترتب على كثير من الأوعية الدموية غير صحية. تتكون الشرايين سليمة من الأنسجة المرنة، مع سطح اللمعية الناعمة المغلفة مع خلية البطانية (EC) أحادي الطبقة. قد تكون على غرار تدفق الدم باعتبارها وظيفة موجة تتأرجح مع معدل تدفق متوسط إيجابي. مؤشر pulsatility (PI) هو حاصل من حجم التذبذب ويعني تدفق (PI = (ماكس - مين) / متوسط) (1)، وقد غرار في المختبر مع مرونة الأوعية متغير 2 الشرياني مرونة مهمة في تخزين التدفق. الطاقة من انقباضات القلب، معلقا تحت ضغط الانقباضي، وتلعب دورا هاما في تحوير PI تدفق الدم. لأن يحافظ على قلب ثابت، نابض، التدفق الحجمي، وتوسيع الشرايين ويزيد من مساحة العابرة للقطاعات، وتعزيز الاستقرار عن طريق الحد من تدفق سرعة تدفق، إجهاد القص، وPI. في كثير من الأحيان، والتغيرات الشرايين غير الصحية الحالية للمرونةأو الامتثال، وعرض تشنج من إعادة الأوعية الدموية، وندبا أو تكلس 3، 4. بالإضافة إلى ذلك، واضطرابات الأوعية الدموية الأخرى، مثل تضخم neointimal (NIH)، 5 تمدد الأوعية الدموية وارتفاع ضغط الدم وتليف الأوعية الدموية 6 4، قد انقباض قطر السفينة. ومع ذلك، العلاج من تعاطي المخدرات الحالية ومعالجة الجهاز من أمراض الأوعية الدموية في كثير من الأحيان يتجاهلون أهمية الامتثال جدار الوعاء الدموي أو تدفق الدم ديناميكية في أمراض الأوعية الدموية التي كثيرا ما تتسبب بتغيرات في التشكل السفينة والممتلكات. لا قسطرة البالون ولا الدعامات لرد على مضاعفات جدار مرونة 7. لذلك، في المختبر نمذجة تدفق الدم الناتج عن أمراض الشرايين وعلاجات مهمة في التحقيق في الأمراض المرض وفعالية في المستقبل من العلاج. هنا، نحن تصف طريقة تكرار الفسيولوجية والمرضية تدفق الدم تهدف إلى تحديد استجابة الخلايا في pathol أمراض الأوعية الدمويةogies. يسبب تدفق السوائل إجهاد القص في جدار الوعاء الدموي، وهي إشارة الميكانيكية الهامة في مجال الصحة السفينة، مما يؤثر على كل الخلايا داخل الأوعية الدموية. وقد تم تحديد عدد من أجهزة الاستشعار الميكانيكية على بطانة الأوعية الدموية للالقص السوائل، بما في ذلك هدب الأساسي هو مبين في الدراسات الحديثة عن البطانية mechanosensing 8. تتأثر نشاط الخلايا البطانية والتشكل من خلال سرعة تدفق والتوجيه، وpulsatility. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تتأثر خلايا العضلات الملساء (SMC) الهجرة عن طريق الاشارات والميكانيكية من انخفاض سرعة تدفق من خلال الخلالي السوائل 9، ويمكن أيضا أن تكون من خلال الإشارات نظير الصماوي من الخلايا البطانية من خلال استجابتها لتدفق ووالميكانيكية تنبيغ إشارات التدفق عبر خلوى الإفراج عن 10. و"جرعة" اعتماد القص نفسه، PI، ويشير نظير الصماوي قد تكون مترابطة أيضا. تحقيقا لهذه الغاية، وتحديد استجابة الخلايا الوعائية إلى القص السوائل مع متنوعة "الجرعات" في الثقافة أحادي الطبقةأو زملاء الثقافة في المختبر يمكن أن توفر رؤى الآلية في إعادة الأوعية الدموية وتحسين المرض والتنبؤ العلاج. نظام تدفق المستخدمة في هذه التجربة يتكون من مضخة الدم، تدفق التخميد خزان الهواء المنبع، تدفق متر المصب يستخدم فقط أثناء الإعداد التجريبية، ثقافة الخلية المصب، موازية لوحة غرفة تدفق، وخزان وسائل الإعلام. السيطرة على المتغيرات تدفق الأوعية الدموية مثل يعني معدل التدفق، يدق في الدقيقة الواحدة، ويمكن أن يتحقق من خلال PI السيطرة على معدل التدفق، وتواتر النبض، وإدخال ضغط التخميد. هي مضخات الدم نابض المتاحة مع نزوح السكتة الدماغية متغير، في تواتر السكتات الدماغية التي تسيطر عليها، تتصل مباشرة يعني معدل التدفق الحجمي، وتواتر النبض. مقدمة من خزان الهواء داخل الدائرة تدفق يسمح للضغط التخميد، والحد من حجم التذبذب التدفق. وسائل الإعلام هو سائل غير قابل للإنضغاط، في حين أن الهواء داخل غرفة التخميد هو انضغاط، مما يسمح للضغط الزائد من موجة تدفق لتكونتمتصه ضغط الهواء. الهواء لنسبة وسائل الإعلام يسمح للسيطرة على كيفية حدوث الكثير من التخميد. تم إنشاء مخصص الثقافة خلية تدفق غرفة 75 ملم في الطول بمقدار 50 ملم في العرض من الاكريليك. يدخل التدفق من خلال مدخل الميناء، ويوسع من خلال فتحة متعددة، وتوفير تدفق ثابت عبر مجمل غرفة التدفق. تدفق وهياكل مماثلة موجودة في منفذ الغرفة. هي المصنفة الخلايا على الشرائح functionalized، وتعلق بعد ذلك إلى غرفة التدفق. وهذا يسمح لعدد كبير من السكان واسترجاعها بسهولة بعد الدراسة. تجارب المشارك الثقافة قد تستخدم غشاء البولي يسهل اختراقها للقضاء على اتصال خلية الى خلية بين الثقافات بينما يسمح النقل خلوى / التدفق. وقد سبق استخدام هذا النظام لنمذجة تدفق PI عالية وتأثيره على الثقافة أحادي الطبقة البطانية وEC / SMC شارك في الثقافة 1، 10، للتحقيق في استجابة الخلايا للأمراض PI عالية بشكل مرضي. من خلال وصف بروتوكول يستخدم لنمذجتها يخدع تدفقditions، ونأمل في مساعدة الآخرين في تحديد مساهمة إشارة تدفق إلى استجابة الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Silanization وجزيء حيوي Functionalization من الشرائح أو البولي غشاء
ملاحظة: العديد من المواد الكيميائية والحلول في هذا البروتوكول لديهم معدلات التبخر عالية (الإيثانول (ETOH)، والأسيتون، وغيرها). خطوات أخرى تستلزم مرات حضانة طويلة لمعدلات التبخر منخفضة. يوصى فيلم البرافين لختم الحاويات. تحذير: تعتبر خطرة، أو متقلبة: العديد من المواد الكيميائية (حمض الكبريتيك، والأسيتون، (3-أمينو) triethoxysilane، غلوتارالدهيد، ETOH بما في ذلك). استشارة رقة بيانات سلامة المواد (MSDS) من كل مادة لتخزين السليم، والمناولة، والتخلص منها قبل الاستخدام.
- وضع شريحة زجاجية جديدة قياس 75 مم 50 مم 1 ملم، في نظيفة، شريحة زجاجية طبق تلطيخ بغض النظر عن التوجه، وضمان الانغماس الكامل. استخدام حاوية لخطوات 1،1-1،12.
ملاحظة: لثقافة مشتركة، تشمل البولي (PC) الغشاء مع 0،4 ميكرون حجم المسام، وقطع لحجم 75 مم 50 مم، لجميع الظريف لاحقاملاحظة لfunctionalization PC وEC البذر. - تزج الشرائح في حامض الكبريتيك (20٪)، O / N.
تحذير: استشر MSDS لحامض الكبريتيك قبل الاستخدام. - تغسل الشرائح عن طريق غمر في الماء منزوع الأيونات (DI) لمدة 5 دقائق، ثلاث مرات، وتغيير DI كل مرة.
- تزج الشرائح في الأسيتون لمدة 30 دقيقة.
تحذير: استشر MSDS لالأسيتون قبل الاستخدام. - تزج الشرائح في 6٪ (3-أمينو) حل triethoxysilane / الأسيتون O / N.
تحذير: استشر MSDS ل(3-أمينو) triethoxysilane والأسيتون قبل الاستخدام. - تزج الشرائح في الأسيتون لمدة 5 دقائق، ثلاث مرات، وتغيير الأسيتون في كل مرة.
تحذير: استشر MSDS لالأسيتون قبل الاستخدام. - تغسل الشرائح عن طريق غمر في DI لمدة 5 دقائق، ثلاث مرات، وتغيير DI كل مرة.
- تزج الشرائح في 1.5٪ محلول غلوتارالدهيد / DI لمدة 60 دقيقة.
تحذير: استشر MSDS لغلوتارالدهيد قبل الاستخدام. - تغسل الشرائح عن طريق غمر في DI لمدة 5 دقائق، مرتين، وتغيير DI كل مرة.
- مكان الشريحةالصورة إلى 70٪ من الإيثانول (ETOH) لمدة 30 دقيقة في العقيمة، غطاء تدفق الصفحي.
- إزالة ETOH والسماح بقايا لتتبخر المتبقية. تزج الشرائح في DI معقمة وهجرة من أجل ترطيب الشرائح.
ملاحظة: الشرائح أو قد تكون مختومة غشاء PC في حامل شريحة زجاجية وتخزينها في 4 درجات مئوية تصل إلى أسبوع واحد. عند الاستخدام لزراعة الخلايا، كرر الخطوات من 1.10 و 1.11. - إزالة الشريحة من حامل الشرائح ووضعه في 100 ملم 100 ملم طبق بتري مربع في غطاء تدفق الصفحي.
ملاحظة: سيتم استخدام هذه الحاويات لجميع الخطوات المتبقية.- إعداد الشريحة أو PC لزرع الخلايا البطانية لتجربة زراعة محصول واحد.
- معطف الشريحة functionalized أو PC (الخطوة 1.11) مع 1 مل من محلول فبرونيكتين (25 ميكروغرام / مل)، على جانب واحد، وتغطي مساحة تقارب تتعرض لغرفة زراعة الخلايا.
- احتضان الشرائح أو PC في حاضنة معقمة وضعت في 37 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة.
- بعد الحضانة، ونضح الحل المتبقية باستخدام غلاSS الشافطة ماصة متصلة فراغ.
ملاحظة: الشرائح يمكن الآن المخزنة O / N عند 4 درجات مئوية لاستخدامها في المستقبل.
- اتبع الخطوات 1.12.2 فقط لإعداد EC / SMC ثقافة مشتركة. إعداد والبذور الملساء الخلايا العضلية (SMC) ثقافة لتجربة الثقافة المشتركة.
- المكان سيليكون طوقا على رأس الشريحة (الخطوة 1.11)، مع أبعاد 75 مم 50 مم القطر الخارجي، قطرها الداخلي 50 ملم بنسبة 30 مم، سماكة 0.5 مم، والثقوب التي تتماشى مع غرفة تدفق فراغ.
- إعداد 1 مل SMC في 10٪ FBS / DMEM تعليق. تحييد 1 مل من محلول من 2 ملغ / مل الكولاجين النوع الأول بنسبة 7٪ NaHCO 3 و 0.1 M محلول هيدروكسيد الصوديوم لدرجة الحموضة من 7.4، وتخلط مع SMC تعليق مع كثافة الخلية النهائية من 2 × 10 6 خلية / مل.
- نشر الحل SMC داخل حشية واحتضان الشرائح عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 30 دقيقة.
- بعد الحضانة، وتغطية الشريحة مع المصل 25 مل 0.1٪ بقري جنيني (FBS) مختلطة في لDulbecco التعديلالنسر المتوسطة (DMEM) لمدة 72 ساعة.
- إعداد الشريحة أو PC لزرع الخلايا البطانية لتجربة زراعة محصول واحد.
- الخلايا البطانية الثقافة (ECS) على الغشاء شريحة زجاجية / البولي.
- البذور 1 مل ECS في 10٪ FBS / DMEM، مع التركيز الأولي من 6.0 × 10 5 خلية / مل، على الأسطح فبرونيكتين من شريحة زجاجية أو غشاء البولي.
- احتضان الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2، وFBS 10٪ لمدة 120 دقيقة.
- الشرائح غطاء تحتوي على خلايا مع إضافية 10٪ FBS / DMEM، ومكان في الحاضنة في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 O / N، حتى 70٪ -80٪ متموجة.
2. تحديد اللزوجة السائل ومعدل التدفق الحجمي
ملاحظة: مقاييس اللزوجة الدوارة هي المعدات الحساسة، وينبغي الرجوع إلى دليل المستخدم جهاز قياس اللزوجة قبل معايرة، التصفير، أو أداء القياسات.
- تحديد القص السوائل المطلوب (τ) من أدب الأوعية الدموية استهدفت التجربة و.
- قياس آثافةه 1٪ FBS / DMEM اللزوجة (μ)، وذلك باستخدام جهاز قياس اللزوجة الدوراني.
- تحديد المطلوب معدل التدفق الحجمي (Q) من بوازوي المعادلة:
،
حيث τ = السوائل القص، μ = اللزوجة، Q = المجلد. معدل التدفق، ث = غرفة العرض، وح = ارتفاع الغرفة). - وضع مضخة لمعدل المستمدة في الخطوة 2.3 تتدفق، واستخدام لجميع الخطوات اللاحقة.
، 3. تحديد مؤشر Pulsatility
ملاحظة: يجب أن تكون متصلا جميع منافذ اتصال داخل منظومة مع قفل حلقة إلى شوكة بحجم مناسب، أو الإناث اتصالات بالتركيبة إلى تعليق لاذع. ثم قد تكون مرتبطة توصيل أنابيب PVC إلى التجهيزات تعليق لاذع، وأكملت الدائرة.
- ربط الدائرة تدفق كما في الشكل 2، مع التخميد غرفة (الشكل 3) وبالموجات فوق الصوتية متر تدفق في اتجاه وتدفق الصحيح.
ملاحظة: بالموجات فوق الصوتية تدفق متر هو جزء حساس من المعدات، ووينبغي استشارة دليل المستخدم قبل استخدام. - ملء الدائرة التدفق والخزان بالماء DI، من خلال ضمان أنبوب مخرج الخزان (ضخ) هي غارقة داخل حجم الخزان. تصور الموجي تدفق باستخدام تدفق متر.
- فتح صمام إطلاق الهواء في الغرفة التخميد لتغيير نسبة حجم السائل / الهواء. انهيار صمام إطلاق الهواء على فترات مختلفة مستوى السائل وحساب مؤشر pulsatility (PI = (V ماكس - V مين) / V الوسط) باستخدام ذروة الموجي تدفق (V ماكس)، الحوض الصغير (V مين)، ويعني (V الوسط). سجل القيم PI في دفتر الملاحظات.
- علامة أدى مستوى السوائل وPI على غرفة التخميد، وذلك باستخدام شعر يميل، قلم حبر دائم للاستخدام في المستقبل. تحديد مستويات PI المرجوة من أمراض الأدب 11.
- السيليكون أنبوب Formation- الاختياري، طريقة أكثر تقدما من السيطرة على pulsatility
- مزيج قاعدة سيليكون المطاط الصناعي وكيل علاج في نسب مختلفة (على سبيل المثال، لوبانسبة الإلكتروني إلى crosslinker من 10: 1 إلى 36: 1) لاختلفت الرجوعية المرنة المستهدفة، كما هو موضح سابقا 2
- افتعال أنابيب السيليكون بتكرار عملية تراجع، علاج، لينخفض لفترة وجيزة قنية الصلب (14 G) إلى سيليكون خليط prepolymer مع نسبة محددة سلفا قاعدة إلى crosslinker.
- وضع قنية المغلفة prepolymer في فرن وضعت في 60 درجة مئوية لمدة 4 ساعات لعلاج طلاء البوليمر على قنية، والتحول الاتجاه في منتصف عملية المعالجة.
- تكرار عملية غمس مع نفس خليط سيليكون المطاط الصناعي ووضع مرة أخرى في الفرن لمدة 4 ساعات إضافية، مما يؤدي إلى ~ 0.3 ملم أنابيب سميكة.
- إزالة أنبوب سامسونج سيليكون من قنية الفولاذ المقاوم للصدأ.
- توصيل أنابيب تدفق الدائرة بدلا من التخميد غرفة، واختبار PI لكل واحد كما في 3.3.
4. مضخة التعقيم
- تزج غرفة التدفق (الشكل 2)، الأنابيب البلاستيكية، وحشيات في 10٪ بيروكسيد الهيدروجين (H 2 O 2). يغسل مع DI معقم قبل الخطوة 4.
- وضع مضخة الدم على الرف حاضنة الفراغ.
ملاحظة: يجب أن تكون الرفوف حاضنة الفولاذ المقاوم للصدأ، وتكون قادرة على دعم وزن الدائرة تدفق بأكملها. - ملء الدائرة التدفق والخزان مع 10٪ H 2 O 2 عن طريق ضمان أنبوب مخرج الخزان (ضخ) هي غارقة داخل حجم الخزان. تعميم H 2 O 2 عن طريق الضخ عبر الدائرة لمدة 20 دقيقة في غطاء تدفق الصفحي مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية على.
- نضح عن H 2 O 2 من الأنابيب، ويغسل مع برنامج تلفزيوني العقيمة التي كتبها الضخ عبر الدائرة التدفق.
5. تدفق الجمعية الغرفة
ملاحظة: تتكون غرفة التدفق من الاكريليك، لوحة العرف، مع منافذ فراغ ومدخل والموانئ تدفق منفذ (انظر الشكل 2). ويتألف مجلس غرفة من وضع غرفة التدفق وحشيات على رأس الشرائح الثقافة، والمؤيدperly الانحياز، ويوصف أدناه.
- الاحماء 1٪ FBS / DMEM في 37 ° C حمام المياه وإعداد غرفة التدفق.
- اتخاذ EC تنزلق للخارج وسائل الإعلام (من الخطوة 1.13) ومكان طوقا على أعلى مع الجانب الخلية يصل.
- (اختياري) اتخاذ غشاء PC من وسائل الإعلام (من الخطوة 1.13) ومكان طوقا على أعلى مع الجانب الخلية يصل. ضع الشريحة ثقافة مشتركة مع المصنفة SMC (الخطوة 1.12.2) تحت غشاء PC.
- محاذاة قناة فراغ الغرفة تدفق مع الفتحات الموجودة في طوقا (الشكل 2).
- إرفاق فراغ أنبوب إلى الموانئ فراغ (الشكل 2) ضمان عدم تسرب سائل الإعلام إلى فراغ.
- ورقة البولي مكان تحت شريحة زجاجية وتدفق المشبك التجمع الغرفة مع المشابك الربيع، واحدة على كل جانب من غرفة التدفق (أرقام 2 و 5).
- النظام مكان تدفق في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2، وملء الدائرة مع وسائل الاعلام عن طريق الضخ من الخزان شغل في انخفاض pulsatility.الحفاظ على هذا التدفق لمدة 4 ساعة لشروط مسبقة الخلايا.
- ضبط حجم السائل في التخميد الغرفة إلى مستوى PI ملحوظ، والثقافة عن الوقت المطلوب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الحفاظ على ظروف التدفق هي التي تعتمد على التجميع الصحيح من الدائرة تدفق (الشكل 1). أنابيب قطرها هو اختيار هامة في التجمع، وبأقطار أكبر خفض مقاومة تدفق وهبوط الضغط لاحق قبل وبعد غرفة الثقافة. لضمان يقصد الضغط وسرعة تدفق وتجميع النظام مع تدفق متر قبل التجربة مع أنابيب المقصود. محاذاة غرفة الثقافة فراغ قناة (الشكل 2)، مع ثقوب في طوقا السيليكون (وليس في الصورة)، ويحافظ على ختم داخل الدائرة التدفق. لضمان الختم، يمكن استخدام المشابك الربيع لممارسة ضغوط إضافية على حشية. ينبغي حماية الشرائح الزجاجية التي كتبها ورقة البولي، وقطع لتناسب مساحة غرفة (الشكل 6). بسبب سرعة تدفق قد تساهم بالإضافة إلى مضاعفات في الحفاظ على الأختام، يجوز تغيير وسائل الاعلام من خلال إضافة ديكستران لزيادة اللزوجة وسائل الإعلام. من خلال زيادة viscosإيتي، يمكن الحفاظ على القص السوائل في أقل سرعة. يمكن مراجعة استجابة النظام والنزاهة في منتصف التجربة ببساطة من خلال مراقبة مستويات السوائل ولون السائل داخل غرفة التخميد وخزان (الشكل 3). مستوى السوائل يجب الحفاظ على قيمة ثابتة. يجب وضع علامة مستوى السائل الأولي على كل خزان والتخميد غرفة للمقارنة فحص. ويمكن إجراء التعديلات من خلال إضافة وسائل الإعلام في بدء التجربة، أو السماح للدخول الهواء إلى غرفة التخميد الشكل 4 يوضح تسجيل تمثيلية من سرعة التدفق. يجب أن تنخفض الفينول تلوين أحمر على مدى التجربة. عند الانتهاء من التجربة، يجب السماح لوسائل الاعلام لاستنزاف من الدائرة، وتخزينها في الفريزر -80 درجة مئوية لقياس أو استخدامها في المستقبل. ويمكن تحليل وسائل الاعلام عن محتوى الأيض أو الإفراج عن السيتوكينات، أو استخدامها لرصد الإشارات نظير الصماوي إلى الاستجابات الخلوية عن طريق استخدامه للعبادة الخليةلدى عودتهم. قد يمكن تصوير الخلايا تحت النقيض من المرحلة المجهري للمورفولوجيا وconfluency (الشكل 5). لوحظ المغزل مثل التشكل في ECS بعد HPF أكثر من 24 ساعة (الشكل 7).
الشكل 1. تدفق الدائرة التخطيطي. يستخدم مقياس التدفق المسمى ضمن مخطط لقياس مستويات مؤشر pulsatility التي وضعتها غرفة التخميد. وينبغي قياس تدفق الموجي مع يقصد أقطار أنبوب الصدد لضمان يبقى الضغط نظام فيزيولوجي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. تدفق تشاmber التصميم والقياسات، ويرتبط قناة الخارجي للفراغ. توضح الصورة مركز لقط من الغرفة. الصورة على اليمين توضح تصميم حشية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. تدفق التثبيط غرفة. التدفق غرفة التخميد التخطيطي يشير إلى اتجاه تدفق المقصود والاتصال. يتم فتح الافراج عن صمام الهواء، يتم إغلاق صمام مأخذ، والسوائل تملأ الغرفة إلى مستوى PI المطلوب. عند فتح صمام مأخذ وإغلاق صمام إطلاق الهواء، يستأنف تدفق ومستويات السوائل داخل تحتفظ الغرفة المستويات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 
الرقم 4. موجات تدفق عينة مع مختلف المؤشرات pulsatility. السامية Pulsatility تدفق (يسار) ومنخفضة Pulsatility تدفق (يمين). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. تدفق تخطيطي المشارك الثقافة. معارض شارك في الثقافة تدفق نابض على الخلايا البطانية، مع خلايا العضلات الملساء في جل الكولاجين. الافراج خلوى من الخلايا قد تعبر من خلال الغشاء البولي يسهل اختراقها. الرجاءانقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 6. الخلايا البطانية مورفولوجيا التغييرات مع شروط التدفق. متموجة ثقافة الخلية البطانية على غشاء البولي functionalized. أظهرت هي قبل تدفق (يسار) وبعد تدفق (يمين). يظهر تدفق في ظل ظروف مختلفة، الثابتة (أي السرعة)، ثابتة (بسرعة ثابتة)، نبض عالية (pulsatility عالية). هي ملطخة الخلايا مع 2٪ الكريستال البنفسجي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 7. العضلات الملساءالتغييرات التعبير بروتين الخلية مع شروط التدفق. على نحو سلس خلايا العضلات التعبير عن-α السلس الأكتين العضلات (SMA) والميوسين السلسلة الثقيلة (SM-MHC) تحت اختلاف الظروف، ثابتة (لا السرعة)، تدفق مستمر (بسرعة ثابتة)، وارتفاع نبض. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر نسخة من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا البروتوكول وسيلة لإعادة إنتاج تدفق نابض في المختبر، ويمكن أن يكون خطوة أولى مفيدة في تحديد مساهمة ظروف تدفق لأمراض المرض. وقد وجدت دراسات سابقة باستخدام هذا البروتوكول تساهم ظروف التدفق إلى الاستجابة الالتهابية الأوعية الدموية. 1، 10 بالإضافة إلى ذلك، يهدف هذا البروتوكول للمختبرات من ذوي الخبرة. على هذا النحو، لا في عمق ميكانيكا السوائل، ولا يتم وصف تحليل الكيمياء الحيوية في هذه الوثيقة. لمزيد من ديناميات الموائع المتقدمة (1)، والتقنيات المتقدمة، والتشاور مع الأدب 2 الحرجة في زراعة الخلايا تحت القص السوائل على مدى فترات طويلة هي: 1) الحفاظ على حلبة تدفق مختومة، باستثناء الخزان، و2) منع التلوث في كافة مراحل التجربة. ختم من الدائرة تدفق أمر ضروري في الحفاظ على حجم وسائل الاعلام ومستويات PI الصحيحة، مع إدخال الهواء غير مقصودة تؤثر على تدفق المعلمات المطلوبة. الهواء إضافي في مايو نظام صartially عرقلة تدفق داخل تيار، وتعكر مسار التدفق وتعزيز الامتثال للنظام العام. في حين أن معدلات التدفق الحجمي سيتم الحفاظ عليها، وانخفضت مساحة المقطع العرضي من هذا الانسداد الجزئي من شأنه أن يؤدي إلى زيادة موضعية في السرعة، وعدم الاستمرارية السطح. سيكون كل من تباين سرعة تدفق وانقطاعات سطح تسهم في تدفق زعزعة الاستقرار، وربما الاضطرابات. وأخيرا، فإن أي الهواء المحبوس في نظام تدفق الضغط بمثابة التخميد انضغاط تدفق، مما يقلل من PI عن مستواه المطلوب. والدائرة تدفق هي من حجم ثابت، الهواء المحبوس أيضا أن يسبب تسرب وسائل الإعلام التي يمكن أن يؤثر سلبا خلايا الأثر، وزيادة تركيز الأيض مع مرور الوقت. مضخة الدم الختم وظيفة يعتمدون على درجات الحرارة، وبالتالي فإن وضع مضخة في الحاضنة قد يخلق تعقيدات الختم. كل من التواجد المتزايد للهواء داخل الدائرة التدفق وفقدان وسائل الاعلام من خلال مضخة ختم أو malfuncنشوئها قد يزيد تقلب البيئة الخلايا، وتؤدي إلى نتائج غير دقيقة. الوقاية من التلوث خلال التجربة أمر مهم في كل ثقافة الخلية. يجب إعادة شدد ختم الدائرة تدفق لمنع دخول الملوثات كذلك. ويوفر وسائل الاعلام تدفق العديد من العناصر الغذائية والسكريات اللازمة لنمو الكائنات الحية الدقيقة، وبالتالي تنظيف من الدائرة فورا بعد الاستعمال غير الضروري. بالإضافة إلى ذلك، غطاء المضخة مبهمة، ويقلل من فعالية الأشعة فوق البنفسجية في تعقيم المضخة الشاملة. هذا، بالإضافة إلى عدم توافق مكبس الاكريليك مع الإيثانول، ويتطلب التعقيم الكامل للالدائرة باستخدام بيروكسيد الهيدروجين (H 2 O 2). منع نمو التلوث عندما يكون النظام لا تكون قيد الاستعمال، واستخدام تعقيم الحل، والحفاظ على بيئة معقمة جميع قد يخلق تعقيدات إما عن طريق السماح للتلوث أو تعقيم ثقافة الخلية. وتشمل القيود المفروضة على هذه التقنية عدم القدرة على الصحيحلاي نموذج موجة تدفق المعقدة في تدفق الدم الفيزيولوجي. في حين أن نظام تدفق لا تقدم تقريب وثيق، وجوانب مختلفة من الموجي معقدة ينظر في تدفق فيزيولوجي قد لا يمكن السيطرة عليها أو تغييرها. أيضا، وعكس إجهاد القص في الترددية تدفق هو اختلاط ينظر في بعض أمراض الشرايين، وربما ليس من تكرارها مع هذا النظام التدفق. بالإضافة إلى ذلك، يمكن دراسة طويلة الأمد من استجابة الخلايا يكون أكثر تعقيدا وتحديا، ويرجع ذلك أساسا إلى أداء المضخة. الحد من مقاومة المصب أمر ضروري للحفاظ على سلامة نظام تدفق وكفاءة الضخ. وأخيرا، يستخدم النظام المذكور أعلاه الشرائح الزجاجية والأغشية البولي، التي لا نموذج من الناحية الفسيولوجية الأوعية الدموية، ولا تعتبر الإشارات الميكانيكية الناتجة عن التمدد الشرياني أو القاعدية صلابة غشاء. سابقا، وقد استخدمت إحدى الدراسات نظام نابض قادرة على استنساخ تدفق نابض باستخدام حقنة مضخات 1 2. فعالية النظام في reproducing في PI عالية يمكن أن تتأثر قيود على سرعة المضخة والختم. طريقة التخميد غرفة بالإضافة إلى ذلك أسهل في تطبيقه، لا تتطلب برمجة المضخة. سوف التطبيقات المستقبلية للنظام تدفق يسمح لإشارات ميكانيكية نتيجة لامتداد الشرايين عن طريق إدراج أنبوب مرن لتحل محل غرفة التدفق والانزلاق. من خلال هذا التحسن، والامتثال متطابقة وانقطاعات سطح اللمعية قد مزيد من الدراسة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
الكتاب نود أن نعترف مصادر التمويل، بما في ذلك AHA (13GRNT16990019 إلى WT) وNHLBI (HL097246 وHL119371 لWT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 34850 | |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Glass Slide (70 mm x 50 mm) | Sigma-Aldrich | CLS294775X50 | |
| Polycarbonate Membrane | Millipore Corp. | HTTP09030 | |
| Silicone Gasket | Grace Bio-Labs | RD 475464 | |
| Fibronectin (25 μg/ml) | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Collagen Type-I | Sigma-Aldrich | C3867 | |
| NaHCO3 | Fluka | 36486 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Damping Chamber | This chamber is custom made, and may be requested using the engineering drawing of Figure 3. | ||
| Blood Pump | Harvard Apparatus | 529552 | |
| Poly-Vinyl Carbonate Tubing | US Plastic | 65066, 65063, 65062 | Various sizes may be required |
| Luer Connections | Nordson Medical | Various | Various sizes will be required, and a number of parts should be purchased for replacement use. |
| Culture Chamber | Machined in-house | Custom | Acrylic may be purchased in sheets and machined for intended use. The engineering drawing shown in Figure 2 may be used to recreate this chamber. |
| Square Petri Dish | Cole-Parmer | EW-14007-10 | |
| Glass Slide Holder | Capitol Scientific | WHE-900303 | |
| Fetal Bovine Serum | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Flow Meter | Sonotec, GmbH | Sonoflow co.55/060 | |
| Sylgard Elastomer Kit | Sigma-Aldrich | 761036-5EA | |
| 14 G Steel Cannula | General Laboratory Supply | S8365-1 |
References
- Scott-Drechsel, D., Su, Z., Hunter, K., Li, M., Shandas, R., Tan, W. A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves. Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).
- Tan, Y., et al. Stiffening-Induced High Pulsatility Flow Activates Endothelial Inflammation via a TLR2/NF-κB Pathway. PLoS ONE. 9 (7), e102195 (2014).
- Wexler, L., et al. Coronary Artery Calcification: Pathophysiology, Epidemiology, Imaging Methods, and Clinical Implications A Statement for Health Professionals From the American Heart Association. Circulation. 94 (5), 1175-1192 (1996).
- Lan, T. -H., Huang, X. -Q., Tan, H. -M.
- Lee, C. H., et al. Promoting endothelial recovery and reducing neointimal hyperplasia using sequential-like release of acetylsalicylic acid and paclitaxel-loaded biodegradable stents. Int J Nanomedicine. 9, 4117-4133 (2014).
- Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. Vascular Remodeling in Hypertension Roles of Apoptosis Inflammation, and Fibrosis. Hypertension. 38 (3), 581-587 (2001).
- Greil, O., et al. Changes in carotid artery flow velocities after stent implantation: a fluid dynamics study with laser Doppler anemometry. J Endovasc Ther. 10 (2), 275-284 (2003).
- Egorova, A. D., van der Heiden, K., Poelmann, R. E., Hierck, B. P. Primary cilia as biomechanical sensors in regulating endothelial function. Differentiation. 83 (2), S56-S61 (2012).
- Liu, S. Q., Goldman, J. Role of blood shear stress in the regulation of vascular smooth muscle cell migration. IEEE T Bio-Med Eng. 48 (4), 474-483 (2001).
- Scott, D., Tan, Y., Shandas, R., Stenmark, K. R., Tan, W. High pulsatility flow stimulates smooth muscle cell hypertrophy and contractile protein expression. AJP: Lung C. 304 (1), L70-L81 (2013).
- Panaritis, V., et al. Pulsatility Index of Temporal and Renal Arteries as an Early Finding of Arteriopathy in Diabetic Patients. Ann Vasc Surg. 19 (1), 80-83 (2005).
- Miao, H., et al. Effects of Flow Patterns on the Localization and Expression of VE-Cadherin at Vascular Endothelial Cell Junctions: In vivo and in vitro Investigations. J Vasc Res. 42 (1), 77-89 (2005).
