Summary
Denne protokol replikater fysiologisk eller patologisk blodgennemstrømning in vitro for at hjælpe med at bestemme celle-respons ved sygdomstilstande patologier. Ved at indføre et tryk dæmpekammer nedstrøms for en blod pumpe, kan blodgennemstrømningen tværs vaskulaturen blive sammenfattet og pålægges et monolag af vaskulær endotel eller en mimetisk co-kultur.
Abstract
Vaskulær sygdom er en almindelig årsag til dødsfald i USA. Heri præsenterer vi en metode til at undersøge bidraget fra flow dynamik i retning af vaskulær sygdom patologier. Usunde arterier ofte til stede med væg afstivning, ardannelse, eller delvis stenose, som alle kan påvirke fluidstrømningshastigheder, og størrelsen af pulserende flow, eller pulsatility indeks. Replikation af forskellige strømningsforhold er resultatet af en tuning strømningstryk dæmpekammer nedstrøms for en blodpumpe. Indføring af luft i et lukket flow systemet giver mulighed for et sammentrykkeligt medium til at absorbere pulserende tryk fra pumpen og derfor variere i pulsatility index. Den heri beskrevne fremgangsmåde er simpelthen reproduceres, med meget styrbar input og let målelige resultater. Nogle begrænsninger er genskabelse af den komplekse fysiologiske puls bølgeform, som kun estimeres ved hjælp af systemet. Endotelceller, glatte muskelceller, fibroblaster og påvirkes af blodgennemstrømningen thrdybdegående arterien. Den dynamiske komponent i blodstrømmen bestemmes af minutvolumen og arteriel væg overholdelse. Vaskulær celle mekanisk-transduktion af flow dynamik kan udløse cytokinfrigivelse og krydstale mellem celletyper i arterien. Co-kultur af vaskulære celler er et mere nøjagtigt billede afspejler celle-celle interaktion på blodkarvæggen og vaskulær reaktion på mekanisk signalering. Bidrag strømningsdynamik, herunder cellens reaktion på de dynamiske og gennemsnit (eller stabil) komponenter af flow, er derfor en vigtig parameter ved bestemmelse sygdomspatologien og behandlingseffekt. Ved at indføre en in vitro co-kultur model og tryk dæmpning nedstrøms for blodpumpen som producerer simuleret minutvolumen, kan forskellige arteriel sygdom patologier undersøges.
Introduction
Sygelighed for hjerte-kar-sygdomme er den største i Amerika, med mange som følge af usund kar. Sunde arterier består af elastisk væv, med bløde luminale overflade belagt med et endotelcelle (EF) monolag. Arteriel flow kan modelleres som en oscillerende bølge funktion med positiv gennemsnitlig strømningshastighed. Den pulsatility index (PI) er kvotienten af oscillation størrelse og betyder flow (PI = (Max -. Min.) / Mean), 1 og er modelleret in vitro med variabel fartøj elasticitet 2 Arteriel elasticitet er vigtig i opbevaring af flow. energi fra hjertets sammentrækninger, dilatere under systolisk tryk, og spiller en væsentlig rolle i modulering blodgennemstrømningen PI. Fordi hjertet opretholder en ensartet, pulserende volumenstrøm, arteriel udvidelse øger tværsnitsareal, forbedre flow stabilitet ved at nedbringe strømningshastighed, forskydningsspænding, og PI. Hyppigt, usunde arterier tilstedeværende ændringer elasticiteteller overholdelse, viser afstivning fra vaskulær remodellering, arvæv eller forkalkning 3, 4. Derudover kan andre vaskulære lidelser, såsom neointimahyperplasi (NIH), 5 aneurisme og hypertension 6 og vaskulær fibrose 4, snøre kardiameter. Men nuværende medicinsk behandling og enhed behandling af vaskulære sygdomme ofte forsømmer betydningen af karvæggen compliance eller blod flow dynamik i vaskulær sygdom, der ofte kompliceres af ændringer i fartøj morfologi og egenskaber. Hverken ballonudvidelse eller stent besvare komplikation af muren elasticitet 7. Derfor in vitro modellering af blod strømme, som den arteriel sygdom og behandling er vigtig undersøgelse af sygdoms- patologier og fremtidige behandlingens effektivitet. Heri beskriver vi en fremgangsmåde til at replikere fysiologiske og patologiske blodgennemstrømning udformet til at bestemme celle respons i vaskulær sygdom Patholgier. Fluidstrømning forårsager forskydningsspænding på karvæggen, hvilket er en vigtig mekanisk signal i beholderen sundhed, påvirker alle celler i vaskulaturen. Adskillige mekaniske sensorer på det vaskulære endotel for fluid forskydning er blevet identificeret, herunder primære cilium vist i de seneste undersøgelser for endothelial mechanosensing 8. Endotelcelle aktivitet og morfologi påvirkes af strømningshastigheden, retning og Pulsatilitetsindeks. Derudover kan glatte muskelceller (SMC) migration blive påvirket af mekanisk-signaler med lav hastighed strømning gennem interstitiel væske 9, og kan også være gennem parakrin signalering fra endotelceller via deres reaktion på flow og mekanisk-transduktion af flow signaler via cytokin frigive 10. Den "dosis" afhængighed af den gennemsnitlige forskydning, PI og parakrin signalering kan også være indbyrdes afhængige. Med henblik herpå bestemmelse af vaskulær celle respons på væskeforskydning med varieret "dosering" i monolagskultureller co-kultur in vitro kunne give mekanistiske indsigt i vaskulær remodellering og forbedre sygdom og behandling forudsigelse. Strømmen, der anvendes i dette forsøg består af en blodpumpe, en opstrøms flow dæmpning luftbeholder, en nedstrøms flowmåler kun anvendes under forsøgsopstilling, en nedstrøms cellekultur, parallel-plade strømningskammeret og medier reservoir. Kontrol af vaskulære flow variabler såsom betyder strømningshastighed, slag i minuttet, og PI kan opnås ved at styre strømningshastigheden, pulsfrekvens, og indførelse af tryk dæmpning. Pulserende blod pumper kan leveres med variabel slaglængde deplacement på kontrolleret slag frekvens, der direkte vedrører betyde volumetriske strømningshastighed, og pulsfrekvens. Indførelse af en luft reservoir i strømningskredsløbet tillader trykket dæmpning, reducere strømning svingning størrelsesorden. Medier er en inkompressibel væske, medens luft i dæmpekammeret er komprimerbar, så overtryk fra strømmen bølge at væreabsorberes af luft kompression. Luften medier forholdet muliggør kontrol over, hvor meget dæmpning forekommer. En brugerdefineret cellekultur flow kammer 75 mm i længden med 50 mm i bredden blev skabt af akryl. Flow kommer ind gennem indløbsporten, og udvider gennem indsugningsmanifolden, giver ensartet strømning på tværs af hele det strømningskammeret. Lignende flow og strukturer er til stede ved kammerets udtag. Celler podes på funktionaliserede slides og efterfølgende fastgjort til strømningskammeret. Dette giver mulighed for store populationer, nemt hentes efter undersøgelsen. Co-kultur eksperimenter kan anvende en porøs polycarbonatmembran at fjerne celle-til-celle-kontakt mellem kulturer samtidig med at cytokin / flow transport. Dette system er tidligere blevet anvendt til at modellere høj PI flow og dens virkning på endotelmonolaget kultur og EF / SMC co-kultur 1, 10, for at undersøge celle respons på patologisk høj PI sygdom. Ved at beskrive den protokol, der bruges til at modellere disse flow conbetingelser, håber vi at hjælpe andre i fastlæggelsen strømningssignal bidrag til celle respons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. silanisering og biomolekyle Funktionalisering af dias eller polycarbonatmembran
Bemærk: Mange af de kemikalier og løsninger inden for denne protokol har høje fordampningshastigheder (ethanol (EtOH), acetone, etc.). Andre trin indebærer lange inkubationstider for lave fordampning satser. Anbefales paraffin film til at forsegle beholdere. Advarsel: Mange af de kemikalier (herunder: svovlsyre, acetone, (3-aminopropyl) triethoxysilan, glutaraldehyd, EtOH) anses for farligt, eller svingende. Konsultere sikkerhedsdatablad (MSDS) for hvert materiale for korrekt opbevaring, håndtering og bortskaffelse før brug.
- Placer nyt objektglas måler 75 mm x 50 mm med 1 mm, i rent, objektglas farvning fad uden hensyn til orientering, sikre fuld nedsænkning. Brug beholder til trin 1.1-1.12.
Bemærk: co-kultur, omfatter polycarbonat (PC) membran med 0,4 mikron porestørrelse, tilskåret på 75 mm med 50 mm, til alle efterfølgende steps til PC funktionalisering og EF såning. - Fordyb dias i svovlsyre (20%), O / N.
Forsigtig: Se sikkerhedsdatablad for svovlsyre før brug. - Vask slide ved nedsænkning i deioniseret vand (DI) i 5 minutter, tre gange, skiftende DI hver gang.
- Fordybe slide i acetone i 30 min.
Forsigtig: Se sikkerhedsdatablad til acetone før brug. - Fordybe slide i 6% (3-aminopropyl) triethoxysilan / acetoneopløsning O / N.
Forsigtig: Consult MSDS for (3-aminopropyl) triethoxysilan og acetone før brug. - Fordybe slide i acetone i 5 minutter, tre gange, skiftende acetone hver gang.
Forsigtig: Se sikkerhedsdatablad til acetone før brug. - Vask slide ved neddypning i DI i 5 minutter, tre gange, skiftende DI hver gang.
- Fordyb dias i 1,5% glutaraldehyd / DI løsning i 60 min.
Forsigtig: Se sikkerhedsdatablad for glutaraldehyd før brug. - Vask slide ved neddypning i DI i 5 minutter, to gange, skiftende DI hver gang.
- Placer diass i 70% ethanol (EtOH) i 30 minutter i sterile, laminær strømning.
- Fjern EtOH og tillade tilbageværende remanens fordampe. Fordyb dias i steril DI og afløb for at rehydrere dias.
Bemærk: Slides eller PC membran kan forsegles i objektglas holderen og opbevaret ved 4 ° C op til en uge. Ved anvendelse til celledyrkning, skal du gentage trin 1.10 og 1.11. - Fjern dias fra slide holderen og læg det i en 100 mm x 100 mm kvadratisk petriskål i laminar flow hætte.
Bemærk: Denne beholder vil blive anvendt for alle resterende trin.- Forbered dias eller PC til endotelceller såning til monokultur eksperiment.
- Coat den funktionaliserede dias eller PC (trin 1.11) med 1 ml fibronectin-opløsning (25 ug / ml), på den ene side, som dækker det omtrentlige område udsættes for celledyrkningskamret.
- Inkuber dias eller PC i steril inkubator indstillet til 37 ° C i 1-2 timer.
- Efter inkubering aspireres den resterende opløsning ved hjælp af en glass aspirator pipette forbundet med en vakuumkilde.
Bemærk: Objektglassene kan nu opbevares O / N ved 4 ° C til fremtidig brug.
- Følg 1.12.2 trin kun for at forberede EF / SMC co-kultur. Forberede og frø glatte muskelceller (SMC) kultur for co-kultur eksperiment.
- Sted silikonepakning oven på slæden (trin 1.11), med dimensioner på 75 mm x 50 mm ydre diameter, indvendig diameter på 50 mm med 30 mm, tykkelse 0,5 mm, og perforeringer, der tilpasser med strømningskammeret vakuum.
- Forbered 1 ml SMC i 10% FBS / DMEM suspension. Neutralisere 1 ml opløsning af 2 mg / ml kollagen type I med 7% NaHCO3 og 0,1 M NaOH-opløsning til pH 7,4, og blandes med SMC suspension med den endelige celledensitet på 2 x 10 6 celler / ml.
- Spred SMC løsning inden pakning og inkuberes slides ved 37 ° C og 5% CO2 i 30 minutter.
- Efter inkubation dække objektglasset med 25 ml 0,1% føtalt bovint serum (FBS) blandet i Dulbeccos modificeredeEagle Medium (DMEM) i 72 timer.
- Forbered dias eller PC til endotelceller såning til monokultur eksperiment.
- Kultur endotelceller (EC'er) på objektglas / polycarbonatmembran.
- Seed 1 ml EC'er i 10% FBS / DMEM, med startkoncentration på 6,0 x 10 5 celler / ml, på fibronectin overflader af objektglas eller polycarbonat membran.
- Cellerne inkuberes i en inkubator ved 37 ° C, 5% CO2 og 10% FBS i 120 minutter.
- Dækslides indeholder celler med yderligere 10% FBS / DMEM, og anbring dem i inkubator i 37 ° C, 5% CO 2 O / N, indtil 70% -80% konfluente.
2. Bestemmelse af Fluid Viskositet og volumenstrøm
Bemærk: Roterende viskosimetre er følsomt udstyr og viskometer brugsanvisning bør høres, før kalibrering, nulstilling, eller udfører målinger.
- Bestem ønskede væske forskydning (τ) fra litteratur af forsøget målrettede kar.
- Measure 1% FBS / DMEM viskositet (μ), ved hjælp af en rotationsviskosimeter.
- Bestem kræves volumetriske strømningshastighed (Q) fra Poiseuille ligning:
,
hvor τ = væskeforskydning, μ = viskositet, Q = vol. strømningshastighed, w = kammeret bredde og h = kammer højde). - Indstil pumpen til strømningshastighed afledt i trin 2.3, og bruge for alle efterfølgende trin.
, 3. Bestemmelse af pulsatility Indeks
Bemærk: Alle forbindelsesporte i systemet skal forbindes med passende størrelse lock-ring-til-modhager, eller kvindelige luer-til-modhager forbindelser. Tilslutning PVC-slanger kan derefter tilsluttes barb fittings og fuldendes kredsløbet.
- Tilslut flow kredsløb som i figur 2, med dæmpekammer (figur 3) og ultralyd flowmeter i korrekt strømningsretningen.
Bemærk: Ultralydgennemstrømsmåler er et følsomt stykke udstyr, ogbrugervejledningen bør høres før brug. - Fyld strømningskredsløbet og reservoiret med DI-vand, ved at sikre reservoir udløbsrør (at pumpe) er nedsænket i reservoiret. Visualisere flow bølgeform ved hjælp af et flowmeter.
- Open air release ventil på dæmpekammeret at ændre væske / luft volumen-forholdet. Luk luft frigivelse ventil ved forskellige væske niveau intervaller og beregne pulsatility indeks (PI = (V Max - V Min) / V Mean) ved hjælp af flow bølgeform peak (V Max), trug (V min), og betyder (V Mean). Optag PI-værdier i notesbog.
- Mark resulterende væskeniveauet og PI på dæmpekammeret, ved hjælp af en filt spids, permanent fyldepen til fremtidig brug. Bestem ønskede PI niveauer fra patologi litteratur 11.
- Silicon Tube Formation- Valgfri, mere avanceret metode til at kontrollere pulsatility
- Bland silikoneelastomeren og base hærder ved forskellige forhold (fx en base-til-tværbinder forhold fra 10: 1 til 36: 1). til forskellige målrettede elasticitetsmoduler, som illustreret tidligere 2
- Fabrikere siliconeslanger ved gentagen dip-hærdningsprocessen, kort dyppe stålkanyle (14 g) i silikone præpolymerblanding med en forudbestemt bund-til-tværbinder forhold.
- Placer præpolymer-coatede kanyle i en ovn indstillet til 60 ° C i 4 timer for at hærde polymeren belægning på kanylen, der skifter retning i midten af hærdningsprocessen.
- Gentag dyppeprocessen med samme silikoneelastomer blandingen og sted tilbage i ovnen i yderligere 4 timer, hvilket resulterer i ~ 0,3 mm tykke rør.
- Fjern den ultratynde silikoneslange fra kanyle af rustfrit stål.
- Tilslut rør til at flyde kredsløb i stedet for dæmpekammeret, og test PI for hver som i 3.3.
4. Pumpe Sterilisation
- Fordybe strømningskammeret (figur 2), PVC slanger og pakninger i 10% hydrogenperoxid (H2O 2). Vask med sterilt DI før trin 4.
- Placer blodpumpen på en ekstra hylde inkubator.
Bemærk: inkubator hylder bør være af rustfrit stål, og være i stand til at bære vægten af hele strømningskredsløb. - Fyld strømningskredsløbet og reservoiret med 10% H 2 O 2 ved at sikre reservoir udløbsrør (at pumpe) er nedsænket i reservoiret. Cirkulere H 2 O 2 ved at pumpe gennem kredsløbet i 20 minutter i laminar flow hætte med UV-lys på.
- Aspirér al H2O 2 fra slanger og vask med sterilt PBS ved pumpning gennem strømningskredsløbet.
5. Flow Chamber Assembly
Bemærk: strømningskammeret består af en acryl, specialfremstillede plade, vakuumporte og indløb og udløb strømningsporte (se figur 2). Kammer samling består i at placere flowet kammeret og pakninger på toppen af kultur dias, proPerly linie, og er beskrevet nedenfor.
- Varm op 1% FBS / DMEM i en 37 ° C vandbad og forberede flow kammer.
- Tag EF glide ud af medier (fra trin 1.13) og sted pakning på toppen med celle opad.
- (Valgfrit) Tag PC-membran tør for medier (fra trin 1.13) og sted pakning på toppen med celle opad. Placer co-kultur slide med seedede SMC (trin 1.12.2) under PC-membran.
- Juster vakuum kanal i strømningskammeret med hullerne i pakningen (figur 2).
- Vedhæft vakuumrør til vakuumporte (Figur 2) sikrer ingen kilder lækager til vakuum.
- Sted polycarbonat ark nedenunder objektglas og klemmen strømningskammeret samling med fjederklemmer, en på hver side af strømningskammeret (figur 2 og 5).
- Sted flow-system i inkubator ved 37 ° C og 5% CO2, og fyld kredsløb med medier ved at pumpe fra fyldte reservoir ved lav Pulsatilitetsindeks.Oprethold denne strøm i 4 timer til forbehandling celler.
- Juster væske volumen i dæmpekammeret til markant PI niveau, og kultur for den ønskede tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Opretholdelse af strømningsforholdene er afhængig af korrekt samling af strømningskredsløbet (figur 1). Slangediameter er et vigtigt valg i montage, med større diametre reducerende strømningsmodstand og efterfølgende trykfald før og efter dyrkningskammeret. For at sikre beregnet tryk og strømningshastighed, samle systemet med flowmåler før eksperimentere med hensigten slange. Tilpasning af dyrkningskammeret vakuumkanal (figur 2), med perforeringer på silicium pakning (ikke afbildet), fastholder forsegle i strømningskredsløbet. For at sikre sæl, kan foråret klemmer bruges til at anvende yderligere pres på pakningen. Objektglas bør beskyttes med polycarbonat plader, skæres til at passe kammeret område (figur 6). Fordi strømningshastigheden desuden kan bidrage til komplikationer i at opretholde tætninger, kan mediet ændres ved tilsætning af dextran for at øge medie viskositet. Gennem øget Viscosity kan væskeforskydning opretholdes ved lavere hastighed. Reaktion og integritet kan kontrolleres i midten af eksperimentet blot ved at observere væskestand og fluid farve inden dæmpekammeret og reservoiret (figur 3). Væsken niveau bør opretholde en konstant værdi. Niveau indledende væske bør mærkes på både reservoir og dæmpning kammer til helbredsundersøgelse sammenligning. Justeringer kan foretages ved tilsætning af medier ved eksperimentet initiering eller tillader indgang af luft til dæmpekammeret. Figur 4 illustrerer en repræsentativ registrering af strømningshastighed. Phenol rødfarvning skulle falde i løbet af forsøget. Ved afslutningen af forsøget bør medier lov til at løbe fra kredsløbet, og opbevaret ved -80 ° C fryser for fremtidig foranstaltning eller anvendelse. Medier kan analyseres for metabolitter indhold eller frigivet cytokiner, eller anvendes til at overvåge parakrin signalering til cellulære responser ved at bruge den celle culture. Celler kan afbildes under fasekontrastmikroskopi for morfologi og konfluens (figur 5). Spindel morfologi observeres i EC'er efter HPF på over 24 timer (figur 7).
Figur 1. Flow kredsløb skematisk. Flowmåleren er mærket inden for ordningen bruges til at måle pulsatility indeks niveauer fastsat af dæmpekammeret. Flow bølgeform bør måles med beregnet tilslutning rørdiametre for at sikre systemets trykket forbliver fysiologisk. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Flow chamber design og målinger. Ydre kanal er forbundet med vakuum. Center-billede viser fastspænding af kammeret. Billedet til højre illustrerer pakning design. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Flow dæmpekammer. Flow dæmpekammer skematiske indikerer beregnet flow retning og tilslutning. Udluftningsventil åbnes, udløbsventilen er lukket, og fluid fylder kammeret til den ønskede PI niveau. Ved åbningen af udløbsventil og lukning af luft frigivelse ventil, flow genoptages og væskestande i kammeret fastholder niveauer. Klik her for at se en større version af dette tal. 
Figur 4. Prøve flow bølger med forskellige pulsatility indeks. High pulsatility Flow (Venstre) og Low pulsatility Flow (Højre). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Co-kultur Flow Skematisk. Co-kultur viser pulserende flow over endotelceller, med glatte muskelceller i kollagengel. Cytokin frigørelse fra celler kan krydse gennem den porøse polycarbonat membran. Venligstklik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Endothelial Cell Morfologi Ændringer med strømningsforholdene. Sammenflydende endothelcelle kultur på funktionaliserede polycarbonat membran. Vist er inden flow (venstre) og efter flow (til højre). Flow vises under forskellige betingelser, statisk (ingen hastighed), stabil (konstant hastighed), høj puls (høj pulsatility). Celler farvet med 2% krystalviolet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. GlatmuskelCell Protein Expression Ændringer med strømningsforholdene. Glatte muskelceller udtryk for α-glatmuskelactin (SMA) og myosin-tung kæde (SM-MHC) under forskellige betingelser, statisk (ingen velocity), lind strøm (konstant hastighed), og høj puls. Klik her for at se et større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til at reproducere pulserende flow in vitro, og kan være medvirkende første trin i bestemmelsen bidrag strømningsforhold til sygdom patologier. Tidligere undersøgelser ved hjælp af denne protokol har fundet strømningsforhold bidrager til vaskulær inflammatorisk reaktion. 1, 10 Desuden er denne protokol er beregnet til erfarne laboratorier. Som sådan, hverken i dybden fluidmekanik, eller biokemisk analyse er beskrevet heri. For mere avancerede fluid dynamik, 1 og avancerede teknikker, konsultere litteraturen 2 Kritisk i dyrkning af celler under væske forskydning over længere perioder er:. 1) opretholde en forseglet flow kredsløb, undtagen reservoiret, og 2) at forhindre forurening hele eksperimentet. Er afgørende for opretholdelsen af medier volumen og korrekte PI niveauer, med indførelsen af utilsigtet luft påvirker de ønskede flow parametre tætning af flow kredsløb. Yderligere luft i systemet maj partially hindre strømmen i åen, forstyrrer strømningsbane og forbedre overholdelsen af det samlede system. Mens volumetriske strømningshastigheder vil blive opretholdt, nedsat tværsnitsareal fra dette delvis blokering vil føre til lokaliserede stigninger i hastighed og fladediskontinuiteter. Både variation strømningshastighed og overfladediskontinuiteter vil bidrage til at flyde destabilisering, og muligvis turbulens. Endelig ville enhver fanget luft ind i tryk strømningssystem fungere som en sammentrykkelig dæmpning af strømmen og dermed mindske PI fra dens ønskede niveau. Som strømningskredsløbet er konstant volumen, fanget luft også vil medføre lækage af medier, der kan have en negativ indvirkning celler, stigende metabolitkoncentrationen over tid. Blodpumpen forsegling og funktion er afhængig af temperaturen, således placeringen af pumpen i inkubatoren kan indføre tætningsprodukter komplikationer. Både forøget tilstedeværelse af luft i strømningskredsløbet og tab af medier ved pumpen forsegling eller funktionsfejltion kunne øge variationen af cellen miljøet, og føre til unøjagtige resultater. Forebyggelse af forurening under eksperimentet er vigtig i al cellekultur. Forsegling af strømningskredsløbet skal igen understreges at forhindre kontaminering samt. Flow medier giver mange af de næringsstoffer og sukker, der er nødvendige for mikroorganisme vækst, derfor rengøring af kredsløbet straks efter brug er nødvendig. Derudover et uigennemsigtigt pumpedækslet, reducerer effektiviteten af UV-stråling i sterilisering af den samlede pumpe. Dette, kombineret med uforeneligheden af akryl stempel med ethanol, kræver fuld sterilisation af kredsløbet ved hjælp af hydrogenperoxid (H 2 O 2). Forebyggelse af væksten forurening, når systemet ikke er i brug, anvendelse af steriliserende opløsning, og opretholde et sterilt miljø alle kan indføre komplikationer enten ved at tillade forurening eller sterilisering cellekultur. Begrænsninger af denne teknik indbefatter den manglende evne til korrektly modellere komplekse flow bølge i fysiologisk blodgennemstrømning. Mens flow-systemet tilbyder en tæt tilnærmelse, kan forskellige aspekter af det komplekse bølgeform ses i fysiologisk flow ikke styres eller ændres. Også vende forskydningsspænding i frem- og tilbagegående flow er en komplikation ses i nogle arteriesygdom, og kan ikke ad replikeres med denne strøm system. Derudover kunne langtidsundersøgelse af celle-respons være mere kompliceret og udfordrende, primært som følge af pumpens ydelse. Reducere nedstrøms resistens er vigtigt at opretholde integriteten af strømningssystem og pumpeeffekten. Endelig det ovenfor beskrevne system anvender objektglas og polycarbonatmembraner, som ikke fysiologisk modellerer vaskulaturen, og ikke tager hensyn mekanisk signalering følge af arteriel stretch eller basalmembran stivhed. Tidligere har en undersøgelse anvendes en pulserende der er i stand til at gengive pulserende flow ved hjælp sprøjtepumper 1 2. Systemets effektivitet i Reproducing den høje PI kunne blive påvirket af begrænsninger i pumpens hastighed og forsegling. Metoden til dæmpekammeret er desuden enklere i sin ansøgning, der ikke kræver pumpe programmering. Fremtidige anvendelser af flow system vil gøre det muligt for mekanisk signalering som følge af arteriel stretch ved inkorporering af elastisk slange til at erstatte strømningskammeret og glide. Gennem denne forbedring kan uoverensstemmende overholdelse og luminale overfladediskontinuiteter yderligere undersøgt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at anerkende finansieringskilder, herunder AHA (13GRNT16990019 til WT) og NHLBI (HL097246 og HL119371 til WT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 34850 | |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Glass Slide (70 mm x 50 mm) | Sigma-Aldrich | CLS294775X50 | |
| Polycarbonate Membrane | Millipore Corp. | HTTP09030 | |
| Silicone Gasket | Grace Bio-Labs | RD 475464 | |
| Fibronectin (25 μg/ml) | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Collagen Type-I | Sigma-Aldrich | C3867 | |
| NaHCO3 | Fluka | 36486 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Damping Chamber | This chamber is custom made, and may be requested using the engineering drawing of Figure 3. | ||
| Blood Pump | Harvard Apparatus | 529552 | |
| Poly-Vinyl Carbonate Tubing | US Plastic | 65066, 65063, 65062 | Various sizes may be required |
| Luer Connections | Nordson Medical | Various | Various sizes will be required, and a number of parts should be purchased for replacement use. |
| Culture Chamber | Machined in-house | Custom | Acrylic may be purchased in sheets and machined for intended use. The engineering drawing shown in Figure 2 may be used to recreate this chamber. |
| Square Petri Dish | Cole-Parmer | EW-14007-10 | |
| Glass Slide Holder | Capitol Scientific | WHE-900303 | |
| Fetal Bovine Serum | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Flow Meter | Sonotec, GmbH | Sonoflow co.55/060 | |
| Sylgard Elastomer Kit | Sigma-Aldrich | 761036-5EA | |
| 14 G Steel Cannula | General Laboratory Supply | S8365-1 |
References
- Scott-Drechsel, D., Su, Z., Hunter, K., Li, M., Shandas, R., Tan, W. A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves. Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).
- Tan, Y., et al. Stiffening-Induced High Pulsatility Flow Activates Endothelial Inflammation via a TLR2/NF-κB Pathway. PLoS ONE. 9 (7), e102195 (2014).
- Wexler, L., et al. Coronary Artery Calcification: Pathophysiology, Epidemiology, Imaging Methods, and Clinical Implications A Statement for Health Professionals From the American Heart Association. Circulation. 94 (5), 1175-1192 (1996).
- Lan, T. -H., Huang, X. -Q., Tan, H. -M.
- Lee, C. H., et al. Promoting endothelial recovery and reducing neointimal hyperplasia using sequential-like release of acetylsalicylic acid and paclitaxel-loaded biodegradable stents. Int J Nanomedicine. 9, 4117-4133 (2014).
- Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. Vascular Remodeling in Hypertension Roles of Apoptosis Inflammation, and Fibrosis. Hypertension. 38 (3), 581-587 (2001).
- Greil, O., et al. Changes in carotid artery flow velocities after stent implantation: a fluid dynamics study with laser Doppler anemometry. J Endovasc Ther. 10 (2), 275-284 (2003).
- Egorova, A. D., van der Heiden, K., Poelmann, R. E., Hierck, B. P. Primary cilia as biomechanical sensors in regulating endothelial function. Differentiation. 83 (2), S56-S61 (2012).
- Liu, S. Q., Goldman, J. Role of blood shear stress in the regulation of vascular smooth muscle cell migration. IEEE T Bio-Med Eng. 48 (4), 474-483 (2001).
- Scott, D., Tan, Y., Shandas, R., Stenmark, K. R., Tan, W. High pulsatility flow stimulates smooth muscle cell hypertrophy and contractile protein expression. AJP: Lung C. 304 (1), L70-L81 (2013).
- Panaritis, V., et al. Pulsatility Index of Temporal and Renal Arteries as an Early Finding of Arteriopathy in Diabetic Patients. Ann Vasc Surg. 19 (1), 80-83 (2005).
- Miao, H., et al. Effects of Flow Patterns on the Localization and Expression of VE-Cadherin at Vascular Endothelial Cell Junctions: In vivo and in vitro Investigations. J Vasc Res. 42 (1), 77-89 (2005).
