Summary
Ce protocole se réplique du flux sanguin physiologique ou pathologique in vitro pour aider à déterminer la réponse des cellules dans des pathologies de la maladie. En introduisant une pression en aval de la chambre une pompe à sang amortissement, le flux sanguin à travers le système vasculaire peut être récapitulé et prélevée sur une monocouche de l'endothélium vasculaire ou une co-culture mimétique.
Abstract
Maladie vasculaire est une cause fréquente de décès aux États-Unis. Ici, nous présentons une méthode pour examiner la contribution de la dynamique des flux vers les pathologies de maladies vasculaires. Artères malsaines présentent souvent raidissement de paroi, des cicatrices, ou une sténose partielle qui peuvent tous affecter les taux d'écoulement des fluides, et l'ampleur des flux pulsatile, ou de l'indice de pulsatilité. Replication de différentes conditions d'écoulement est le résultat d'un réglage de la pression d'écoulement en aval de la chambre une pompe à sang amortissement. L'introduction d'air dans un système fermé de circulation permet à un milieu compressible pour absorber la pression pulsatoire de la pompe, et donc varier l'indice de pulsatilité. Le procédé décrit ici est tout simplement reproduit, avec entrée hautement contrôlable, et les résultats facilement mesurables. Certaines limitations sont reconstitution de la forme d'onde d'impulsion physiologique complexe, qui est seulement une approximation par le système. Les cellules endothéliales, cellules musculaires lisses et les fibroblastes, sont affectées par le thr d'écoulement de sangOugh l'artère. La composante dynamique de la circulation sanguine est déterminée par l'observation de sortie et la paroi artérielle cardiaque. Cellules vasculaires mécano-transduction de la dynamique d'écoulement peut déclencher la libération de cytokines et de diaphonie entre les types de cellules dans l'artère. Co-culture de cellules vasculaires est une image qui reflète plus précise interaction cellule-cellule sur la paroi du vaisseau sanguin et de la réponse vasculaire de signalisation mécanique. Contribution de la dynamique des flux, y compris la réponse des cellules aux composants dynamiques et moyennes (ou stables) de flux, est donc une mesure importante dans la détermination de la pathologie de la maladie et l'efficacité du traitement. Grâce à l'introduction d'un modèle in vitro de co-culture et de la pression d'amortissement en aval de la pompe de sang qui produit le débit cardiaque simulé, diverses pathologies de maladies artérielles peuvent être étudiées.
Introduction
Les taux de morbidité pour les maladies cardiovasculaires sont la plus grande en Amérique, avec de nombreux résultant de vascularisation malsain. Des artères saines sont constituées de tissu élastique, avec une surface luminale doux revêtu d'une cellule endothéliale (CE) monocouche. Débit artériel peut être modélisée comme une fonction d'onde d'oscillation avec un débit moyen positif. L'indice de pulsatilité (PI) est le quotient d'oscillation ampleur et débit moyen (PI = (Max -. Min.) / Moyenne), 1 et a été modélisée in vitro avec élasticité variable de la cuve 2 élasticité artérielle est important dans le stockage de l'écoulement. énergie des contractions cardiaques, dilatant sous pression systolique, et joue un rôle important dans la modulation de PI d'écoulement de sang. Parce que le coeur maintient une approche cohérente, pulsatile, débit volumétrique, expansion artérielle augmente la zone de coupe, l'amélioration de la stabilité de l'écoulement en réduisant la vitesse d'écoulement, contrainte de cisaillement, et PI. Fréquemment, les changements artères malsaines présentes à l'élasticitéou de conformité, l'affichage de raidissement remodelage vasculaire, le tissu cicatriciel ou calcification 3, 4. En outre, d'autres troubles vasculaires, tels que hyperplasie néo-intimale (NIH), 5 l'hypertension et l'anévrisme et 6 fibrose vasculaire 4, peuvent se contracter le diamètre du vaisseau. Cependant, le traitement médicamenteux en cours et le traitement de l'appareil de maladies vasculaires négligent souvent l'importance du respect de la paroi de la cuve ou le débit sanguin dans la dynamique maladie vasculaire qui est souvent compliquée par des changements dans la morphologie de la cuve et des propriétés. Ni l'angioplastie par ballonnet ni stenting repondre la complication de la paroi 7 élasticité. Par conséquent, la modélisation in vitro de sang flux résultant de la maladie artérielle et des traitements est important dans les enquêtes sur les pathologies de la maladie et l'efficacité future du traitement. Ici, nous décrivons un procédé de réplication du flux sanguin physiologiques et pathologiques conçu pour déterminer la réponse cellulaire dans la maladie vasculaire Pathollogies. L'écoulement du fluide provoque la contrainte de cisaillement à la paroi de la cuve, qui est un signal mécanique important dans la santé des vaisseaux, affectant toutes les cellules dans le système vasculaire. Plusieurs capteurs mécaniques sur l'endothélium vasculaire pour le cisaillement de fluide ont été identifiés, y compris cil primaire démontré dans des études récentes pour endothéliale mechanosensing 8. L'activité des cellules endothéliales et la morphologie sont affectés par la vitesse d'écoulement, la direction et pulsatilité. En outre, des cellules musculaires lisses (SMC) la migration peut être affectée par mécano-signaux de circulation à faible vitesse par liquide interstitiel 9, et peut également se faire par la signalisation paracrine à partir de cellules endothéliales par leur réponse à l'écoulement et mécano-transduction des signaux de débit via cytokine libérer 10. La "dose" dépendance de cisaillement moyen, PI, et la signalisation paracrine peut également être interdépendants. A cet effet, la détermination de la réponse cellulaire à un cisaillement fluide vasculaire avec "dosage" varié en culture monocoucheou co-culture in vitro pourrait fournir des indications mécanistes dans le remodelage vasculaire et d'améliorer la maladie et la prédiction de traitement. Le système d'écoulement utilisé dans cette expérience se compose d'une pompe à sang, un réservoir d'air de l'écoulement d'amortissement en amont, un débitmètre en aval seulement utilisée lors de la configuration expérimentale, une culture de cellules en aval, la chambre d'écoulement à plaques parallèles, et le réservoir de support. Contrôle des variables de flux vasculaires tels que débit moyen, battements par minute, et PI peut être atteint par le taux de contrôle de flux, la fréquence du pouls et de la pression d'amortissement mise en place. Pompes à sang pulsatiles sont disponibles avec course variable déplacement, à la fréquence de course contrôlée, directement liées à signifier débit volumétrique, et la fréquence d'impulsion. Introduction d'un réservoir d'air à l'intérieur du circuit d'écoulement permet un amortissement de la pression, la réduction de l'oscillation d'écoulement de grandeur. Media est un fluide incompressible, tandis que l'air à l'intérieur de la chambre d'amortissement est compressible, permettant excès de pression de la vague de flux pour êtreabsorbée par compression de l'air. Le rapport air des médias permet un contrôle sur la quantité de l'amortissement se produit. Une chambre d'écoulement de culture de cellules sur mesure 75 mm de longueur par 50 mm de largeur a été créé à partir d'acrylique. Écoulement entre par l'orifice d'entrée, et se dilate à travers le collecteur d'admission, assurer un écoulement uniforme dans la totalité de la chambre d'écoulement. Flux et des structures similaires sont présents à la sortie de la chambre. Les cellules sont ensemencées sur des lames fonctionnalisées, et ensuite fixés à la chambre d'écoulement. Cela permet à de grandes populations, facilement récupérés après l'étude. Des expériences de co-culture peuvent utiliser une membrane de polycarbonate poreux pour éliminer le contact de cellule à cellule entre les cultures tout en permettant le transport cytokine / débit. Ce système a déjà été utilisé pour modéliser l'écoulement de haute PI et son effet sur la culture monocouche endothéliale et CE / SMC co-culture 1, 10, pour étudier la réponse cellulaire à la maladie de PI pathologiquement élevé. En décrivant le protocole utilisé pour modéliser ces flux conconditions, nous espérons aider les autres dans la détermination de la contribution de signal de débit à la cellule de réponse.
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Protocol
1. Silanisation et biomolécules fonctionnalisation de diapositive ou Polycarbonate Membrane
Note: Beaucoup de produits chimiques et de solutions dans ce protocole ont des taux d'évaporation élevés (de l'éthanol (EtOH), acétone, etc.). Autres étapes impliquent des temps d'incubation longs pour faible taux d'évaporation. Film de paraffine est recommandé de sceller les conteneurs. Attention: Beaucoup de produits chimiques (y compris: l'acide sulfurique, de l'acétone, (3-aminopropyl) triéthoxysilane, glutaraldéhyde, EtOH) sont considérées comme dangereuses ou volatile. Consulter la fiche de données de sécurité (FDS) de chaque matériau pour le stockage, la manipulation et l'élimination avant utilisation.
- Placez nouvelle lame de verre mesurant 75 mm par 50 mm par 1 mm, en propre, plat de coloration de lame de verre, sans égard à l'orientation, assurer la pleine immersion. Utiliser un récipient pour les étapes 1.1-1.12.
Remarque: Pour la co-culture, comprennent le polycarbonate (PC) membrane avec 0,4 microns la taille des pores, coupé à la taille de 75 mm par 50 mm, pour tous ste ultérieureps pour PC fonctionnalisation et l'ensemencement CE. - Immergez-diapositive dans l'acide sulfurique (20%), O / N.
Attention: Consulter la fiche signalétique pour l'acide sulfurique avant utilisation. - Laver glissière en les immergeant dans de l'eau désionisée (DI) pendant 5 minutes, trois fois, en changeant chaque fois DI.
- Plongez diapositive dans l'acétone pendant 30 min.
Attention: Consulter la fiche signalétique pour l'acétone avant de l'utiliser. - Plongez diapositive dans 6% (3-aminopropyl) triéthoxysilane solution / acétone O / N.
Attention: Consulter la fiche signalétique pour (3-aminopropyl) triéthoxysilane et de l'acétone avant de l'utiliser. - Immerger diapositive dans de l'acétone pendant 5 minutes, trois fois, en changeant chaque fois de l'acétone.
Attention: Consulter la fiche signalétique pour l'acétone avant de l'utiliser. - Laver par immersion dans un diaporama DI pendant 5 minutes, trois fois, en changeant chaque fois DI.
- Plongez diaporama en solution glutaraldéhyde / DI de 1,5% pendant 60 min.
Attention: Consulter la fiche signalétique pour glutaraldéhyde avant utilisation. - Laver par immersion dans un diaporama DI pendant 5 minutes, deux fois, en changeant chaque fois DI.
- Placer la lames dans 70% d'éthanol (EtOH) pendant 30 min dans stérile, hotte à flux laminaire.
- Retirer de l'EtOH et évaporer à permettre résidu restant. Immerger les lames en DI et le drain stérile afin de réhydrater les diapositives.
Remarque: Diapositives ou une membrane de PC peut être scellé dans le support de lame de verre et conservé à 4 ° C jusqu'à une semaine. Lors de l'utilisation pour la culture cellulaire, répétez les étapes 1.10 et 1.11. - Retirer la lame du support de diapositives et le placer dans un 100 mm par 100 mm boîte de Pétri carrée dans la hotte à flux laminaire.
Remarque: Ce récipient sera utilisé pour toutes les étapes restantes.- Préparer diapositive ou PC pour l'ensemencement des cellules endothéliales pour l'expérience de la monoculture.
- Manteau de la diapositive fonctionnalisé ou PC (étape 1.11) avec 1 ml de solution de fibronectine (25 ug / ml), d'un côté, recouvrant la surface approximative exposé à la chambre de culture cellulaire.
- Incuber les lames ou PC dans l'incubateur stérile réglé à 37 ° C pendant 1-2 heures.
- Après incubation, aspirer la solution restante à l'aide d'un glass aspirateur pipette reliée à un vide.
Remarque: Les lames peuvent maintenant être stocké O / N à 4 ° C pour une utilisation future.
- Suivre 1.12.2 étapes seulement pour la préparation d'EC / SMC co-culture. Préparer et ensemencer la culture lisse cellule musculaire (SMC) pour l'expérience de co-culture.
- Lieu joint en silicone sur le dessus de la glissière (étape 1.11), avec des dimensions de 75 mm sur le diamètre extérieur de 50 mm, diamètre intérieur de 50 mm par 30 mm, épaisseur de 0,5 mm, et des perforations qui alignent avec le vide de la chambre de flux.
- Préparer 1 ml SMC dans 10% de FBS / DMEM suspension. Neutraliser 1 ml de solution de 2 mg / ml de collagène de type I avec 7% de NaHCO 3 et 0,1 M de NaOH solution à pH de 7,4, et mélanger avec SMC suspension avec une densité cellulaire finale de 2 x 10 6 cellules / ml.
- Répandre la solution SMC au sein de joint et incuber diapositives à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 30 min.
- Après incubation, couvrir la diapositive avec du sérum 25 ml 0,1% fœtal bovin (FBS) mélangé modifié par DulbeccoEagle Medium (DMEM) pendant 72 heures.
- Préparer diapositive ou PC pour l'ensemencement des cellules endothéliales pour l'expérience de la monoculture.
- Cellules endothéliales de la Culture (ECS) sur membrane lame de verre / polycarbonate.
- Graine de 1 ml EC dans 10% de FBS / DMEM, avec concentration initiale de 6,0 x 10 5 cellules / ml, sur des surfaces de fibronectine de lame de verre ou une membrane de polycarbonate.
- Incuber les cellules dans un incubateur à 37 ° C, 5% CO 2 et 10% de FBS pendant 120 minutes.
- Couvrir les lames contenant des cellules avec plus de 10% de FBS / DMEM, et les placer dans l'incubateur à 37 ° C, 5% de CO 2 O / N, jusqu'à 70% -80% de confluence.
2. Détermination de la viscosité du fluide et débit volumétrique
Remarque: viscosimètres rotatifs sont des équipements sensibles, et le mode d'emploi de viscosimètre devraient être consultés avant la calibration, la réduction à zéro, ou effectuer des mesures.
- Déterminer cisaillement fluide désiré (τ) de la littérature de la vascularisation ciblée de l'expérience.
- Measure 1% de FBS / DMEM viscosité (μ), en utilisant un viscosimètre rotatif.
- Déterminer le débit volumétrique requis (Q) de l'équation de Poiseuille:
,
où τ = cisaillement de fluide, μ = viscosité, Q = vol. le débit, la largeur w = chambre, et h = hauteur de la chambre). - Régler la pompe à débit dérivé dans l'étape 2.3 de flux, et l'utilisation pour toutes les étapes subséquentes.
, 3. Détermination de l'indice pulsatilité
Remarque: Tous les ports de connexion au sein du système doivent être connectés avec Barb lock-ring pour-taille appropriée, ou connexions femelles luer-à-barbe. Le raccordement de tuyaux PVC peut alors être connecté à raccords cannelés, et le circuit terminé.
- Connectez circuit d'écoulement comme dans la figure 2, avec la chambre (Figure 3) et débitmètre à ultrasons d'amortissement dans le sens d'écoulement correct.
Remarque: ultrasons débitmètre est une pièce sensible de l'équipement, etle mode d'emploi doit être consulté avant l'utilisation. - Remplir circuit d'écoulement et le réservoir avec de l'eau DI, en veillant à ce tube de sortie de réservoir (la pompe) est immergée dans le volume du réservoir. Visualiser la forme d'onde de débit en utilisant un débitmètre.
- Ouvrez la vanne de sortie d'air sur la chambre d'amortissement pour changer le rapport de volume de fluide / air. Fermer valve de décharge à différents intervalles de niveau de liquide et calculer l'indice de pulsatilité (PI = (V Max - V min) / V moyenne) en utilisant la forme d'onde du débit de pointe (V Max), creux (V min), et la moyenne (moyenne V). Des valeurs PI record dans le cahier.
- Mark résultant niveau du liquide et PI sur la chambre d'amortissement, à l'aide d'un feutre à pointe, stylo à encre permanente pour une utilisation future. Déterminer les niveaux de PI souhaités de la pathologie la littérature 11.
- Silicon Tube Formation-facultatif, méthode plus avancée de pulsatilité contrôle
- Mélanger la base d'élastomère de silicone et un agent de durcissement à différents rapports (par exemple, un base rapport à agent de reticulation de 10: 1 à 36: 1.) de modules d'élasticité varie ciblées, comme illustré auparavant 2
- Fabriquer des tubes de silicone répétée processus dip-cure, plongeant brièvement canule en acier (14 G) dans le mélange de prépolymère de silicone avec un rapport prédéterminé base-agent de réticulation.
- Placer la canule de prépolymère revêtu dans un four réglé à 60 ° C pendant 4 heures pour durcir le revêtement de polymère sur la canule, à commuter la direction dans le milieu de processus de durcissement.
- Répétez le processus de trempage avec le même mélange d'élastomère de silicone et remettez au four pendant 4 heures supplémentaires, ce qui entraîne dans ~ 0,3 mm d'épaisseur des tubes.
- Retirer le tube de silicone ultra-mince de la canule en acier inoxydable.
- Connectez tubes à l'écoulement circuit au lieu de chambre d'amortissement, et PI de test pour chaque en 3.3.
4. Pompe Stérilisation
- Plongez la chambre d'écoulement (Figure 2), un tube en PVC, et des joints en 10% de peroxyde d'hydrogène (H 2 O 2). Laver avec DI stérile avant l'étape 4.
- Placez la pompe à sang sur une étagère de l'incubateur de rechange.
Remarque: Incubateur étagères doivent être en acier inoxydable, et être capable de supporter le poids de l'ensemble du circuit d'écoulement. - Remplir le circuit d'écoulement et le réservoir avec 10% de H 2 O 2 en veillant à ce tube de sortie de réservoir (la pompe) est immergée dans le volume du réservoir. Faire circuler H 2 O 2 par pompage dans le circuit pendant 20 min dans la hotte à flux laminaire avec une lumière UV sur.
- Aspirer tous H 2 O 2 à partir de tubes, et laver avec du PBS stérile par pompage à travers le circuit d'écoulement.
5. Débit Assemblée Chambre
Remarque: La chambre d'écoulement se compose d'un acrylique, plaque sur mesure, avec des orifices d'aspiration et orifices d'entrée et de flux de sortie (voir Figure 2). Ensemble de chambre consiste à placer la chambre d'écoulement et les joints au-dessus des supports de culture, properly aligné, et il est décrit ci-dessous.
- Réchauffez 1% de FBS / DMEM dans un bain d'eau à 37 C ° et préparer la chambre d'écoulement.
- Prenez diaporama CE sur les médias (de l'étape 1.13) et placez le joint sur le dessus avec le côté de la cellule vers le haut.
- (Facultatif) Prenez membrane de PC sur les médias (de l'étape 1.13) et placez le joint sur le dessus avec le côté de la cellule vers le haut. Placer la lame co-culture avec tête de série SMC (étape 1.12.2) sous la membrane de PC.
- Aligner canal de vide de la chambre d'écoulement avec les trous dans le joint d'étanchéité (figure 2).
- Fixez tube à vide aux ports de vide (Figure 2) assurant aucune fuite de médias à vide.
- Feuille de polycarbonate de place sous lame de verre et ensemble de chambre de flux de serrage avec pinces à ressort, un de chaque côté de la chambre de débit (figures 2 et 5).
- Système de la Place de l'écoulement dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2, et remplir le circuit avec les médias par pompage du réservoir rempli à basse pulsatilité.Maintenir ce flux pendant 4 heures pour le préconditionnement cellules.
- Régler le volume de fluide dans la chambre d'amortissement au niveau de la PI marquée, et de la culture pour le temps désiré.
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Representative Results
Maintien des conditions d'écoulement est tributaire de l'assemblage correct du circuit de flux (Figure 1). Le tube diamètre est important dans la sélection d'un ensemble, avec des diamètres plus grands réduire la résistance d'écoulement et la chute de pression subséquente, avant et après la chambre de culture. Pour assurer la vitesse de pression et de débit destiné, assembler le système avec débitmètre avant l'expérience avec des tubes destinés. Alignement de la chambre de culture vide canal (Figure 2), avec des perforations sur un joint en silicone (non représenté), maintient joint à l'intérieur du circuit d'écoulement. Pour assurer l'étanchéité, des pinces à ressort peuvent être utilisés pour appliquer une pression supplémentaire sur le joint. Les lames de verre doivent être protégés par la feuille de polycarbonate, coupés à la fonction de la zone de la chambre (figure 6). Parce que la vitesse d'écoulement peut en outre contribuer à des complications dans le maintien de joints d'étanchéité, les médias peuvent être modifiés par l'addition de dextrane à augmenter la viscosité du support. Grâce à l'augmentation des Viscoslité, de cisaillement de fluide peut être maintenu à une vitesse plus faible. La réponse du système et l'intégrité peuvent être vérifiées dans le milieu de l'expérience tout simplement en observant les niveaux de liquides et de couleur fluide dans la chambre et le réservoir d'amortissement (Figure 3). Le niveau de liquide doit maintenir une valeur constante. Niveau de liquide initial devrait être marqué à la fois sur réservoir et chambre d'amortissement pour la comparaison de bilan. Des ajustements peuvent être faits par l'addition de médias à l'initiation de l'expérience, ou de permettre à de l'air à l'entrée chambre d'amortissement. La figure 4 illustre un enregistrement représentatif de la vitesse d'écoulement. Phénol coloration rouge devrait diminuer au cours de l'expérience. À la fin de l'expérience, les médias devraient être autorisés à vider à partir du circuit, et stockés à -80 ° C pour la mesure congélateur ou un usage ultérieur. Les médias peuvent être analysés pour la teneur en métabolite ou des cytokines libérées, ou utilisés pour surveiller la signalisation paracrine de réponses cellulaires à l'aide pour le culte de la celluleure. Les cellules peuvent être visualisés sous microscope à contraste de phase et la morphologie de la confluence (Figure 5). Broche comme la morphologie est observée dans EC après HPF plus de 24 heures (figure 7).
Figure 1. Débit circuit schématique. Le débitmètre marqué dans le schéma est utilisé pour mesurer les niveaux de l'indice de pulsatilité fixés par la chambre d'amortissement. Débit forme d'onde doit être mesurée avec des diamètres de tubes de connexion destinés à assurer la pression du système reste physiologique. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. cha débitmbre conception et mesures. canal externe est connecté à vide. Image Centre démontre serrage de la chambre. Photo de droite illustre la conception du joint. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Débit chambre d'amortissement. Flux chambre d'amortissement schématique indique destiné direction de l'écoulement et de la connexion. Air soupape de décharge est ouverte, la vanne de sortie est fermée et le liquide remplit la chambre au niveau de la PI souhaitée. Lors de l'ouverture de la vanne de sortie et de fermeture de la soupape d'échappement d'air, curriculum vitae d'écoulement et les niveaux de fluide dans la chambre maintient les niveaux. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. 
Figure 4. Vagues de flux d'échantillon de divers indices de pulsatilité. Haut pulsatilité Flow (gauche) et Low pulsatilité Flow (à droite). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Co-culture schématique. Co-culture montre écoulement pulsatile sur des cellules endotheliales, des cellules musculaires lisses dans un gel de collagène. La libération de cytokines à partir de cellules peut traverser la membrane de polycarbonate poreux. S'il vous plaîtcliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6. Endothelial Cell Morphologie changements avec conditions de débit. Confluent de la culture de cellules endothéliales sur la membrane de polycarbonate fonctionnalisés. Montré sont avant que le débit (à gauche) et après écoulement (à droite). Le débit est montré dans des conditions différentes, statique (pas de vitesse), constante (vitesse constante), une forte impulsion (haute pulsatilité). Les cellules sont colorées avec 2% de cristal violet. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7. Muscle lisseExpression de la protéine cellulaire change avec Conditions débit. Des cellules musculaires lisses expression d'α-actine musculaire lisse (SMA) et la myosine chaîne lourde (SM-MHC) dans des conditions, statique (pas de vitesse), flux constant (à vitesse constante), et une grande impulsion différentes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.
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Discussion
Ce protocole décrit un procédé de reproduction d'écoulement pulsatile in vitro, et peut-être première étape dans la détermination instrumentale de la contribution des conditions d'écoulement à des pathologies de la maladie. Des études antérieures utilisant ce protocole ont trouvé des conditions de flux contribuent à la réponse inflammatoire vasculaire. 1, 10 En outre, ce protocole est destiné aux laboratoires expérimentés. En tant que tel, ni en profondeur la mécanique des fluides, ni analyse biochimique est décrite ici. Pour la dynamique plus avancés fluides, 1 et techniques avancées, consultez la littérature 2 critique dans la culture de cellules sous cisaillement fluide sur de longues périodes sont:. 1) maintenir un circuit d'écoulement étanche, à l'exception du réservoir, et 2) prévenir la contamination tout au long de l'expérience. Étanchéité du circuit d'écoulement est essentiel dans le maintien du volume des médias et des niveaux de PI correctes, avec introduction d'air involontaire affectant les paramètres d'écoulement désirées. Air supplémentaire dans le système mai partiellement obstruer l'écoulement dans le flux, de déranger chemin d'écoulement et d'améliorer la conformité de l'ensemble du système. Alors que des débits volumétriques seraient maintenues, diminué superficie de la section de cette obstruction partielle conduirait à des augmentations localisées de vitesse, et les discontinuités de surface. Les deux variation de vitesse d'écoulement et des discontinuités de surface contribueraient à couler déstabilisation, et éventuellement la turbulence. Enfin, l'air emprisonné dans le système d'écoulement sous pression agirait comme un amortissement compressible de l'écoulement, ce qui diminue la PI à partir de son niveau souhaité. Comme le circuit d'écoulement est de volume constant, l'air emprisonné serait également provoquer une fuite de médias qui peuvent nuire cellules d'impact, augmentation de la concentration de métabolite dans le temps. Sang pompe fonction d'étanchéité et sont tributaires de la température, donc le placement de la pompe dans l'incubateur peut introduire des complications d'étanchéité. Tant augmentation de la présence d'air dans le circuit d'écoulement et la perte de médias à travers la pompe d'étanchéité ou de dystion pourrait augmenter la variabilité de l'environnement de la cellule, et conduire à des résultats erronés. Prévention de la contamination pendant l'expérience est importante dans toute la culture cellulaire. Étanchéité du circuit d'écoulement doit être à nouveau souligné pour empêcher l'entrée de contaminants ainsi. Médias de flux fournit de nombreux éléments nutritifs et des sucres nécessaires à la croissance des micro-organismes, donc le nettoyage du circuit immédiatement après utilisation est nécessaire. En outre, un couvercle de la pompe opaque, réduit l'efficacité de rayonnement UV pour la stérilisation de la pompe dans son ensemble. Ceci, couplé à l'incompatibilité du piston acrylique avec de l'éthanol, nécessite une stérilisation complète le circuit à l'aide de peroxyde d'hydrogène (H 2 O 2). La prévention de l'évolution de la contamination lorsque le système est pas en service, l'utilisation d'une solution de stérilisation, et le maintien d'un environnement stérile peut présenter des complications tout en permettant une ou l'autre contamination ou de stérilisation de la culture cellulaire. Limites de cette technique comprennent l'incapacité de bonLy modéliser la vague de flux complexe de la circulation sanguine physiologique. Alors que le système d'écoulement fait offrir une approximation près, les différents aspects de la forme d'onde complexe vu de l'écoulement physiologique ne peuvent pas être contrôlés ou modifiés. En outre, en inversant la contrainte de cisaillement dans l'écoulement à mouvement alternatif est une complication vu dans une maladie artérielle, et ne peuvent par répliqué avec ce système d'écoulement. En outre, l'étude à long terme de la réponse cellulaire pourrait être plus compliqué et difficile, principalement en raison de la performance de la pompe. La réduction de la résistance aval est essentiel de maintenir l'intégrité du système d'écoulement et l'efficacité de pompage. Enfin, le système ci-dessus utilise des lames de verre et des membranes de polycarbonate, qui ne modélisent pas physiologiquement le système vasculaire, et ne considère pas la signalisation mécanique résultant de stretch artérielle ou basale rigidité de la membrane. Auparavant, une étude a utilisé un système pulsatile capable de reproduire un flux pulsatile en utilisant la seringue pompes 1 2. L'efficacité du système dans reproducing la haute PI pourrait être affectée par les limitations sur la vitesse de la pompe et l'étanchéité. La méthode de la chambre d'amortissement est plus simple dans son application, ne nécessitant pas de programmation de la pompe. Les applications futures du système de flux permettraient de signalisation mécanique à la suite de artérielle extensible par incorporation de tubes élastiques pour remplacer la chambre d'écoulement et un toboggan. Grâce à cette amélioration, le respect dépareillés et discontinuités de surface luminale peuvent encore être étudiés.
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Disclosures
Les auteurs ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier les sources de financement, y compris les AHA (13GRNT16990019 à WT) et NHLBI (HL097246 et HL119371 à WT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 34850 | |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Glass Slide (70 mm x 50 mm) | Sigma-Aldrich | CLS294775X50 | |
| Polycarbonate Membrane | Millipore Corp. | HTTP09030 | |
| Silicone Gasket | Grace Bio-Labs | RD 475464 | |
| Fibronectin (25 μg/ml) | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Collagen Type-I | Sigma-Aldrich | C3867 | |
| NaHCO3 | Fluka | 36486 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Damping Chamber | This chamber is custom made, and may be requested using the engineering drawing of Figure 3. | ||
| Blood Pump | Harvard Apparatus | 529552 | |
| Poly-Vinyl Carbonate Tubing | US Plastic | 65066, 65063, 65062 | Various sizes may be required |
| Luer Connections | Nordson Medical | Various | Various sizes will be required, and a number of parts should be purchased for replacement use. |
| Culture Chamber | Machined in-house | Custom | Acrylic may be purchased in sheets and machined for intended use. The engineering drawing shown in Figure 2 may be used to recreate this chamber. |
| Square Petri Dish | Cole-Parmer | EW-14007-10 | |
| Glass Slide Holder | Capitol Scientific | WHE-900303 | |
| Fetal Bovine Serum | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Flow Meter | Sonotec, GmbH | Sonoflow co.55/060 | |
| Sylgard Elastomer Kit | Sigma-Aldrich | 761036-5EA | |
| 14 G Steel Cannula | General Laboratory Supply | S8365-1 |
References
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