Summary
Dit protocol repliceert fysiologische of pathologische bloedstroom in vitro te helpen bij het bepalen celrespons ziekte pathologieën. Door de invoering van een druk rustkamer stroomafwaarts van een bloed pomp, kan de bloedstroom over het vaatstelsel worden gerecapituleerd en opgelegd aan een monolaag van vasculaire endotheel of mimetische co-cultuur.
Abstract
Vaatziekten is een veel voorkomende doodsoorzaak in de Verenigde Staten. Hierin presenteren we een methode om de bijdrage van stromingsdynamica richting vaatziekte pathologieën onderzoeken. Ongezonde slagaders vaak aanwezig met wand verstijving, littekens of gedeeltelijk stenose die allen invloed vloeistofstroomsnelheden en de omvang van de pulserende stroom of pulsatility index. Replicatie van verschillende stromingsomstandigheden is het resultaat van stemmen van een stromingsdruk rustkamer stroomafwaarts van een bloedpomp. Inbrengen van lucht in een gesloten stroom systeem zorgt voor een samendrukbaar medium tot pulserende druk absorberen uit de pomp, en daarom variëren de pulsatility index. De hierin beschreven werkwijze is eenvoudig gereproduceerd met hoge beheersing ingang en gemakkelijk meetbare resultaten. Sommige beperkingen recreatie van de complexe fysiologische pulsgolfvorm, die alleen benaderd door het systeem. Endotheelcellen, gladde spiercellen en fibroblasten worden beïnvloed door de bloedstroom thrdoorgedreven de slagader. De dynamische component van de bloedstroom wordt bepaald door het hartminuutvolume en vaatwand compliance. Vasculaire cel mechanisch-transductie van stroom dynamiek kan cytokineafgifte en cross-talk tussen celtypen binnen de slagader veroorzaken. Co-kweek van vasculaire cellen een nauwkeuriger beeld reflecterende cel-cel interacties aan de bloedvatwand en vasculaire respons op mechanische signalering. Bijdrage van stromingsdynamica, inclusief de celrespons op de dynamische gemiddelde (of constante) componenten van stroom, is daarom een belangrijke maatstaf bepalen pathologie en behandeling werkzaamheid. Door het introduceren van een in vitro co-cultuurmodel en druk demping stroomafwaarts van bloed pomp die gesimuleerde cardiale output produceert, kunnen verschillende vaatlijden pathologieën onderzocht.
Introduction
Ziektecijfers voor hart- en vaatziekten zijn de grootste in Amerika, met veel als gevolg van ongezonde vaatstelsel. Gezonde bloedvaten bestaan uit elastisch weefsel, zachte luminale oppervlak bedekt met een endotheelcel (EC) monolayer. Arteriële stroom kan worden gemodelleerd als een oscillerende golffunctie met positieve gemiddelde debiet. De pulsatility index (PI) is het quotiënt van oscillatie omvang en gemiddelde stroomsnelheid (PI = (max -.. Min) / gemiddelde), 1 en is gemodelleerd in vitro met variabele elasticiteit vat 2 arteriële elasticiteit van belang voor de opslag van stroom. energie uit hart contracties, verwijden onder systolische druk, en speelt een belangrijke rol bij het moduleren van de bloedstroom PI. Omdat het hart handhaaft een constante, pulsatiele, volumestroom, arteriële expansie verhoogt dwarsdoorsnede, verbetering stroming stabiliteit door het verminderen van stroomsnelheid, schuifspanning en PI. Vaak ongezonde slagaders huidige veranderingen in de elasticiteitof compliance, het weergeven van verstijving van vasculaire remodeling, littekenweefsel of calcificatie 3, 4. Bovendien kunnen andere vaataandoeningen, zoals neointima hyperplasie (NIH), aneurysma 5 en 6 hypertensie en vasculaire fibrose 4, diameter vat vernauwen. Echter, de huidige behandeling met geneesmiddelen en het apparaat de behandeling van vasculaire ziekten verwaarlozen vaak het belang van een vaatwand naleving of de bloedstroom dynamiek in vasculaire ziekte die vaak wordt gecompliceerd door veranderingen in het vat morfologie en eigenschappen. Noch ballondilatatie of stenting beantwoorden complicatie van wand 7 elasticiteit. Daarom is in vitro modellen van bloedstromen gevolg van arterieel vaatlijden en behandelingen van belang bij onderzoek ziekte pathologieën en toekomstige effectiviteit van de behandeling. Hierin beschrijven we een werkwijze voor het repliceren van fysiologische en pathologische bloedstroom ontworpen celreactie in vaatziekte Pathol bepalengieën. Vloeistofstroom veroorzaakt schuifspanning in de vaatwand, wat een belangrijk mechanisch signaal in gezond vat, die alle cellen binnen het vaatstelsel. Verschillende mechanische sensoren op het vasculaire endotheel voor vloeistofschuifspanning geïdentificeerd, zoals getoond in recente studies endotheliale mechanosensing 8 primaire cilium. Endotheliale celactiviteit en morfologie worden beïnvloed door stroomsnelheid richting en pulsatiliteit. Bovendien kan gladde spiercel (SMC) migratie beïnvloed door mechanisch-signalen van lage snelheid stroom door interstitiële vloeistof 9, en kunnen ook via de paracrienen van endotheliale cellen door hun reactie te stromen en mechanisch-transductie van stromingssignalen via cytokine 10 los. De "dosis" afhankelijk van de gemiddelde shear, PI en paracriene signalering kunnen ook van elkaar afhankelijk zijn. Daartoe de bepaling van vasculaire celrespons op vloeistofschuifspanning met gevarieerde "dosering" in monolaagkweekof co-cultuur in vitro kon mechanistische inzichten in vasculaire remodeling en verbetering van de ziekte en de behandeling voorspelling. Het stroomsysteem in dit experiment omvat een bloedpomp, een stroomopwaartse stromingsdemping luchtreservoir, een stroomafwaartse flowmeter alleen gebruikt tijdens de experimentele opstelling, een stroomafwaarts celcultuur, parallelle plaat stroming kamer en media reservoir. Controle van vasculaire stroming variabelen zoals betekenen debiet beats per minuut en PI kan worden bereikt door het regelen stroomsnelheid, pulsfrequentie, en invoering van de druk demping. Pulserende bloed pompen zijn leverbaar met een variabele slag verplaatsing, op gecontroleerde slagfrequentie, die rechtstreeks verband houden met volumestroom en polsslag bedoelt. Invoering van een lucht reservoir binnen de stroom circuit zorgt voor druk demping, waardoor de stroom oscillatie omvang. Media is een onsamendrukbare vloeistof, terwijl de lucht in de rustkamer samendrukbaar, waardoor overdruk uit de stroom golf te zijngeabsorbeerd door de lucht compressie. De lucht in de media-ratio zorgt voor controle over hoeveel demping optreedt. Een aangepaste celcultuur stromingskamer 75 mm in de lengte met 50 mm in de breedte is gemaakt van acryl. Flow komt via de inlaat poort, en breidt door het inlaatspruitstuk, consistente stroom over het geheel van de stroom kamer. Vergelijkbare flow en structuren zijn aanwezig op kameruitlaat. Cellen worden gezaaid gefunctionaliseerd slides, en vervolgens bevestigd aan de stromingskamer. Dit zorgt voor grote populaties gemakkelijk teruggevonden na de studie. Co-kweek-experimenten kan een poreus membraan van polycarbonaat om cel-tot-cel contact tussen culturen elimineren terwijl cytokine / stroom transport. Dit systeem is eerder gebruikt om in hoge PI doorstroming en het effect op endotheliale monolaag cultuur en EC / SMC co-kweek 1, 10, tot celrespons op pathologisch hoge PI ziekte te onderzoeken. Met een beschrijving van het protocol dat wordt gebruikt voor het modelleren van deze stroom convoorwaarden, hopen we anderen helpen bij het bepalen bijdrage stroom signaal reactie cel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. silanisatie en Biomolecuul functionalisering van Slide of polycarbonaatmembraan
Opmerking: Veel chemicaliën en oplossingen in dit protocol hoge verdamping (ethanol (EtOH), aceton, etc.). Andere stappen inhouden lange incubatietijd voor lage verdamping. Paraffine film wordt aanbevolen om containers te verzegelen. Opgelet: Veel stoffen (inclusief: zwavelzuur, aceton, (3-aminopropyl) triethoxysilaan, glutaaraldehyde, EtOH) zijn gevaarlijke of vluchtige beschouwd. Raadplegen veiligheidsinformatieblad (VIB) van elk materiaal voor een goede opslag, behandeling en verwijdering voor gebruik.
- Plaats nieuw glasplaatje van 75 mm bij 50 mm bij 1 mm, in schone, glasplaatje vlekken gerecht ongeacht geaardheid, te zorgen voor volledige onderdompeling. Gebruik container voor stappen 1,1-1,12.
Opmerking: Voor co-kweek omvatten polycarbonaat (PC) membraan met 0,4 micron poriegrootte, de afmetingen van 75 mm met 50 mm, voor alle volgende steps voor PC functionalisering en EG zaaien. - Dompel dia in zwavelzuur (20%), O / N.
Let op: Raadpleeg de MSDS voor zwavelzuur voor gebruik. - Was schuif door onderdompeling in gedeïoniseerd water (DI) gedurende 5 minuten, drie keer, telkens veranderende DI.
- Dompel dia in aceton gedurende 30 min.
Let op: Raadpleeg de MSDS voor aceton voor gebruik. - Dompel dia in 6% (3-aminopropyl) triethoxysilaan / acetonoplossing O / N.
Let op: Raadpleeg de MSDS voor (3-aminopropyl) triethoxysilaan en aceton voor gebruik. - Dompel dia in aceton gedurende 5 minuten, drie keer, telkens veranderende aceton.
Let op: Raadpleeg de MSDS voor aceton voor gebruik. - Was schuif door onderdompeling in DI gedurende 5 minuten, drie keer, telkens veranderende DI.
- Dompel dia in 1,5% glutaaraldehyde / DI oplossing gedurende 60 min.
Let op: Raadpleeg de MSDS voor glutaaraldehyde voor gebruik. - Was schuif door onderdompeling in DI gedurende 5 min, tweemaal, telkens veranderende DI.
- Plaats slides in 70% ethanol (EtOH) gedurende 30 min in steriele laminaire stroming kap.
- Verwijder EtOH en de resterende residu verdampen. Dompel slides in steriele DI en afvoer om de dia rehydrateren.
Opmerking: Slides of PC membraan kan worden afgesloten glasplaatje houder en bewaard bij 4 ° C maximaal een week. Bij gebruik voor celkweek, herhaalt u de stappen 1,10 en 1,11. - Verwijder de dia uit de diahouder en plaats deze in een 100 mm bij 100 mm vierkante petrischaal in de laminaire stroming kap.
Opmerking: Deze container wordt gebruikt voor alle overige stappen.- Bereid dia of PC voor endotheelcellen zaaien voor monocultuur experiment.
- Coat de gefunctionaliseerde dia of PC (stap 1,11) met 1 ml fibronectine (25 ug / ml), aan de ene kant, die het geschatte oppervlakte blootgesteld aan celcultuurkamer.
- Incubeer dia's of PC steriele incubator ingesteld op 37 ° C gedurende 1-2 uur.
- Na incubatie zuigen de overblijvende oplossing met een glass aspirator pipet verbonden met een vacuümbron.
Opmerking: Slides kunnen nu worden opgeslagen O / N bij 4 ° C voor toekomstig gebruik.
- Volg 1.12.2 stappen alleen voor het bereiden van EC / SMC co-cultuur. Bereiden en zaad van gladde spiercellen (SMC) cultuur voor co-cultuur experiment.
- Plaats afdichtring bovenop de slede (stap 1,11), met afmetingen van 75 mm bij 50 mm buitendiameter, binnendiameter van 50 mm bij 30 mm, dikte 0,5 mm, en perforaties die aansluiten bij stromingskamer vacuüm.
- Bereid 1 ml SMC in 10% FBS / DMEM suspensie. Neutraliseer 1 ml oplossing van 2 mg / ml collageen type I met 7% NaHCO3 en 0,1 M NaOH tot pH van 7,4 en meng met SMC vering uiteindelijke celdichtheid van 2 x 10 6 cellen / ml.
- Verspreid SMC oplossing binnen pakking en incubeer slides bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 30 min.
- Na incubatie betrekking op de dia met 25 ml 0,1% foetaal runderserum (FBS) gemengd in Dulbecco's GemodificeerdEagle Medium (DMEM) voor 72 uur.
- Bereid dia of PC voor endotheelcellen zaaien voor monocultuur experiment.
- Cultuur endotheelcellen (EC) op glasplaatje / polycarbonaat membraan.
- Seed 1 ml EC in 10% FBS / DMEM met beginconcentratie van 6,0 x 10 5 cellen / ml op fibronectine oppervlakken glaasje of polycarbonaat membraan.
- Incubeer cellen in een incubator bij 37 ° C, 5% CO2 en 10% FBS gedurende 120 min.
- Dekglaasjes bevattende cellen met 10% FBS / DMEM en plaats in incubator bij 37 ° C, 5% CO 2 O / N, tot 70% -80% confluent.
2. Bepaling van de viscositeit en volumestroom Rate
NB: Roterende viscometers zijn gevoelige apparatuur, en de viscometer handleiding moet worden geraadpleegd voordat het kalibreren, op nul zetten, of het uitvoeren van metingen.
- Bepaal de gewenste vloeistof shear (τ) uit de literatuur van gerichte vaatstelsel van het experiment.
- MEASURe 1% FBS / DMEM viscositeit (μ), met behulp van een roterende viscometer.
- Bepaal vereiste volumestroom (Q) van Poiseuille vergelijking:
,
waarbij τ = vloeistof shear, μ = viscositeit, Q = vol. debiet, w = kamer breedte en h = kamer hoogte). - Stel de pomp om te beoordelen afgeleid in stap 2.3 stromen, en te gebruiken voor alle volgende stappen.
, 3. Bepaling van Pulsatility Index
Opmerking: Alle aansluitingen binnen het systeem moet worden verbonden met de juiste maat lock-ring-to-weerhaak, of vrouwelijke Luer-to-weerhaak verbindingen. Het aansluiten van PVC-buis kan dan worden verbonden met weerhaak fittingen, en circuit voltooid.
- Sluit stroomkring volgens Figuur 2, met rustkamer (figuur 3) en ultrasone stroommeter in stroomrichting.
Opmerking: De ultrasone flowmeter is een gevoelig stuk van de apparatuur, ende gebruiksaanwijzing moet worden geraadpleegd voor gebruik. - Vul stroom circuit en het reservoir met DI-water, door te zorgen voor reservoir afvoerbuis (de pomp) wordt ondergedompeld in het reservoir volume. Visualiseren golfvorm met een flowmeter.
- Open ontluchtingsventiel op de rustkamer om vloeistof / lucht volume-verhouding te veranderen. Sluiten ontluchtingsventiel op verschillende tijdstippen vloeistofniveau en bereken pulsatility index (PI = (V Max - V min) / V Mean) met behulp van stroom golfvorm piek (V-Max), goot (V Min) en gemiddelde (V Mean). IP-waarden in notebook.
- Mark resulterende vloeistofniveau en PI aan de rustkamer, met behulp van een vilten getipt, permanente inkt pen voor toekomstig gebruik. Bepaal gewenste PI niveaus van pathologie literatuur 11.
- Silicon Tube Formation- Optioneel, meer geavanceerde methode voor het regelen van pulsatiliteit
- Meng de siliconenelastomeer basis en verharder in verschillende verhoudingen (bijvoorbeeld een base tot crosslinker-verhouding van 10: 1 tot 36:. 1) te variëren gerichte elastische moduli, zoals eerder toegelicht 2
- Fabriceren siliconen buizen door herhaalde dip-cure proces kort dompelen staal canule (14 G) in de siliconen prepolymeermengsel met een vooraf bepaalde base-to-crosslinker ratio.
- Plaats de prepolymeer-beklede canule in een oven ingesteld op 60 ° C gedurende 4 uur om het polymeer coating te harden aan de canule, schakelen van de richting in het midden van uithardingsproces.
- Herhaal het dompelen met dezelfde siliconenelastomeer mengsel en zet terug in de oven gedurende 4 bijkomende uren, die ~ 0,3 mm buizen resultaten.
- Verwijder de ultradunne silicone buis van de roestvrij stalen canule.
- Verbind buizen om circuit in plaats van rustkamer, en test PI voor elke stroom als in 3.3.
4. Pomp Sterilisatie
- Dompel de stroom kamer (figuur 2), PVC-buis, en pakkingen in 10% waterstofperoxide (H 2 O 2). Wassen met steriele DI vóór stap 4.
- Plaats het bloed pomp op een reserve-incubator plank.
Opmerking: Incubator planken moeten roestvast staal, en in staat om het gewicht van de gehele stroomkring ondersteunen. - Vul de stroom circuit en het reservoir met 10% H 2 O 2 door te zorgen voor het reservoir afvoerbuis (de pomp) wordt ondergedompeld in het reservoir volume. Circuleren H 2 O 2 door pompen door circuit 20 min in laminaire stroming kap met UV licht op.
- Zuig alle H 2 O 2 van buizen en wassen met steriele PBS door het pompen doorstroming circuit.
5. Flow Kamer Vergadering
Opmerking: De stromingskamer bestaat uit een acrylaat, maat gemaakte plaat met vacuümpoorten en inlaat- en uitlaat stroompoorten (zie figuur 2). Kamer vergadering bestaat uit het plaatsen van de stroom kamer en pakkingen op de top van de cultuur dia's, proPerly uitgelijnd en wordt hierna beschreven.
- Opwarmen 1% FBS / DMEM in een 37 ° C waterbad en bereiden stroom kamer.
- Neem EG slide van media (van stap 1.13) en plaats de pakking op de top met cel kant naar boven.
- (Optioneel) Neem PC membraan van media (van stap 1.13) en plaats de pakking op de top met cel kant naar boven. Plaats co-cultuur dia met geplaatste SMC (stap 1.12.2) onder PC membraan.
- Lijn vacuümkanaal van de stroom kamer met de gaten in de pakking (figuur 2).
- Hechten vacuümbuis vacuüm poorten (figuur 2) zodat er geen media lekken naar vacuüm.
- Plaats polycarbonaat plaat eronder glasplaatje en clamp stroom kamer samenstel met klemveren, een aan elke zijde van stromingskamer (figuren 2 en 5).
- Plaats stroom systeem incubator bij 37 ° C en 5% CO 2, en vul circuit met de media door het pompen van gevuld reservoir bij lage pulsatility.Handhaaf deze stroom gedurende 4 uur voor preconditionering cellen.
- Pas vloeistof volume in rustkamer aan gemarkeerde PI-niveau, en cultuur voor de gewenste tijd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Onderhoud van stromingsomstandigheden is afhankelijk juiste montage van de stroomkring (figuur 1). Buisdiameter is een belangrijk selectiecriterium in assembly, met grotere diameters verminderen stromingsweerstand en daaropvolgende drukverlies vóór en na de kweekkamer. Om beoogde druk en de stroomsnelheid te garanderen, monteren van het systeem met flowmeter voor de proef met de bedoeling slang. Uitlijning van de cultuur kamer vacuüm kanaal (figuur 2), met perforaties op silicium pakking (niet afgebeeld), onderhoudt dichten binnen de stroom circuit. Om afdichting kan veerklemmen worden gebruikt om extra druk uit te oefenen op de pakking. Glasplaten moeten worden beschermd door polycarbonaat, gesneden kamer gebied (Figuur 6) past. Omdat stroomsnelheid kan bovendien bijdragen tot complicaties bij het handhaven van verbindingen, kan media worden veranderd door de toevoeging van dextran media viscositeit te verhogen. Door meer viscosteit, kan vloeistof shear worden gehandhaafd op een lagere snelheid. Respons en integriteit van het systeem kan in het midden van het experiment worden gecontroleerd simpelweg door het observeren vloeistofniveaus en fluïdum kleur binnen de rustkamer en reservoir (figuur 3). Het vloeistofniveau moet handhaven van een constante waarde. Initieel vloeistofniveau moet zowel op het reservoir en rustkamer voor checkup vergelijking worden gemarkeerd. Aanpassingen kunnen worden gemaakt door de toevoeging van media in het experiment initiatie of waardoor toegang van lucht naar rustkamer. Figuur 4 illustreert een representatieve registratie van stroomsnelheid. Fenol rode verkleuring zou afnemen in de loop van het experiment. Na voltooiing van het experiment moeten media laten uitlekken van het circuit, en opgeslagen bij -80 ° C vriezer voor toekomstig maatregel of gebruik. Media kunnen worden geanalyseerd metaboliet inhoud of vrijgegeven cytokinen, of worden gebruikt om paracrienen cellulaire responsen te controleren door het te gebruiken voor mobiele culture. Cellen kunnen onder fasecontrast microscopie worden afgebeeld op morfologie en confluentie (figuur 5). Spil morfologie waargenomen in ECs na HPF dan 24 uur (Figuur 7).
Figuur 1. Flow circuit schema. De stroommeter label binnen de regeling wordt gebruikt om pulsatility indexniveaus door de rustkamer ingesteld meten. Flow golfvorm moet worden gemeten met de bedoeling aansluiting buisdiameters om ervoor te zorgen systeemdruk blijft fysiologische. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Flow chamber ontwerp en metingen. Outer kanaal is verbonden met vacuüm. Center foto toont klemming van de kamer. Foto rechts illustreert pakking ontwerp. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Flow rustkamer. Flow rustkamer schema geeft bedoeld stroomrichting en verbinding. Ontluchtingsventiel geopend, uitlaatklep gesloten en fluïdum vult de kamer naar PI gewenste niveau. Bij het openen van de uitlaatklep en sluiten van de lucht ventiel, stroom hervat en vocht niveaus binnen de kamer onderhoudt niveaus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 
Figuur 4. Voorbeeld stroom golven met verschillende pulsatility indices. Pulsatility High Flow (links) en Low Pulsatility Flow (rechts). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Co-cultuur Flow Schematische. Co-kweek toont pulserende stroom over endotheelcellen, met gladde spiercellen in collageengel. Cytokineafgifte uit cellen kan passeren via de poreuze polycarbonaatmembraan. Gelieveklik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Endotheelcellen morfologie Wijzigingen Flow Voorwaarden. Confluent endotheelcellen cultuur op de gefunctionaliseerde polycarbonaat membraan. Getoond zijn voor stroom (links) en na flow (rechts). Flow wordt onder verschillende omstandigheden, statische (geen snelheid), stabiel (constante snelheid), hoge hartslag (hoog pulsatility). Cellen worden gekleurd met 2% kristalviolet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7. Smooth MuscleCell Protein Expression Verandert met Flow Voorwaarden. Gladde spiercellen expressie van α-gladde spier actine (SMA) en myosine zware keten (sm-MHC) onder verschillende omstandigheden, statische (geen snelheid), constante stroom (constante snelheid), en een hoge hartslag. Klik hier voor een grotere weergave versie van deze figuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het reproduceren pulserende stroming in vitro, en kunnen instrumenteel eerste stap bij het bepalen van de bijdrage stroomomstandigheden ziekte pathologieën. Vorige studies met behulp van dit protocol hebben gevonden stroom voorwaarden bijdragen aan vasculaire ontstekingsreactie. 1, 10 Bovendien, dit protocol is bedoeld voor ervaren laboratoria. Als zodanig, noch grondig vloeistofmechanica, of biochemische analyse wordt hierin beschreven. Voor meer geavanceerde vloeistofdynamica, 1 en geavanceerde technieken, raadpleeg de literatuur 2 Kritische in het kweken van de cellen onder vloeistof shear gedurende langere perioden zijn:. 1) handhaven van een gesloten stroom circuit, met uitzondering van het reservoir, en 2) voorkomen dat besmetting gedurende het experiment. Afdichten van de stroom circuit is essentieel voor het behoud van media volume en de juiste PI niveaus, met introductie van onbedoelde lucht beïnvloeden gewenste stroom parameters. Extra lucht in het systeem partially doorstroming belemmeren in de beek, stroomweg verstoren en verbeteren van de naleving van het totale systeem. Terwijl volumetrische stroomsnelheden worden gehandhaafd, verlaagd dwarsdoorsnede van deze gedeeltelijke belemmering zou leiden tot gelokaliseerde toename in snelheid en oppervlaktediscontinuïteiten. Beide stroomsnelheid variatie en oppervlaktediscontinuïteiten bijdraagt tot destabilisering stromen en mogelijk turbulentie. Tenslotte zou de ingesloten lucht in het stromend stroomsysteem fungeren als een samendrukbare demping van de stroming, waardoor de PI van het gewenste niveau afneemt. Als de stroom circuit is constant volume, ingesloten lucht zou ook lekkage van de media die van invloed zijn cellen kan een negatief veroorzaken, toenemende metaboliet concentratie in de tijd. Bloedpomp afdichting en functies zijn afhankelijk van de temperatuur, waardoor de plaatsing van de pomp in de incubator kan afdichten complicaties invoeren. Beide verhoogde aanwezigheid van lucht in de stroom circuit en het verlies van media via de pomp afdichting of storing optreedttie kan variabiliteit van de cel milieu te verhogen, en leiden tot onnauwkeurige resultaten. Voorkoming van besmetting tijdens het experiment is belangrijk in alle celkweek. Afdichting van de stroom circuit moet opnieuw worden benadrukt met ingang van contaminanten en te voorkomen. Flow media biedt vele voedingsstoffen en suikers noodzakelijk voor de groei van micro-organismen, dat een reiniging van het circuit direct na gebruik noodzakelijk. Bovendien, een ondoorzichtige pompdeksel, vermindert de effectiviteit van UV straling sterilisatie van de totale pomp. Dit, gekoppeld aan de onverenigbaarheid van het acryl zuiger met ethanol, vereist volledige sterilisatie van het circuit met behulp waterstofperoxide (H 2 O 2). Preventie van groei besmetting wanneer het systeem niet wordt gebruikt, het gebruik van ontsmettingsmiddel en onderhouden van een steriele omgeving allen complicaties invoeren hetzij doordat vervuiling of steriliseren celkweek. Beperkingen van deze techniek omvatten het onvermogen om correctly model van de complexe stroom golf in fysiologische doorbloeding. Terwijl het stroomsysteem biedt wel een goede benadering, kunnen verschillende aspecten van de complexe golfvorm waargenomen bij fysiologische stroom niet worden gecontroleerd of gewijzigd. Ook omkeren schuifspanning in neergaande stroming is een complicatie dat in sommige vaatlijden, en kunnen niet gerepliceerd dit stroomsysteem. Bovendien kan langdurige onderzoek van celrespons ingewikkelder en uitdagend, voornamelijk door de werking van de pomp. Het verminderen van de stroomafwaartse resistentie is essentieel om de integriteit van stroomsysteem en pompen efficiëntie te handhaven. Tenslotte bovengenoemde systeem gebruikt glasplaatjes en polycarbonaat membranen, die geen fysiologisch model hebben de vasculatuur en niet denkt mechanische signalering gevolg van arteriële rek of basaalmembraan stijfheid. Eerder heeft één onderzoek een pulserende systeem kan weergeven pulserende stroom via injectiespuit gebruikt pompen 1 2. De werkzaamheid van het systeem reproducing de hoge PI kan worden beïnvloed door beperkingen op de snelheid en de verzegeling pomp. De methode van de rustkamer is bovendien eenvoudiger in haar verzoekschrift niet vereist programmering pomp. Toekomstige toepassingen van het stroomsysteem mogelijk zou maken mechanische signalering als gevolg van de arteriële rekken door incorporatie van elastische slang aan de stroomkamer en schuif vervangen. Door deze verbetering kunnen niet passende compliance en luminale oppervlak discontinuïteiten verder onderzocht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen financieringsbronnen, met inbegrip van AHA (13GRNT16990019 aan WT) en NHLBI (HL097246 en HL119371 om WT) te erkennen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 34850 | |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Glass Slide (70 mm x 50 mm) | Sigma-Aldrich | CLS294775X50 | |
| Polycarbonate Membrane | Millipore Corp. | HTTP09030 | |
| Silicone Gasket | Grace Bio-Labs | RD 475464 | |
| Fibronectin (25 μg/ml) | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Collagen Type-I | Sigma-Aldrich | C3867 | |
| NaHCO3 | Fluka | 36486 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Damping Chamber | This chamber is custom made, and may be requested using the engineering drawing of Figure 3. | ||
| Blood Pump | Harvard Apparatus | 529552 | |
| Poly-Vinyl Carbonate Tubing | US Plastic | 65066, 65063, 65062 | Various sizes may be required |
| Luer Connections | Nordson Medical | Various | Various sizes will be required, and a number of parts should be purchased for replacement use. |
| Culture Chamber | Machined in-house | Custom | Acrylic may be purchased in sheets and machined for intended use. The engineering drawing shown in Figure 2 may be used to recreate this chamber. |
| Square Petri Dish | Cole-Parmer | EW-14007-10 | |
| Glass Slide Holder | Capitol Scientific | WHE-900303 | |
| Fetal Bovine Serum | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Flow Meter | Sonotec, GmbH | Sonoflow co.55/060 | |
| Sylgard Elastomer Kit | Sigma-Aldrich | 761036-5EA | |
| 14 G Steel Cannula | General Laboratory Supply | S8365-1 |
References
- Scott-Drechsel, D., Su, Z., Hunter, K., Li, M., Shandas, R., Tan, W. A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves. Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).
- Tan, Y., et al. Stiffening-Induced High Pulsatility Flow Activates Endothelial Inflammation via a TLR2/NF-κB Pathway. PLoS ONE. 9 (7), e102195 (2014).
- Wexler, L., et al. Coronary Artery Calcification: Pathophysiology, Epidemiology, Imaging Methods, and Clinical Implications A Statement for Health Professionals From the American Heart Association. Circulation. 94 (5), 1175-1192 (1996).
- Lan, T. -H., Huang, X. -Q., Tan, H. -M.
- Lee, C. H., et al. Promoting endothelial recovery and reducing neointimal hyperplasia using sequential-like release of acetylsalicylic acid and paclitaxel-loaded biodegradable stents. Int J Nanomedicine. 9, 4117-4133 (2014).
- Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. Vascular Remodeling in Hypertension Roles of Apoptosis Inflammation, and Fibrosis. Hypertension. 38 (3), 581-587 (2001).
- Greil, O., et al. Changes in carotid artery flow velocities after stent implantation: a fluid dynamics study with laser Doppler anemometry. J Endovasc Ther. 10 (2), 275-284 (2003).
- Egorova, A. D., van der Heiden, K., Poelmann, R. E., Hierck, B. P. Primary cilia as biomechanical sensors in regulating endothelial function. Differentiation. 83 (2), S56-S61 (2012).
- Liu, S. Q., Goldman, J. Role of blood shear stress in the regulation of vascular smooth muscle cell migration. IEEE T Bio-Med Eng. 48 (4), 474-483 (2001).
- Scott, D., Tan, Y., Shandas, R., Stenmark, K. R., Tan, W. High pulsatility flow stimulates smooth muscle cell hypertrophy and contractile protein expression. AJP: Lung C. 304 (1), L70-L81 (2013).
- Panaritis, V., et al. Pulsatility Index of Temporal and Renal Arteries as an Early Finding of Arteriopathy in Diabetic Patients. Ann Vasc Surg. 19 (1), 80-83 (2005).
- Miao, H., et al. Effects of Flow Patterns on the Localization and Expression of VE-Cadherin at Vascular Endothelial Cell Junctions: In vivo and in vitro Investigations. J Vasc Res. 42 (1), 77-89 (2005).
