Summary
Этот протокол повторяет физиологическим или патологическим поток крови в пробирке, чтобы помочь в определении клеточного ответа в патологии заболевания. Вводя давление демпфирования камеру вниз по течению от насоса крови, кровоток через сосудистую может быть наложен воспроизводятся и на монослой эндотелия сосудов или миметического совместного культивирования.
Abstract
Сосудистые заболевания является частой причиной смерти в Соединенных Штатах. Здесь мы представляем метод для изучения вклада динамики потока к патологии сосудистого заболевания. Нездоровые артерии часто присутствует с настенным жесткости, рубцов, стеноза или частичное, которые могут повлиять на все скорости потока жидкости, и величина пульсирующего потока, или индексом пульсации. Репликация различных условий потока является результатом настройки давления потока демпфирующей камере ниже по потоку от насоса крови. Введение воздуха в системе замкнутого потока позволяет сжимаемой среды поглощать ударные давление от насоса, и, следовательно, изменяются индекс пульсации. Описываемый способ просто воспроизводить, с высоко контролируемого ввода и легко измеримых результатов. Некоторые ограничения воссоздание комплекса физиологической формы импульса, который только приближенно системой. Эндотелиальные клетки, клетки гладких мышц и фибробласты страдают от Thr кровотокаух артерию. Динамический компонент кровотока определяется выходной и артериальной стенки соответствии сердечной. Сосудистая клеток механо-трансдукции динамики потоков может вызвать высвобождение цитокинов и перекрестные помехи между типами клеток внутри артерии. Совместное культивирование клеток сосудов является более точная картина отражает взаимодействие клетка-клетка на стенки кровеносных сосудов и сосудов ответ на механическое сигнализации. Вклад динамики потоков, в том числе клеточного ответа на динамических и средних (или стационарных) компонентов потока, поэтому важным показателем в определении патологии заболевания и эффективность лечения. Путем внедрения в пробирке модель совместного культивирования и давление демпфирования ниже насоса крови, которая производит имитацию сердечного выброса, различные патологии артериальной болезни могут быть исследованы.
Introduction
Заболеваемость сердечно-сосудистых заболеваний являются крупнейшим в Америке, многие в результате нездорового сосудов. Здоровые артерии состоят из эластичной ткани, с мягкой поверхности просвета покрытого эндотелиальных клеток (EC) монослоя. Артериальная потока может быть смоделирована как колебательной волновой функции с положительной средней скорости потока. Индекс пульсации (PI) является фактором колебаний величины и среднего потока (PI = (Макс. - Мин.) / Среднее), 1 и был смоделирован в пробирке с переменной эластичностью сосудов 2 эластичности артерий является важным хранения потока. энергия сердечных сокращений, расширяя при систолического давления, и играет важную роль в модуляции кровотока PI. Потому что сердце поддерживает последовательную, пульсирующее, объемный поток, артериальная расширение увеличивает площадь поперечного сечения, укрепления стабильности потока за счет снижения скорости потока, напряжение сдвига, и PI. Часто, нездоровые артерии представляют изменения эластичностиили соответствие, отображение жесткости из сосудистого ремоделирования, рубцовой ткани или кальцификации 3, 4. Кроме того, другие сосудистые расстройства, такие как гиперплазии неоинтимы (NIH), 5 аневризмы и гипертонии 6 и сосудистой фиброза 4, может сжиматься диаметр сосуда. Тем не менее, текущее лечение наркомании и лечение устройство сосудистых заболеваний часто пренебрегают важность соблюдения динамики стенки сосуда или кровотока в сосудистой болезни, которая часто осложняется изменениями в морфологии сосуда и свойств. Ни баллонная ангиопластика, ни стентирование ответить на усложнение стены эластичности 7. Таким образом, моделирование в пробирке кровь течет в результате заболеваний артерий и лечения имеет важное значение в расследовании патологий болезни и будущей эффективности лечения. Здесь мы опишем метод тиражирования физиологических и патологических кровоток, предназначенный для определения реакции клеток в Pathol сосудистых заболеванийгиях. Поток жидкости вызывает напряжение сдвига на стенке сосуда, что является важным механический сигнал в здоровье сосудов, влияет на все клетки в сосудистой. Несколько механические датчики на эндотелий сосудов для жидкости сдвига были определены, в том числе первичной реснички, показанной в последних исследованиях для эндотелия mechanosensing 8. Эндотелиальная активность клеток и морфология влияют на скорость потока, направление и пульсации. Кроме того, клетки гладкой мышцы (SMC) миграция может быть затронуты механо-сигналов низкого скорости потока через интерстициальной жидкости 9, а также может быть через паракринной сигнализации от эндотелиальных клеток через их ответ на поток и механо-трансдукции сигналов расхода с помощью цитокина освободить 10. К "доза" зависимость среднего сдвига, PI, и паракринной сигнализации может быть взаимозависимы. Для этого, определение реакции клеток сосудов к сдвигу жидкости с различной дозировки "" в монослоя культурыили совместное культивирование в пробирке может обеспечить механистические идеи в ремоделирования сосудов и улучшить болезни и прогноз лечения. Система подачи в этом эксперименте использовали состоит из насоса крови, выше по течению потока в воздушном резервуаре демпфирования, ниже по потоку расходомера только во время экспериментальной установки, расположенный ниже по потоку культуры клеток, проточную камеру с параллельными пластинами, и средства массовой информации резервуара. Контроль переменных сосудистых потока, такие как средняя скорость потока, ударов в минуту, и ПИ может быть достигнуто путем контроля расхода, частоты пульса, и внедрение давления демпфирования. Пульсирующие насосы крови доступны со смещением переменной инсульта, при контролируемой частоты хода, относящиеся непосредственно к виду объемный расход и частоту пульса. Введение воздушный резервуар внутри контура потока позволяет демпфирования давления, уменьшая величину колебаний потока. Медиа несжимаемой жидкости, в то время как воздух внутри камеры затухания является сжимаемым, что позволяет избыточное давление от волны потока будетпоглощается сжатия воздуха. Воздух соотношение СМИ позволяет за контроль над, как происходит большое демпфирование. Пользовательский культуры клеток проточная камера 75 мм в длину на 50 мм в ширину была создана из акрила. Поток входит через входное отверстие, и расширяет через впускной коллектор, обеспечивающий равномерную подачу по всей полноте проточную камеру. Похожие потока и структуры присутствуют на выходе камеры. Клетки высевают на функционализированных слайды, а затем прикрепляется к проточной камере. Это позволяет для больших групп населения, легко вызываются после исследования. Сотрудничество культуры эксперименты могут использовать пористую мембрану из поликарбоната для устранения клетки к клетке контакт между культурами, позволяя транспорт цитокинов / потока. Эта система была ранее использована для моделирования высокого пи поток и его влияние на эндотелиальную культуры монослоя и EC / SMC сокультуре 1, 10, исследовать реакцию клеток на патологически высокой заболевания ПИ. Описывая протокол, используемый для моделирования этих кон потокаусловиях, мы надеемся помочь другим в определении вклада сигнала потока на мобильные ответ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. силанизация и биомолекулы Функционализация Slide или поликарбонат Мембрана
Примечание: Многие из химических веществ и решений в этом протоколе имеют высокие скорости испарения (этанол (EtOH), ацетон и т.п.). Другие шаги влекут за собой длинные времени инкубации для малых скоростей испарения. Парафин фильм рекомендуется для герметизации контейнеров. Внимание: Многие из химических веществ (в том числе: серная кислота, ацетон, (3-аминопропил) триэтоксисилана, глутаровый альдегид, этанол), считаются опасными или летучими. Обратитесь паспорт безопасности материала (MSDS) каждого материала для надлежащего хранения, обработки и утилизации перед использованием.
- Поместите новый слайд стекла измерения 75 мм на 50 мм на 1 мм, в чистом стекле, окрашивание блюдо без учета ориентации, обеспечивая полное погружение. Используйте контейнер для шагов 1.1-1.12.
Примечание: Для совместной культуры, включают в себя поликарбонат (ПК) мембрана с 0,4 мкм размером пор, нарезанные по размеру 75 мм на 50 мм, для всех последующих степс для ПК функционализации и ЕС посева. - Погружают слайд в серной кислоте (20%), O / N.
Внимание: Проконсультируйтесь с MSDS для серной кислоты перед использованием. - Промыть слайд погружением в деионизированной воде (DI) в течение 5 мин, трижды, изменяя DI каждый раз.
- Погружают слайд в ацетоне в течение 30 мин.
Внимание: Проконсультируйтесь с MSDS для ацетона перед использованием. - Погружают в слайд 6% (3-аминопропил) триэтоксисилан / ацетонового раствора O / N.
Внимание: Проконсультируйтесь с MSDS для (3-аминопропил) триэтоксисиланом и ацетона перед использованием. - Погружают слайд в ацетоне в течение 5 мин, трижды, изменяя каждый раз ацетоном.
Внимание: Проконсультируйтесь с MSDS для ацетона перед использованием. - Промыть слайд погружением в DI в течение 5 мин, трижды, изменяя DI каждый раз.
- Погрузитесь в слайд 1,5% раствора глутарового альдегида / DI в течение 60 мин.
Внимание: Проконсультируйтесь с MSDS для глутаральдегидом перед использованием. - Промыть слайд погружением в DI в течение 5 мин, два раза, изменяя DI каждый раз.
- Место слайдс в 70% этаноле (EtOH) в течение 30 мин в стерильной ламинарного потока капотом.
- Удалить этанола и позволяют остатку испариться. Погрузитесь слайдов в стерильной DI и канализации для того, чтобы увлажняет слайдов.
Примечание: Слайды или ПК мембрана может быть запечатаны в держатель стекло и хранили при 4 ° С в течение одной недели. При применении для культивирования клеток, повторите шаги 1.10 и 1.11. - Удалить слайд из держателя слайдов и поместите его в 100 мм на 100 мм квадратный Петри в капот ламинарного потока.
Примечание: Этот контейнер будет использоваться для всех остальных стадий.- Подготовка слайд или ПК для посева эндотелиальных клеток для монокультуры эксперимента.
- Шерсть функционализованный слайд или ПК (этап 1.11) с 1 мл раствора фибронектина (25 мкг / мл), с одной стороны, охватывающих приблизительно ту зону, подверженную клеточной культуральной камере.
- Инкубируйте слайдов или ПК в стерильной инкубатор при 37 ° С в течение 1-2 ч.
- После инкубации аспирации оставшийся раствор с помощью GLASS аспиратор пипетки подключен к вакууме.
Примечание: Слайды теперь могут быть сохранены o / n при 4 ° С для последующего использования.
- Следуйте 1.12.2 шаги только для подготовки ЕС / SMC совместно культуры. Подготовка и семян гладкая мышечная клетка (SMC) культуру эксперимента сокультуры.
- Место силиконовые прокладки на верхней части слайда (шаг 1,11), с размерами 75 мм на 50 мм внешний диаметр, внутренний диаметр 50 мм на 30 мм, толщиной 0,5 мм и перфорации, которые выравнивают проточную камеру вакууме.
- Подготовка 1 мл SMC в 10% FBS / DMEM подвески. Нейтрализации 1 мл раствора 2 мг / мл коллагена типа I с 7% NaHCO 3 и 0,1 М NaOH в растворе рН 7,4, и смешивают с суспензией SMC с конечной плотностью клеток 2 х 10 6 клеток / мл.
- Распространение решение SMC в прокладке и инкубировать слайды при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 30 мин.
- После инкубации, покрыть слайд с 25 мл 0,1% бычьего сывороточного плода (FBS), смешанный в Игла в модификацииДульбекко (DMEM), в течение 72 ч.
- Подготовка слайд или ПК для посева эндотелиальных клеток для монокультуры эксперимента.
- Культура эндотелиальные клетки (ECS) на предметное стекло / поликарбонатную мембрану.
- Семенной 1 мл ЭК в 10% FBS / DMEM, с начальной концентрацией 6,0 х 10 5 клеток / мл, по фибронектина поверхностей стекло или поликарбонатную мембрану.
- Инкубируйте клетки в инкубаторе при 37 ° С, 5% СО 2 и 10% FBS, в течение 120 мин.
- Крышка скользит, содержащие клетки с дополнительным 10% FBS / DMEM и в инкубаторе место в 37 ° С, 5% СО 2 O / N, до 70% -80% сплошности.
2. Определение вязкости жидкости и объемный расход Оценить
Примечание: Поворот вискозиметры чувствительны оборудование, и руководство пользователя вискозиметр следует проконсультироваться перед калибровкой, обнуление, или при выполнении измерений.
- Определите желаемый сдвиг жидкости (т) из литературы адресной сосудистой эксперимента в.
- Изме 1% FBS / DMEM, вязкость (μ), используя ротационного вискозиметра.
- Определить необходимый объемный расход (Q) из уравнения Пуазейля:
,
где τ = сдвига жидкости, μ = вязкость, Q = т. расход, W = ширина камеры, и ч = высота камеры). - Установите насос темпы полученный в шаге 2.3 течь, и использовать для всех последующих шагов.
, 3. Определение индекса пульсации
Примечание: Все порты подключения в системе должно быть связано с соответствующим размером замок-кольцо-на-колючка, или женщин Луер-на-колючка соединений. Подключение трубки из ПВХ может быть подключен к анкерных фитингов, и цепь завершена.
- Подключите циркуляционный контур как показано на рисунке 2, с затуханием камеру (рисунок 3) и ультразвуковой расходомер в правильном направлении потока.
Примечание: Расходомер ультразвуковой является чувствительным часть оборудования, ируководство пользователя необходимо проконсультироваться перед использованием. - Заполните схему потока и резервуар с дистиллированной водой, обеспечивая на выходе трубки коллектора (насоса) погружен в объеме резервуара. Представьте потока сигнала с использованием расходомера.
- Открыть выпуск воздушный клапан на демпфирования камеры, чтобы изменить соотношение жидкости / воздуха громкости. Закрыть воздуховыпускной клапан с различными интервалами уровень жидкости и расчета индекса пульсации (PI = (V макс - В мин) / V Среднее) с помощью пикового потока сигнала (V макс), корыто (V мин), а значит, (V Среднее). Запись значения PI в блокнот.
- Отметить результате уровень жидкости и PI на демпфирования камеры, используя фетра, несмываемыми чернилами для использования в будущем. Определите требуемых уровней PI из патологии литературы 11.
- Силиконовая трубка Formation- Дополнительно, более продвинутый способ управления пульсации
- Смешайте базу силиконовой эластомерной и отвердитель в различных соотношениях (например, БАСотношение е-к-сшивающего агента от 10: 1 до 36: 1.) для разнообразных целевых модулей упругости, как показано ранее 2
- Изготовление силиконовых трубок при повторном процессе погружения отверждения, кратко погружения стального канюли (14 г) в силиконовой смеси форполимера с заданным соотношением база-сшивающего агента.
- Поместите форполимера покрытием канюли в сушильном шкафу при температуре 60 ° С в течение 4 ч, чтобы вылечить полимерное покрытие на канюлю, переключение направления в середине процесса отверждения.
- Повторите процесс погружения с тем же эластомерной смеси силиконового и поместить обратно в печь для дополнительного 4 ч, в результате чего ~ 0,3 мм толщиной труб.
- Извлеките ультратонкий силиконовую трубку с канюлей из нержавеющей стали.
- Подключите трубы, чтобы цепь вместо затухания камеру и тест PI для каждого потока, как в 3.3.
4. Насос Стерилизация
- Погрузитесь в камеру потока (рисунок 2), трубы ПВХ, и прокладки в 10% перекись водорода (H 2 O 2). Промыть стерильной DI перед шагом 4.
- Поместите насос крови на запасной инкубатора полке.
Примечание: Инкубатор полки должны быть из нержавеющей стали, и быть в состоянии выдержать вес всей цепи потока. - Заполните схему потока и резервуар с 10% H 2 O 2, обеспечивая на выходе трубки коллектора (насоса) погружен в объеме резервуара. Распространить H 2 O 2 путем откачки через схему в течение 20 мин в ламинарном потоке с УФ-света на.
- Аспирируйте все H 2 O 2 из трубы, и промыть стерильной PBS путем откачки через схему потока.
5. Расход палата Ассамблея
Примечание: Камера поток состоит из акрила, заказ пластины, с вакуумными портами и портами входе и выходе потока (рисунок 2). Палата в сборе состоит из размещения проточную камеру и прокладки на вершине культуры слайдов, проPerly выровнены, и описана ниже.
- Разминка 1% FBS / DMEM в С на водяной бане 37 ° и подготовить проточную камеру.
- Возьмите EC слайд из средств массовой информации (со стадии 1.13) и место прокладки на верхней стороне с сотового вверх.
- (Необязательно) Возьмите PC мембраны из средств массовой информации (начиная с шага 1.13) и место прокладки на верхней стороне с сотового вверх. Поместите сокультуры слайд с посеянного SMC (шаг 1.12.2) под PC мембраны.
- Совместите вакуумный канал проточной камеры с отверстиями в прокладке (рисунок 2).
- Прикрепите к вакуумную трубку вакуумных портов (рисунок 2) не гарантирует отсутствие утечек в СМИ вакууме.
- Место поликарбонат под стекло и узла камеры зажим потока с весенними зажимами, по одному на каждой стороне камеры потока (рис 2 и 5).
- Система Место потока в инкубаторе при 37 ° С и 5% СО 2, и заполнить контур со средствами массовой информации путем откачки из заполненного резервуара при низкой пульсации.Поддерживать этот поток в течение 4 ч для предварительной подготовки клетки.
- Отрегулируйте объем жидкости в камеру для демпфирования отмеченного уровня PI и культуры для нужного времени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Обеспечение условий потока зависит от правильной сборки схемы потока (рис 1). Диаметр трубки является важным выбора в сборе, с большими диаметрами, снижающих сопротивление течению и последующее падение давления до и после культивирования камеры. Для обеспечения скорости, предназначенный давления и расхода, собрать систему с расходомером, прежде чем эксперимента с предполагаемой трубки. Выравнивание культура камеры вакуумного канала (рис 2), с перфорацией на силиконовой прокладке (не на фото), поддерживает печать в схеме потока. Чтобы обеспечить уплотнение, пружинные зажимы могут быть использованы для применения дополнительного давления на прокладку. Стеклянные слайды должны быть защищены поликарбонатного листа, вырезать, чтобы соответствовать площади камеры (рисунок 6). Поскольку скорость потока может дополнительно способствовать осложнений в поддержании уплотнения, средства массовой информации, могут быть изменены путем добавления декстрана для повышения вязкости носителя. В результате увеличения Viscosность, сдвиг жидкости можно поддерживать на более низкой скорости. Реагирование и целостность системы может быть проверена в середине эксперимента, просто наблюдая уровни жидкости и цвет жидкости в демпфирующей камере и резервуар (рисунок 3). Уровень жидкости должен поддерживать постоянное значение. Начальный уровень жидкости должен быть отмечен как на водохранилище и демпфирования камеру для сравнения техосмотра. Корректировки могут быть сделаны путем добавления средств массовой информации в эксперименте инициации, или позволяя вход воздуха в камеру демпфирования. Рисунок 4 иллюстрирует характерную запись скорости потока. Фенол красный цвет должна уменьшаться в течение всего эксперимента. По окончании эксперимента, среда должна стекать из схемы, и хранили при -80 ° C морозильнике для будущего использования или меры. Медиа могут быть проанализированы на содержание метаболита или выпущен цитокины, или использоваться для мониторинга паракринную сигнализацию клеточных реакций при использовании его для культа клетокЮр. Клетки могут быть отображены в условиях фазового контраста микроскопии для морфологии и слияния (рис 5). Шпиндель морфологией наблюдается в ЭК после ФВЧ в течение 24 ч (рис 7).
Рисунок 1. Поток принципиальная схема. Расходомер помечены в схеме используется для измерения уровня индекса пульсации, установленные затухания камеры. Поток сигнала должна быть измерена с диаметрами, предназначенных соединение труб для обеспечения давления в системе остается физиологическая. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. ча потокаmber дизайн и измерения. Внешний канал подключен к вакууме. Центр картина демонстрирует фиксацию камеры. Изображение справа иллюстрирует конструкцию прокладки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Поток демпфирования палата. Поток демпфирования камера схематично указывает направление потока предназначены и связь. Воздушный выпускной клапан открыт, выпускной клапан закрыт, и жидкость заполняет камеру до требуемого уровня PI. По открытия выпускного клапана и закрытия клапана для выпуска воздуха, резюме потока и уровня жидкости в камере поддерживает уровень. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 
Рисунок 4. Волны потока пробы с различными индексами пульсации. Высокая пульсации потока (слева) и низкой пульсации расхода (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. Совместное культивирование потока Принципиальная. Совместное культивирование показывает пульсирующую подачу над эндотелиальных клеток, с гладкомышечных клеток в коллагеновый гель. Высвобождение цитокинов из клеток может переступить через пористую мембрану из поликарбоната. Пожалуйста,Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6. Эндотелиальных клеток Морфология Изменения с условиями потока. Сливной эндотелиальных клеток на культуру функционализированной поликарбонатную мембрану. Показаны прежде, чем поток (слева) и после (справа потока). Поток показан при различных условиях, статический (без скорости), устойчивый (постоянная скорость), высокий пульс (высокий пульсации). Клетки окрашивали 2% кристаллическим фиолетовым. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7. Гладких мышцСотовый Экспрессия белка Изменения с условиями потока. Гладкомышечных клетках экспрессия альфа-гладких мышц актина (SMA) и тяжелой цепи миозина (SM-МНС) в разных условиях, статический (без скорости), устойчивый поток (постоянная скорость), и высокий пульс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть больше Версия этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описан способ воспроизведения потока пульсирующего в пробирке, и может играть важную роль первый шаг в определении вклада условий потока в патологии болезни. Предыдущие исследования, использующие этот протокол нашли условия потока способствуют сосудистой воспалительной реакции. 1, 10 Кроме того, этот протокол предназначен для опытных лабораторий. Таким образом, ни в глубине механики жидкости, ни биохимический анализ описан здесь. Для более продвинутых гидродинамики, 1 и передовых методов, обратитесь к литературе 2 Критическое в культивировании клеток при сдвиге жидкости в течение продолжительных периодов являются: 1). Поддерживать герметичный контур потока, исключая резервуар, и 2) предотвращения загрязнения в течение всего эксперимента. Уплотнение схемы потока необходимо для поддержания объема средств массовой информации и правильные уровни PI, с введением непреднамеренного воздуха, влияющих желаемые параметры потока. Дополнительный воздух в системе может рartially затруднить поток в потоке, нарушить путь потока и повысить соответствие всей системы. В то время как значения объемного расхода будет поддерживаться, снижение площади поперечного сечения от этой частичной обструкции приведет к увеличению локализованных скорости и поверхностных неоднородностей. И изменение скорости потока и поверхности разрывы будут способствовать дестабилизации потока, и, возможно, турбулентности. Наконец, любой захваченный воздух в проточной системе сжатого будет выступать в качестве сжимаемой затуханию потока, тем самым уменьшая PI от его желаемого уровня. Как схема потока постоянного объема, захваченный воздух также может вызвать утечку носителей, которые могут неблагоприятно клетки воздействия, концентрации метаболитов увеличивается с течением времени. Кровь герметизации насоса и функция зависит от температуры, поэтому размещение насоса в инкубаторе может ввести уплотнительные осложнений. И увеличение присутствия воздуха в контуре потока и потери сред через уплотнения насоса или malfuncция может увеличить изменчивость окружающей среды клеток и привести к неточным результатам. Предотвращение загрязнения в ходе эксперимента важно во всех клеточных культурах. Уплотнение циркуляционного контура должен снова подчеркнуть, чтобы предотвратить попадание загрязнений, а также. Поток средств массовой информации предоставляет множество питательных веществ и сахаров, необходимых для роста микроорганизмов, поэтому чистка цепи сразу после использования необходимо. Кроме того, непрозрачная крышка насоса, снижает эффективность УФ-излучения при стерилизации общего насоса. Это, в сочетании с несовместимостью акриловой поршня с этанолом, требует полного стерилизации печатной использованием перекиси водорода (H 2 O 2). Профилактика роста загрязнения, когда система не используется, использование стерилизующего раствора, и поддержание стерильной среде всего могут вводить либо осложнений позволяет загрязнение или стерилизации клеточной культуре. Ограничения этого метода включают неспособность к правильномуLY моделировать сложную потока волну в физиологическом кровотока. В то время как система потока делает предложение близкое приближение, различные аспекты комплексного сигнала видели в физиологическом течении не может управляться или изменяться. Кроме того, реверсивный напряжение сдвига в возвратно-поступательное движение потока является осложнением видно в некоторых артерий, может и не реплицируются с этой системой потока. Кроме того, долгосрочное исследование клеточного ответа может быть более сложным и сложным, в основном за счет производительности насоса. Снижение вниз по течению сопротивление является важным для поддержания целостности системы потока и эффективности накачки. Наконец, вышеупомянутая система использует стеклянные слайды и поликарбонатные мембраны, которые не физиологически смоделировать сосудистую, и не считают механическая сигнализация результате артериальной участке или базальной мембраны жесткости. Ранее, в одном исследовании использовал систему ударные, способный воспроизводить ударные потока с помощью шприца насосы 1 2. Эффективность системы в предстoducing высокий PI могут быть затронуты ограничениями на скорость насоса и уплотнения. Способ демпфирования камеру дополнительно упрощается при его применении, не требующий программирования насоса. Будущие приложения системы потока позволит механической сигнализации в результате артериальной участке путем введения упругого трубки для замены проточную камеру и слайд. Благодаря этому улучшению, несоответствие соблюдение и поверхности просвета разрывы могут быть дополнительно изучены.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы выразить признательность источников финансирования, в том числе AHA (13GRNT16990019 для WT) и NHLBI (HL097246 и HL119371 к WT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 34850 | |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Glass Slide (70 mm x 50 mm) | Sigma-Aldrich | CLS294775X50 | |
| Polycarbonate Membrane | Millipore Corp. | HTTP09030 | |
| Silicone Gasket | Grace Bio-Labs | RD 475464 | |
| Fibronectin (25 μg/ml) | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Collagen Type-I | Sigma-Aldrich | C3867 | |
| NaHCO3 | Fluka | 36486 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Damping Chamber | This chamber is custom made, and may be requested using the engineering drawing of Figure 3. | ||
| Blood Pump | Harvard Apparatus | 529552 | |
| Poly-Vinyl Carbonate Tubing | US Plastic | 65066, 65063, 65062 | Various sizes may be required |
| Luer Connections | Nordson Medical | Various | Various sizes will be required, and a number of parts should be purchased for replacement use. |
| Culture Chamber | Machined in-house | Custom | Acrylic may be purchased in sheets and machined for intended use. The engineering drawing shown in Figure 2 may be used to recreate this chamber. |
| Square Petri Dish | Cole-Parmer | EW-14007-10 | |
| Glass Slide Holder | Capitol Scientific | WHE-900303 | |
| Fetal Bovine Serum | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Flow Meter | Sonotec, GmbH | Sonoflow co.55/060 | |
| Sylgard Elastomer Kit | Sigma-Aldrich | 761036-5EA | |
| 14 G Steel Cannula | General Laboratory Supply | S8365-1 |
References
- Scott-Drechsel, D., Su, Z., Hunter, K., Li, M., Shandas, R., Tan, W. A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves. Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).
- Tan, Y., et al. Stiffening-Induced High Pulsatility Flow Activates Endothelial Inflammation via a TLR2/NF-κB Pathway. PLoS ONE. 9 (7), e102195 (2014).
- Wexler, L., et al. Coronary Artery Calcification: Pathophysiology, Epidemiology, Imaging Methods, and Clinical Implications A Statement for Health Professionals From the American Heart Association. Circulation. 94 (5), 1175-1192 (1996).
- Lan, T. -H., Huang, X. -Q., Tan, H. -M.
- Lee, C. H., et al. Promoting endothelial recovery and reducing neointimal hyperplasia using sequential-like release of acetylsalicylic acid and paclitaxel-loaded biodegradable stents. Int J Nanomedicine. 9, 4117-4133 (2014).
- Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. Vascular Remodeling in Hypertension Roles of Apoptosis Inflammation, and Fibrosis. Hypertension. 38 (3), 581-587 (2001).
- Greil, O., et al. Changes in carotid artery flow velocities after stent implantation: a fluid dynamics study with laser Doppler anemometry. J Endovasc Ther. 10 (2), 275-284 (2003).
- Egorova, A. D., van der Heiden, K., Poelmann, R. E., Hierck, B. P. Primary cilia as biomechanical sensors in regulating endothelial function. Differentiation. 83 (2), S56-S61 (2012).
- Liu, S. Q., Goldman, J. Role of blood shear stress in the regulation of vascular smooth muscle cell migration. IEEE T Bio-Med Eng. 48 (4), 474-483 (2001).
- Scott, D., Tan, Y., Shandas, R., Stenmark, K. R., Tan, W. High pulsatility flow stimulates smooth muscle cell hypertrophy and contractile protein expression. AJP: Lung C. 304 (1), L70-L81 (2013).
- Panaritis, V., et al. Pulsatility Index of Temporal and Renal Arteries as an Early Finding of Arteriopathy in Diabetic Patients. Ann Vasc Surg. 19 (1), 80-83 (2005).
- Miao, H., et al. Effects of Flow Patterns on the Localization and Expression of VE-Cadherin at Vascular Endothelial Cell Junctions: In vivo and in vitro Investigations. J Vasc Res. 42 (1), 77-89 (2005).
