Summary
Bu protokol, hastalık patolojilerinde hücre yanıtını belirlenmesinde yardımcı olmak için, in vitro olarak fizyolojik veya patolojik kan akışını çoğaltır. Kan pompası alt bölmeyi sönümleme bir basınç katılmasıyla, damar boyunca kan akımı değinmeyecek edilebilir ve vasküler endotelyum, ya da taklit eden ko-kültür, bir tek tabaka üzerine koydu.
Abstract
Vasküler hastalık Amerika Birleşik Devletleri içinde ölüm yaygın bir nedenidir. Bu yazıda, damar hastalığı patolojileri doğru akış dinamikleri katkısını incelemek için bir yöntem mevcut. Duvar sertleşme, yara izi veya tüm sıvı akış oranlarını etkileyebilir kısmi stenoz ve pulsatil akım büyüklüğü, ya da pulsatilite indeksi ile sıklıkla Sağlıksız arterler. Çeşitli akış koşullarının çoğaltma kan pompasının alt bölmeyi sönümleme akış basıncını ayarlama sonucudur. Sıkıştırılabilir ortamı pompasından pulsatil basıncı emmek ve bu nedenle pulsatilite indeksi değişir için kapalı bir akış sistemi içinde hava giriş sağlar. Burada açıklanan yöntemi sadece çok kontrollü giriş ve kolayca ölçülebilir sonuçlar, yeniden üretilir. Bazı sınırlamalar ancak sistem tarafından yaklaşılır karmaşık fizyolojik nabız dalga, rekreasyon vardır. Endotel hücreleri, düz kas hücreleri, fibroblastlar, kan akışı ve thr etkilenirarteri ough. Kan akımının dinamik bileşen kalp debisi ve arter duvarı uyumu ile belirlenir. Akış dinamikleri vasküler hücre mekano-transdüksiyon sitokin salınmasını ve arter içinde hücre tipleri arasında çapraz-tetikleyebilir. Vasküler hücrelerde ko-kültür damar duvarında ve mekanik sinyal vasküler tepkisi üzerinde daha doğru bir resim yansıtan hücre-hücre etkileşim. Akışın dinamik ve ortalama (ya da sabit) bileşenlerine hücre tepkisinin de dahil olmak üzere akış dinamikleri, katkısı, bu nedenle hastalığın patoloji ve tedavi etkinliğini belirleyen önemli bir ölçümdür. Bir in vitro ko-kültür yerine getirilmiştir ve basınç simüle kardiyak çıktı üretir kan pompası alt süspansiyon ile, çeşitli patolojiler arter hastalığı araştırılabilir.
Introduction
Kardiyovasküler hastalıklar için morbidite oranları birçok sağlıksız damar sonuçlanan, Amerika'daki en büyük bulunmaktadır. Sağlıklı arterler bir endotel hücre (AK) tek tabaka ile kaplanmış yumuşak lümen yüzeyi ile, elastik doku oluşur. Arter akışı pozitif ortalama debi ile salınan bir dalga fonksiyonu olarak modellenmiştir olabilir. Pulsatilite indeksi (PI) salınım büyüklüğü bölüm ve ortalama debi (.. PI = (Max - Min) / Ortalama) ise, 1 ve değişken damar elastikiyeti ile in vitro modellenmiştir 2 Arter elastikiyet akışının depolanması önemlidir. Kalp kasılmaları enerji, sistolik basınç altında dilate ve kan akımı PI modüle önemli bir rol oynamaktadır. Kalp tutarlı olarak, belirli aralıklarla, hacimsel akışı muhafaza için, arteryel genleşme akım hızı, kesme stresi ve PI azaltarak akış stabilitesinin arttırılması, enine kesit alanını arttırmaktadır. Elastikiyet Sıklıkla sağlıksız arterler mevcut değişikliklerya da uyum vasküler yeniden, skar dokusu veya kireçlenme 3, 4 sertleşme görüntüleniyor. Ek olarak, neointimal hiperplazi (NIH), 5 anevrizma ve hipertansiyon 6 ve vasküler fibrozların 4 gibi diğer damar hastalıkları, damar çapı daraltır olabilir. Ancak, mevcut ilaç tedavisi ve damar hastalıkları cihaz tedavisi genellikle sık sık damar morfolojisi ve özelliklerinde değişiklikler karmaşık bir damar hastalığında damar duvarı uyum veya kan akış dinamikleri önemini ihmal. Ne balon anjiyoplasti stent ne duvar elastisite 7 komplikasyon cevap. Bu nedenle, kan in vitro model arter hastalığı ve işlemlerin sonucu olan akımlarının hastalığı patolojileri ve tedavisinde gelecek etkisini araştıran önemlidir. Burada, damar hastalığı Pathol hücre yanıtını belirlemek için tasarlanmıştır fizyolojik ve patolojik kan akışını kopyalayan bir yöntem tariftakımının kontrolü. Sıvı akışı damar tüm hücreleri etkileyen damar sağlığında önemli bir mekanik sinyal olan damar duvarının kayma strese neden olur. Sıvı kesme için vasküler endotel üzerinde çeşitli mekanik algılayıcılar endotel 8 mechanosensing için son çalışmalarda gösterilmiştir birincil cilium dahil, tespit edilmiştir. Endotel hücre aktivitesi ve morfolojisi akış hızı, yönü ve pulsatilitesini etkilenir. Ek olarak, yumuşak kas hücresi (SMC) göçü interstisyel sıvı ile 9 arasındaki düşük hızlı akış mekano-sinyaller etkilenebilir ve akış ve sitokin ile akış sinyallerinin mekano-transdüksiyon için kendi yanıt verme yoluyla endotel hücrelerinden parakrin sinyali yoluyla olabilir 10 yayınlayacak. Ortalama kesme, PI ve parakrin sinyal iletiminin "dozu" bağımlılık da birbirine olabilir. Tek tabakalı kültürü bu amaçla, çeşitli "doz" ile sıvı kesmeye vasküler hücre yanıtının belirlenmesi içinya da in vitro ko-kültür vasküler yeniden içine mekanistik anlayış sağlamak ve hastalık ve tedavi tahmini artırabilirsiniz. Bu deneyde kullanılan akış sistemi, bir kan pompası, bir yukarı akış sönümleme hava haznesi sadece deney düzeneği, bir alt hücre kültürü, paralel plaka akış odası ve ortam haznesi sırasında kullanılan bir alt-akış ölçer oluşur. Akış hızı anlamına gibi damar akım değişkenlerin kontrol dakikadaki vuruş ve PI kontrol akış hızı, darbe frekans ve basıncının esas olarak söndürme yoluyla elde edilebilir. Pulsatif kan pompalar hacimsel akış hızı ve nabız frekansı ortalama doğrudan ilgili, kontrollü inme frekansında, değişken strok deplasman mevcuttur. Akım devresi içinde bir hava rezervuarının giriş akışı salınım büyüklüğünü azaltarak, basınç sönümleme sağlar. Sönümleme odasının içindeki hava olması akış dalga aşırı basınç sağlayan, sıkıştırılabilir ise medya, sıkışmaz bir sıvıdırHava sıkıştırma tarafından emilir. Medya oranı hava çok damping nasıl oluştuğu üzerinde kontrol sağlar. Genişliğinde 50 mm uzunluğunda 75 mm Özel bir hücre kültürü akış odası akrilik oluşturuldu. Akış giriş deliğinden girer, ve akış odasının tamamen tutarlı akış sağlayan, giriş manifoldu boyunca genişler. Benzer akışı ve yapılar odası çıkışında bulunmaktadır. Hücreler, işlevselleştirilmiş slaytlar üzerine ekilmiş ve daha sonra akış odasına bağlıdır. Bu kolayca çalışma sonrasında alınan büyük nüfus için izin verir. Ortak kültür deneyleri sitokin / akım taşıma izin verirken kültürleri arasında, hücre-hücre teması ortadan kaldırmak için, gözenekli bir polikarbonat membran kullanılabilir. Bu sistem daha önce yüksek PI akışı ve endotel tek tabaka kültürü ve EC / SMC ko-kültür 1, 10 üzerindeki etkisini modellemek için hücre yanıtı için patolojik yüksek PI hastalığı araştırmak için kullanılır olmuştur. Bu akış con modellemek için kullanılan protokol anlataraketkiler cihazın, biz yanıtı hücre akım sinyali katkısını belirlemek başkalarına yardım etmek istiyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Silanizasyon ve Slide biyomoleküler Functionalization veya Polikarbonat Membran
Not: Bu protokol kapsamında kimyasalların ve çözümleri çoğu yüksek buharlaşma oranları (etanol (EtOH), aseton, vb) var. Diğer adımlar düşük buharlaşma oranları için uzun inkübasyon süreleri gerektirir. Parafin Film kapları mühür önerilir. Dikkat: (içerir: sülfürik asit, aseton, (3-aminopropil) trietoksisilan, glutaraldehid, EtOH) bulunan kimyasalların bir çoğu tehlikeli ya da uçucu kabul edilir. Kullanmadan önce uygun depolama, taşıma ve bertaraf için her malzemenin malzeme güvenlik bilgi formu (MSDS) başvurun.
- Tam daldırma sağlanması yönüne bakılmaksızın temiz, cam slayt boyama çanak 1 mm 50 mm 75 mm ölçülerindeki yeni cam slayt, yerleştirin. Adımlarla 1,1-1,12 için kap kullanın.
Not: Tüm takip eden ste için, 50 mm 75 mm boyutlarında kesilir 0,4 mikron gözenek boyutu ile ko-kültür için polikarbonat dahil (PC) zarPC işlevsellik ve AK tohumlama için PS. - Sülfürik asit (% 20), O / N slayt bırakın.
Dikkat: Kullanmadan önce sülfürik asit için MSDS danışın. - , 5 dakikada, üç kez iyonu giderilmiş su içinde (DI) daldırma her DI değiştirerek slayt yıkayın.
- 30 dakika boyunca aseton içinde slayt bırakın.
Dikkat: Kullanmadan önce aseton MSDS'ye danışın. - % 6 (3-aminopropil) trietoksisilan / aseton çözeltisi O / N slayt bırakın.
Dikkat: Kullanmadan önce (3-aminopropil) trietoksisilan ve aseton için MSDS danışın. - Aseton her zaman değişen, 5 dakika, üç kez aseton slayt daldırın.
Dikkat: Kullanmadan önce aseton MSDS'ye danışın. - 5 dakika, üç kez DI daldırma her zaman DI değiştirerek slayt yıkayın.
- 60 dakika boyunca% 1.5 glutaraldehid / DI çözeltide slayt daldırın.
Dikkat: Kullanmadan önce glutaraldehit için MSDS danışın. - 5 dakika, iki kez DI daldırma her zaman DI değiştirerek slayt yıkayın.
- Yer slaytSteril, laminar akış başlığı içinde 30 dakika boyunca% 70 etanol (EtOH) içinde s.
- EtOH çıkarın ve buharlaştırılması için bir tortu geri kalan izin verir. Slaytlar rehydrate amacıyla steril DI ve drenaj slaytlar bırakın.
Not: Slaytlar veya PC zar bir haftaya kadar 4 ° C'de cam slayt tutucu mühürlü ve saklanabilir. Hücre kültürü için kullanılması üzerine, tekrar 1.10 ve 1.11 adımları. - Slayt tutucudan slayt çıkarın ve laminer akış kaputu 100 mm kare petri tarafından 100 mm içine yerleştirin.
Not: Bu kap, kalan tüm adımlar için kullanılacaktır.- Monokültür deney için endotel hücre tohumlama için slayt veya PC hazırlayın.
- Coat fonksiyonalize kayar ya da PC, bir tarafta 1 mi fibronektin çözeltisi (25 ug / ml) ile (aşama 1,11), hücre kültür odası maruz yaklaşık alanı kapsayan.
- 1-2 saat boyunca 37 ° C'ye ayarlanmış, steril inkübatör slaytlar veya PC inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra, GLA kullanarak kalan çözelti aspireBir vakum bağlı ss aspiratör pipet.
Not: Slaytlar hemen ileride kullanılmak üzere 4 ° C sıcaklıkta O / N depolanabilir.
- Sadece EC / SMC ko-kültür hazırlanması için 1.12.2 adımları izleyin. Hazırlama ve ortak kültürlenme deney için yumuşak kas hücresi (SMC) kültür tohum.
- Akış odası, vakum ile uyum 50 mm dış çaplı, 30 mm, 50 mm iç çapı, 0.5 mm kalınlığında 75 mm boyutlarında, ve delikleri olan sürgünün (aşama 1,11) üstünde yer silikon conta.
- % 10 FBS / DMEM süspansiyon içinde 1 mi SMC hazırlayın. 7,% NaHCO 3 ve 7.4 arasında pH 0.1 M NaOH çözeltisi ile 2 mg / ml kolajen tip-I 1 ml solüsyon nötralize ve 2 x 10 6 hücre / ml nihai hücre yoğunluğu ile SMC süspansiyonu ile karıştırılır.
- Conta içindeki SMC çözeltisi yayılır ve 30 dakika boyunca CO2 37 ° C'de inkübe slaytlar ve% 5.
- Kuluçkadan sonra, Modifiye Dulbecco karıştırılır, 25 ml% 0.1 fetal sığır serumu (FBS) ile birlikte slayt kapağı72 saat süre ile Eagle Ortamı (DMEM).
- Monokültür deney için endotel hücre tohumlama için slayt veya PC hazırlayın.
- Cam slayt / polikarbonat membran üzerine Kültür endotel hücreleri (EC).
- Tohum cam slayt veya polikarbonat membran fibronektin yüzeylerinde 6,0 x 10 5 hücre / ml başlangıç konsantrasyonunda,% 10 FBS / DMEM içerisinde 1 ml EC.
- 37 ° C'de,% 5 CO2 'de bir kuluçka hücreleri inkübe ve% 10 FBS 120 dakika karıştırıldı.
- 37 ° C kuluçka makinesi içinde ilave% 10 FBS / DMEM ile hücreleri ve yer ihtiva eden kapak slaytlar, 5% CO2 O / N, 70% -80% konfluent kadar.
Sıvı Viskozite ve hacimsel Akış Oranının Belirlenmesi 2.
Not: Döner viskometreler hassas ekipmanlar ve viskozimetre kullanım kılavuzu, kalibre sıfırlama ya da ölçümler gerçekleştirmeden önce danışılmalıdır.
- Denemenin hedeflenen damar literatürde istenen sıvı kesme (τ) belirleyin.
- KuvBir döner viskometre kullanılarak e,% 1 FBS / (μ) DMEM viskozitesi.
- Poiseuille denklemi gerekli hacimsel akış hızı (Q) belirleyin:
,
burada τ = sıvı kayma, μ = viskozite, Q = vol. akış hızı, w = bölme genişliği ve h = odası yükseklik). - Set pompa adımında 2.3 türetilmiş akış hızı ve sonraki tüm adımlar için kullanın.
, Pulsatilite İndeksi 3. Belirlenmesi
Not: Sistemin içindeki tüm bağlantı portları uygun büyüklükte kilit halkası to-barb veya dişi luer-to-barb bağlantıları ile bağlanmış olması gerekir. Bağlama PVC boru daha sonra diken parçaları bağlanabilir ve devre tamamladı.
- Doğru akış yönünde bölme (Şekil 3) ve ultrasonik akış ölçer süspansiyon, Şekil 2'de olduğu gibi akım devresine bağlayın.
Ultrasonik debimetre ekipman hassas bir parçasıdır ve Not:Kullanım kılavuzu Kullanmadan önce danışılmalıdır. - Rezervuar hacmi içinde batık (pompa) rezervuar çıkış borusunu sağlayarak, DI su akış devresi ve haznesini doldurun. Bir akış ölçer kullanılarak akış dalga formu gözünüzde canlandırın.
- Sönümleme odasının açık hava tahliye valfi sıvı / hava hacmi oranını değiştirmek için. Kapat farklı sıvı seviyesi aralıklarında hava tahliye vanası ve hesaplamak pulsatilite indeksi (PI = (V Max - V Min) / V Ortalama) akış dalga tepe (V Max), çukur (V Min) kullanarak ve ortalama (V Ortalama). Notebook Tutanak PI değerleri.
- Mark ileride kullanmak üzere uçlu keçeyi, kalıcı mürekkep kalem kullanarak, sönümleme odasının sıvı seviyesini ve PI sonuçlanır. Patoloji literatüründe 11 istenen PI düzeylerinin belirlenmesi.
- Silikon Tüp Formation- İsteğe bağlı, kontrol pulsatilitesini daha gelişmiş bir yöntem
- Örneğin (a bas değişik oranlarda silikon elastomer tabanı ve kür ajanı karıştırın1 ila 36'dan: 10: e-to-çapraz bağlayıcı oranı. 1) değişik hedef elastik modülünün için, daha önce açıklandığı gibi 2
- Kısa bir süre önceden tespit edilmiş bir baz ile çapraz bağlayıcı oranına sahip silikon ön-polimer karışımı içine çelikten bir kanül (14 g), daldırma, tekrar daldırma tedavisi işlemi ile silikon tüp imal.
- Sertleştirme işlemi ortasında yön değiştirme, kanül polimer kaplamayı sertleştirmek üzere 4 saat boyunca 60 ° C'ye ayarlanmış bir fırın içine ön-polimer ile kaplanmış bir kanül yerleştirin.
- Aynı silikon elastomer karışımı ile daldırma işlemi tekrarlayın ve 0.3 ~ in mm kalınlığında borular sonuçları ek 4 saat, geri fırında koyun.
- Paslanmaz çelik kanül gelen ultra ince silikon tüp çıkarın.
- 3.3 Her yerine odasına sönümleme devresi ve test PI akış tüpleri bağlayın.
4. Pompa Sterilizasyon
- 1 akış bölmesini (Şekil 2), PVC boru ve contalar daldırın0% hidrojen peroksit (H2O 2). 4. adımda önce steril DI ile yıkayın.
- Yedek inkübatör rafta kan pompasını yerleştirin.
Not: Kuluçka raflar paslanmaz çelik olmalı ve tüm akım devresi ağırlığını taşıyabilecek gerekir. - Rezervuar hacmi içinde batık rezervuar çıkış borusu (pompa) sağlayarak% 10 H 2 O 2 ile akış devresi ve haznesini doldurun. UV ışığı ile laminer akış başlığı içinde 20 dakika boyunca devre üzerinden pompalanarak O 2 H 2 sirküle.
- Aspire Tüm H2O borudan 2 ve akım devresi üzerinden pompalanarak steril PBS ile yıkayın.
5. Akış Odası Meclisi
Not: Akış odacıklı vakum portu ve giriş ve çıkış akış bağlantı noktası (Şekil 2 ye bakınız) ile birlikte, bir akrilik, özel yapılmış levha oluşur. Chamber montaj kültür slaytlar üstüne akış odası ve contaları yerleştirme oluşur proPerly, hizalı ve aşağıda tarif edilmiştir.
- 37 ° C su banyosunda% 1 FBS / DMEM Isınma ve akış odası hazırlayın.
- Hücre tarafı yukarı üstünde ve yer conta (adım 1.13) medya üzerinden AK slayt atın.
- (İsteğe bağlı) medya üzerinden PC zarı atın hücre tarafı yukarı üstünde ve yer conta (adım 1.13). PC zarının altında seribaşı SMC (adım 1.12.2) ile birlikte kültür slayt yerleştirin.
- Conta deliklerden (Şekil 2) ile akış odasının vakum kanalını hizalayın.
- Vakum hiçbir ortam sızıntı sağlanması vakum portu (Şekil 2) Vakum tüp takın.
- Bahar kelepçeler, akış odasının her tarafında (Şekil 2 ve 5) üzerinde biriyle cam slayt ve kelepçe akış odası tertibatının altındaki yerleştirin polikarbonat levha.
- Talep akışı 37 ° C'de inkübatör içinde sistemi ve% 5 CO2 ve düşük pulsatilitesini doldurulur hazneden pompalayarak ortam ile devre doldurun.Hücrelerin önceden hazırlamak için 4 saat boyunca bu akış koruyun.
- İstediğiniz zaman sıvı belirgin PI seviyesine odasına sönümleme hacim ve kültür ayarlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Akış koşullarında Bakım akım devresi (Şekil 1) doğru montaj güvenmek durumundadır. Çapı Boru önce ve kültür odası sonra akış direncini ve sonraki basınç düşüşünü azaltarak büyük çaplarda mecliste önemli bir seçim vardır. Amaçlanan basınç ve akış hızı sağlamak için, amaçlanan boru ile deney öncesi akış ölçer ile sisteme monte edin. Silikon conta (resim mevcut değil) üzerinde delikli kültür odacıklı vakum kanalı (Şekil 2), hizalama, akım devresi içinde mühür tutar. Sızdırmazlık sağlamak için, bahar kelepçeler conta üzerinde ek bir baskı uygulamak için kullanılabilir. Cam slaytlar, polikarbonat tabakası tarafından korunmaktadır odası alanına (Şekil 6) uyacak şekilde kesilmesi gerekmektedir. Akış hızı ek muhafaza conta komplikasyonlara katkıda bulunabilir, çünkü ortam ortam viskozitesini arttırmak için dekstran ilave edilerek değiştirilebilir. Artan viscos yoluylaSığ, sıvı kayma düşük bir hızda muhafaza edilebilir. Sistem tepkisi ve bütünlük sadece sönümleme odası ve rezervuar (Şekil 3) içinde sıvı seviyeleri ve sıvı renk gözlemleyerek deneyde ortasında kontrol edilebilir. Sıvı seviyesi sabit değerini korumak gerekir. Başlangıç sıvı seviyesi rezervuar ve checkup karşılaştırma için odasına sönümleme hem işaretlenmiş olmalıdır. Ayarlamalar Deney başlatma ya da bölmeyi süspansiyon hava girişini sağlayan en ortam ilave edilerek yapılabilir. 4 akış hızı temsili bir kaydını tasvir etmektedir Şekil. Fenol kırmızı renklenme deney boyunca düşmelidir. Deneyin tamamlanması üzerine, ortam devre süzülmesine izin verilmelidir ve gelecekte ölçüm veya kullanımı için -80 ° C dondurucuda saklandı. Ortam metabolit içeriği için analiz veya sitokinler serbest ya da hücre kült için kullanarak hücresel yanıtlara parakrin sinyal izlenmesi için kullanılabilmektedirure. Hücreler, morfolojisi ve konfluent (Şekil 5) için faz kontrast mikroskobu altında görüntülenmiştir edilebilir. Morfoloji gibi mili 24 saat (Şekil 7) üzerinden HPF sonra EC görülmektedir.
Şekil 1. Akış devre şeması. Şeması içinde etiketli debimetre sönümleme odası tarafından belirlenen PI düzeylerini ölçmek için kullanılır. Akış dalga sistemi basıncı fizyolojik kalmasını sağlamak amacıyla bağlantı tüp çapları ile ölçülmelidir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Akış chamber tasarım ve ölçümler. Dış kanal vakum bağlanır. Merkezi resim odasının kenetlenmesini göstermektedir. Sağdaki resim conta tasarımı göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Akış Damping Odası. Akış sönümleme odası şematik akış yönü ve bağlantı amaçlanan gösterir. Hava tahliye vanası çıkış valfı kapatılır, açılır ve sıvı istenen PI seviyesine gözü doldurur. Çıkış valfi ve hava tahliye valfi, akış özgeçmiş ve oda seviyelerini korumaktadır içinde sıvı seviyeleri kapanış açılması üzerine. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. 
Şekil 4. Çeşitli pulsatilite indeksleri ile örnek akış dalgaları. Yüksek Pulsatilite Akışı (Sol) ve Alçak Pulsatilite Akışı (Sağ). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5.: Ortak-kültür Akış Şeması. Ortak kültür kollajen jel düz kas hücreleri ile endotelyal hücreleri üzerinde pulsatil akışını göstermektedir. Hücrelerden sitokin salınımı gözenekli polikarbonat zarından geçebilir. LütfenBu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 6. Akış Koşullarına Endotel Hücre Morfoloji Değişiklikleri. Fonksiyonlu polikarbonat membran üzerinde Confluent endotel hücre kültürü. (Solda) akış öncesi ve akış (sağda) sonra gösterilmiştir. Akış farklı koşullar, statik (hayır hız), sabit (sabit hız), yüksek nabız (yüksek pulsatilite) altında gösterilir. Hücreler% 2 kristal viyole ile boyandı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 7. Düz kasHücre Protein Expression Akış Koşullarına değiştirir. Farklı koşullar, statik (hayır hız), sabit akış (sabit hız) ve yüksek nabız altında α-düz kas aktini (SMA) ve miyozin ağır zincir (SM-MHC) ve düz kas hücreleri ifadesi. Bir büyük görmek için tıklayınız Bu rakamın sürümü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, in vitro pulsatil akışını taklit için bir yöntem tarif etmektedir ve hastalık patolojilerinde akış koşullarının etkilerini belirlenmesinde etkili ilk adım olabilir. Bu protokolü kullanarak önceki çalışmalar, bu protokol deneyimli laboratuarlar için tasarlanmıştır, akış koşullarının Ayrıca vasküler inflamatuar yanıt. 1, 10 katkıda bulunmuştur. Bunun gibi, ne de derinliği akışkanlar mekaniği, ne de biyokimyasal analizi tarif edilmektedir. Daha gelişmiş akışkan dinamiği, 1 ve ileri teknikler için, edebiyat danışın genişletilmiş dönemler boyunca sıvı kesme altında hücreleri kültür 2 Kritik:. 1), kapalı bir akım devresi korumak rezervuar hariç, ve 2) deney boyunca kirlenmeyi önlemek. Akım devresi sızdırmazlık istenen akış parametrelerini etkileyen istenmeyen hava tanıtımıyla, medya hacmi ve doğru PI düzeylerini korumak esastır. Sistem Mayıs p ek havaartially, dere içindeki akışını engelleyebilecek akış yolunu rahatsız ve genel sistem uyumunu artırmak. Hacimsel akış hızları tutulacak, lokalize hız artışları ve Yüzey kusurlarına yol açacak bu kısmi tıkanması kesit alanını azalmıştır. Akış hızı değişimi ve yüzey süreksizlikler Hem istikrarsızlığı akmasına katkıda ve muhtemelen türbülansa olacaktır. Son olarak, basınçlı akış sistemi içine sıkışan hava ve böylece arzu edilen seviyeden PI azalan akış sıkıştırılabilir sönümleme olarak hareket edecektir. Akış devresi sabit hacmi olduğu gibi, sıkışan havanın da zamanla metaboliti konsantrasyonunu artırarak, darbe hücrelerini olumsuz yönde olabilir medyanın sızmasına neden olur. Kan pompası sızdırmazlık ve fonksiyon dolayısıyla inkübatör pompa yerleştirme sızdırmazlık komplikasyonlara sebep olabilir, sıcaklık bağımlı bulunmaktadır. Pompa sızdırmazlık ya Malfunc içinden akış devresi ile ortam kaybı içindeki havanın iki artan varlığıyon hücresi ortamında değişkenliğini arttırmak ve yanlış sonuçlara yol açabilir. Deney sırasında kontaminasyon önlenmesi Tüm hücre kültürü içinde önemlidir. Akış devresinin Sızdırmazlık yine de kirleticilerin girişini önlemek için vurgulanmalıdır. Akış ortamı dolayısıyla kullanım gerekliyse hemen sonra devrenin temizlik, besin ve mikroorganizma büyümesi için gerekli şeker birçok sağlar. Ayrıca, opak pompa kapağı, genel pompanın sterilizasyon UV radyasyon etkinliğini azaltır. Bu etanol ile akrilik pistonun uyumsuzluk ile birlikte, devre kullanarak bir hidrojen peroksit tam sterilizasyon gerektiren (H2O 2). Sistem kullanımda değilken kirlenme büyüme önlenmesi, çözeltinin sterilize ve steril bir ortam, tüm kontaminasyon sağlayan veya hücre kültürü sterilize yoluyla komplikasyonlara sebep olabilir sürdürmenin kullanılması. Bu tekniğin Sınırlamalar doğru yetersizlik dahilly fizyolojik kan akımında karmaşık akış dalga modeli. Akış Sistemi yakın bir yaklaşım sunuyor olsa da, fizyolojik akışında görülen kompleks dalga farklı yönlerini kontrol edilen veya değiştirilemez. Ayrıca, akış pistonlu kayma stresi tersine bazı arter hastalığında görülen bir komplikasyondur ve bu akış sistemi ile çoğaltılmış olmayabilir tarafından. Buna ek olarak, hücre tepkisinin uzun dönemli bar çalışmada temel olarak pompasının performans, daha karmaşık ve zor olabilir. Alt direncini azaltmak akış sistemi ve pompalama verimi bütünlüğünü korumak için esastır. Son olarak, yukarıdaki sistem fizyolojik damarsal modeli yoktur ve arteriyel streç veya bazal membran sertliği kaynaklanan mekanik sinyalizasyon dikkate almaz cam slaytlar ve polikarbonat membranlar kullanır. Daha önce, bir çalışma şırınga kullanarak pulsatil akışını üretebilen bir pulsatil sistemini kullandı 1 2 pompalar. Repr sistemin etkinliğiyüksek PI oducing pompa hızı ve mühürleme sınırlamalar etkilenebilir. Odasını sönümleme yöntemi pompa programlama gerektirmeyen, kendi uygulamasında ayrıca basittir. Akış sisteminin gelecekteki uygulamaları akış odası ve slayt yerine elastik boru katılmasıyla arteriyel streç sonucu mekanik sinyalizasyon için izin verecek. Bu gelişme sayesinde, uyumsuz uyum ve lümen yüzey süreksizlikler daha incelenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar (WT HL097246 ve HL119371) AHA (WT 13GRNT16990019) ve NHLBI dahil finansman kaynakları, kabul etmek istiyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 34850 | |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Glass Slide (70 mm x 50 mm) | Sigma-Aldrich | CLS294775X50 | |
| Polycarbonate Membrane | Millipore Corp. | HTTP09030 | |
| Silicone Gasket | Grace Bio-Labs | RD 475464 | |
| Fibronectin (25 μg/ml) | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Collagen Type-I | Sigma-Aldrich | C3867 | |
| NaHCO3 | Fluka | 36486 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Damping Chamber | This chamber is custom made, and may be requested using the engineering drawing of Figure 3. | ||
| Blood Pump | Harvard Apparatus | 529552 | |
| Poly-Vinyl Carbonate Tubing | US Plastic | 65066, 65063, 65062 | Various sizes may be required |
| Luer Connections | Nordson Medical | Various | Various sizes will be required, and a number of parts should be purchased for replacement use. |
| Culture Chamber | Machined in-house | Custom | Acrylic may be purchased in sheets and machined for intended use. The engineering drawing shown in Figure 2 may be used to recreate this chamber. |
| Square Petri Dish | Cole-Parmer | EW-14007-10 | |
| Glass Slide Holder | Capitol Scientific | WHE-900303 | |
| Fetal Bovine Serum | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Flow Meter | Sonotec, GmbH | Sonoflow co.55/060 | |
| Sylgard Elastomer Kit | Sigma-Aldrich | 761036-5EA | |
| 14 G Steel Cannula | General Laboratory Supply | S8365-1 |
References
- Scott-Drechsel, D., Su, Z., Hunter, K., Li, M., Shandas, R., Tan, W. A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves. Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).
- Tan, Y., et al. Stiffening-Induced High Pulsatility Flow Activates Endothelial Inflammation via a TLR2/NF-κB Pathway. PLoS ONE. 9 (7), e102195 (2014).
- Wexler, L., et al. Coronary Artery Calcification: Pathophysiology, Epidemiology, Imaging Methods, and Clinical Implications A Statement for Health Professionals From the American Heart Association. Circulation. 94 (5), 1175-1192 (1996).
- Lan, T. -H., Huang, X. -Q., Tan, H. -M.
- Lee, C. H., et al. Promoting endothelial recovery and reducing neointimal hyperplasia using sequential-like release of acetylsalicylic acid and paclitaxel-loaded biodegradable stents. Int J Nanomedicine. 9, 4117-4133 (2014).
- Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. Vascular Remodeling in Hypertension Roles of Apoptosis Inflammation, and Fibrosis. Hypertension. 38 (3), 581-587 (2001).
- Greil, O., et al. Changes in carotid artery flow velocities after stent implantation: a fluid dynamics study with laser Doppler anemometry. J Endovasc Ther. 10 (2), 275-284 (2003).
- Egorova, A. D., van der Heiden, K., Poelmann, R. E., Hierck, B. P. Primary cilia as biomechanical sensors in regulating endothelial function. Differentiation. 83 (2), S56-S61 (2012).
- Liu, S. Q., Goldman, J. Role of blood shear stress in the regulation of vascular smooth muscle cell migration. IEEE T Bio-Med Eng. 48 (4), 474-483 (2001).
- Scott, D., Tan, Y., Shandas, R., Stenmark, K. R., Tan, W. High pulsatility flow stimulates smooth muscle cell hypertrophy and contractile protein expression. AJP: Lung C. 304 (1), L70-L81 (2013).
- Panaritis, V., et al. Pulsatility Index of Temporal and Renal Arteries as an Early Finding of Arteriopathy in Diabetic Patients. Ann Vasc Surg. 19 (1), 80-83 (2005).
- Miao, H., et al. Effects of Flow Patterns on the Localization and Expression of VE-Cadherin at Vascular Endothelial Cell Junctions: In vivo and in vitro Investigations. J Vasc Res. 42 (1), 77-89 (2005).
