Summary
이 프로토콜은 질환 병상의 세포 응답을 결정하는 데에 도움이 시험관 내에서 생리 학적 또는 병리학 적 혈류를 복제. 혈액 펌프의 하류 챔버 압력 감쇠를 도입하여, 맥관 걸쳐 혈류량 효과적으로 요약 될 수 있고, 혈관 내피 또는 유사체 공동 배양 단층 부과.
Abstract
혈관 질환은 미국 내 사망의 흔한 원인이다. 여기서, 우리는 혈관 질환의 병리 향해 유동 역학의 기여를 조사하는 방법을 제시한다. 보강 벽, 흉터, 또는 모든 유체의 유량에 영향을 미칠 수있는 부분 협착증 및 유량 맥동의 크기, 또는 박동성 지수 종종 본 해로운 동맥. 다양한 유동 조건의 복제는 혈액 펌프의 하류 챔버 댐핑 유동 압력 조정의 결과이다. 압축성 매체 펌프로부터의 압력 맥동을 흡수하므로 박동 지수를 변화시키기 위해 닫힌 유동 시스템 내에서 공기의 도입은 허용한다. 본원에 기술 된 방법은 매우 간단하게 제어 가능한 입력하고 쉽게 측정 결과와 함께 재생된다. 몇 가지 제한 사항은 시스템에 의해 근사 복잡한 생리 펄스 파형, 레크리에이션이다. 내피 세포, 평활근 세포, 섬유 아세포 및 혈류 THR 의해 영향동맥을 깨닫지 못하고 있거나 남의. 혈류의 다이내믹 성분은 심 박출량 및 동맥벽의 준수에 의해 결정된다. 유동 역학의 혈관 세포 - 기계 전달은 사이토 카인의 방출과 동맥 내 세포 유형 사이의 크로스 토크를 트리거 할 수 있습니다. 혈관 세포의 공 배양은 혈관벽과 혈관 기계적 시그널링 응답에 대한보다 정확한 그림 반사 세포 - 세포 상호 작용이다. 흐름의 동적 및 평균 (또는 정상) 성분 세포 반응을 포함 유동 역학의 기여는, 따라서 질병 병리 및 치료 효능을 결정하는 중요한 메트릭이다. 시험 관내 공동 배양 모델을 도입하고, 압력 모의 심 박출량을 생성 혈액 펌프의 하류 댐핑 통해, 각종 동맥 질환의 병리 상태를 조사 할 수있다.
Introduction
심혈관 질환의 이환율은 많은 사람들이 건강에 해로운 혈관의 결과로, 미국에서 가장 큰 있습니다. 건강한 동맥 내피 세포 (EC) 단일 층으로 코팅 된 소프트 내강 표면과, 탄성 조직으로 구성되어 있습니다. 동맥 흐름 긍정적 평균 유량을 갖는 진동 파 함수로서 모델링 될 수있다. 박동 지수 (PI)는 진동 크기의 몫과 평균 흐름 (.. (PI) = (최대 - 최소) / 평균)이며, 1 변수 혈관 탄성과 함께 체외에서 모델링 된 2 동맥의 탄력이 흐름의 저장에 중요하다. 심장 수축으로부터 에너지 수축기 압력으로 확장시키고,과 혈류를 PI 조절에 중요한 역할을한다. 심장 일관 박동성, 체적 유량을 유지하기 때문에, 동맥의 확장은 혈류 속도, 전단 응력, 및 PI의 흐름을 감소시킴으로써 안정성을 향상 단면적을 증가시킨다. 탄성에 자주, 건강에 해로운 동맥 본 변경또는 규정 준수, 혈관 재, 흉터 조직 또는 석회화 3, 4에서 보강 표시. 또한, 이러한 신생 내막 증식증 (NIH), 5 (6) 동맥류, 고혈압 및 혈관 섬유증 4와 같은 다른 혈관 질환은 혈관 직경을 수축 할 수있다. 그러나, 현재의 약물 치료 및 혈관 질환의 치료 장치들은 종종 용기의 형태 및 성질의 변화에 의해 복잡 혈관 질환에서 혈관 벽 컴플라이언스 또는 혈류 역학의 중요성을 무시. 어느 풍선 혈관 성형술이나 스텐트 벽 탄성 (7)의 합병증에 응답합니다. 따라서, 혈액의 체외 모델링 동맥 질환과 치료에 의한 흐름은 질병의 병리와 치료의 미래 효능을 조사하는 것이 중요하다. 여기서, 우리는 혈관 질환 pathol에서 세포 반응을 판정하기위한 생리 학적 및 병리학 적 혈류를 복제하는 방법을 서술프라 이즈. 유체 유동은 혈관 내의 모든 셀에 영향을주는, 혈관 건강에 중요한 기계적 신호 혈관벽에서 전단 응력을 야기한다. 유체 전단의 혈관 내피 세포에 여러 기계적 센서는 내피 8 mechanosensing에 대한 최근의 연구에서 보여 주 섬모를 포함, 확인되었습니다. 내피 세포 활성 및 형태는 유속, 방향 및 박동에 의해 영향을 받는다. 또한 평활근 세포 (SMC) 마이그레이션 간질 액 (9)을 통해 저속 유동 - 기계 신호에 의해 영향을받을 수 있고, 또한 유동 및 사이토킨 통해 유동 신호 - 기계 형질 그들의 응답을 통해 내피 세포로부터의 분비 신호를 통해 할 수있다 (10)를 놓습니다. 평균 전단, PI 및 분비 신호의 "용량"의존은 상호 의존적 일 수있다. 단층 문화에서이 끝, 다양한 "투여"와 유체 전단에 혈관 세포 반응의 결정에또는 생체 외에서 공동 배양은 혈관 재에 역학적 통찰력을 제공하고, 질병 및 치료의 예측을 개선 할 수있다. 이 실험에 사용 된 유동 시스템은 혈액 펌프, 상류 흐름 댐핑 공기 저장소 만 실험 장치, 하류 세포 배양, 평행 평판 유동 챔버, 및 미디어 저장 기 동안 사용 하류 유량계로 구성된다. , 유속 의미 같은 혈관 흐름의 제어 변수는 분당 비트 및 PI는 제어 유량, 펄스 주파수, 압력 도입 댐핑을 통해 달성 될 수있다. 박동성 혈액 펌프는 체적 유량, 및 펄스 주파수를 의미하는 직접 관련 제어 스트로크 주파수에서, 가변 스트로크 변위 가능하다. 흐름 회로 내의 공기 저장소의 도입 유량 진동 크기를 감소 압력 댐핑을 허용한다. 댐핑 챔버 내의 공기가 유동 될 파의 과도한 압력을 허용하면서 압축 가능 매체는 비압축성 유체압축 공기에 의해 흡수. 미디어 비율 공기는 많은 감쇠가 발생하는 방식을 제어 할 수 있습니다. 폭 50mm로 길이가 75mm 사용자 정의 세포 배양 흐름 챔버는 아크릴로 만들어졌습니다. 흐름은 유입구를 통해 유입 및 유동 챔버의 전체에 걸쳐 일관된 유동을 제공하는 입구 매니 폴드를 통해 확장된다. 유사한 흐름과 구조는 챔버 출구에 존재한다. 세포가 기능화 된 슬라이드 상에 접종하고,이어서 유동 챔버에 부착된다. 이것은 쉽게 연구 한 후 검색된 큰 인구 수 있습니다. 공동 배양 실험 사이토킨 / 플로우 전송을 허용하면서 문화 간의 세포 간 접촉을 제거하는 다공성 폴리 카보네이트 멤브레인을 사용할 수있다. 이 시스템은 이전에, 높은 PI 흐름 및 내피 단층 배양 및 EC / SMC 공동 배양 1, 10에 미치는 영향을 모델링하기 위해 세포 반응에 병리학 PI 높은 질환을 조사하는데 사용되었다. 이러한 플로우 콘을 모델링하는 데 사용되는 프로토콜을 기술함으로써ditions, 우리는 응답을 셀에 흐름 신호 기여를 결정하는 다른 사람을 도울 수 있도록 노력하겠습니다.
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Protocol
1. 실란 화 및 슬라이드의 생체 분자 기능화 또는 폴리 카보네이트 막
참고 :이 프로토콜 내에서 화학 물질 및 솔루션의 대부분은 높은 증발 속도 (에탄올 (EtOH로), 아세톤 등)이있다. 다른 단계 낮은 증발 속도에 대한 긴 배양 시간을 수반한다. 파라핀 필름 용기를 밀봉하는 것이 좋습니다. 주의 : (포함 : 황산, 아세톤, (3- 아미노 프로필) 트리에 톡시 실란, 글루 타르 알데히드, EtOH로) 화학 물질의 대부분은 위험, 또는 휘발성 간주됩니다. 사용하기 전에 적절한 보관, 취급 및 폐기에 대한 각 물질의 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오.
- 전체 침수를 보장 방향에 관계없이 깨끗한 유리 슬라이드 염색 접시에 1mm에 의해 50mm로 75mm를 측정하는 새로운 유리 슬라이드를 놓습니다. 단계 1.1-1.12에 대한 용기를 사용할 것.
주 : 모든 후속 인트 들면 50mm로 75mm의 크기로 잘라 0.4 미크론 기공 크기의 공동 배양에, 폴리 카보네이트를 포함한다 (PC) 막,PC의 작용과 EC 파종을위한 PS. - 황산 (20 %), O / N에서 슬라이드를 담가.
주의 : 사용하기 전에 황산에 대한 물질 안전 보건 자료를 참조하십시오. - 5 분, 3 회 탈 이온수 (DI)를 침지마다 DI를 변경하여 슬라이드를 씻으십시오.
- 30 분 동안 아세톤에 슬라이드를 담가.
주의 : 사용하기 전에 아세톤에 대한 물질 안전 보건 자료를 참조하십시오. - 6 % (3- 아미노 프로필) 트리에 톡시 실란 / 아세톤 용액의 O / N에 슬라이드를 담가.
주의 : 사용하기 전에 (3- 아미노 프로필) 트리에 톡시 실란 및 아세톤에 대한 물질 안전 보건 자료를 참조하십시오. - 아세톤마다 변경, 5 분, 3 회 아세톤 슬라이드 담가.
주의 : 사용하기 전에 아세톤에 대한 물질 안전 보건 자료를 참조하십시오. - 5 분, 3 회 DI에 담가 때마다 탈을 변경하여 슬라이드를 씻으십시오.
- 60 분 동안 1.5 % 글루 타르 알데히드 / DI 솔루션에 슬라이드를 담가.
주의 : 사용하기 전에 글루 타르 알데히드에 대한 물질 안전 보건 자료를 참조하십시오. - 5 분, 두 번 DI에 담가 때마다 탈을 변경하여 슬라이드를 씻으십시오.
- 장소 슬라이드멸균 층류 후드에서 30 분 동안 70 % 에탄올 (EtOH 중)로 S.
- 의 EtOH를 제거하고 증발 잔류 남아 있습니다. 슬라이드를 재수하기 위해 멸균 DI와 드레인에 슬라이드를 담가.
참고 : 슬라이드 또는 PC 막 1 주일까지 4 ° C에서 유리 슬라이드 홀더에 밀봉 저장 될 수있다. 세포 배양에 대한 사용하면, 반복 1.10 및 1.11 단계를 반복합니다. - 슬라이드 홀더에서 슬라이드를 제거하고 층류 후드에 100mm 광장 페트리 접시에서 100mm로 배치합니다.
참고 :이 컨테이너는 나머지 모든 단계에 사용됩니다.- 단종 실험에 대한 내피 세포 시드를위한 슬라이드 또는 PC를 준비합니다.
- 코트 기능화 슬라이드 또는 PC 한쪽에 1 ml의 피브로넥틴 용액 (25 μg의 / ㎖)과 함께 (단계 1.11), 세포 배양 챔버에 노출 근사 면적.
- 1 ~ 2 시간 동안 37 ℃로 설정 무균 인큐베이터에서 슬라이드 나 PC를 품어.
- 배양 후, GLA를 사용하여 남아있는 용액을 대기음진공에 접속 SS 흡인기 피펫.
참고 : 슬라이드는 이제 향후 사용을 위해 4 ° C에서 O / N을 저장 될 수있다.
- 단지 EC / SMC 공동 문화의 제조 1.12.2 단계를 수행합니다. 제조와 공동 배양 실험 평활근 세포 (SMC) 배양을 시드.
- 흐름 챔버 진공에 맞춰 50mm 외경 30mm로 50mm의 내경, 두께 0.5 mm로 75mm의 크기와 구멍과 슬라이드 (단계 1.11)의 상단에 배치 실리콘 가스켓.
- 10 % FBS / DMEM 서스펜션에 1 ml의 SMC를 준비합니다. 7 %의 NaHCO3 및 7.4의 pH를 0.1 M NaOH 용액으로 2 ㎎ / ㎖의 콜라겐 타입 I의 1 ml의 용액을 중화하고, 2 × 106 세포 / ml의 최종 세포 밀도와 SMC 현탁액과 혼합한다.
- 가스켓 내에 SMC 용액을 확산하고, 30 분간 CO 2, 37 ℃에서 슬라이드를 배양하고 5 %.
- 배양 후, 수정 된 둘 베코 혼합 25 ㎖, 0.1 % 소 태아 혈청 (FBS)과 슬라이드 커버72 시간 동안 독수리 중간 (DMEM).
- 단종 실험에 대한 내피 세포 시드를위한 슬라이드 또는 PC를 준비합니다.
- 유리 슬라이드 / 폴리 카보네이트 막에 문화 내피 세포되는 EC ().
- 시드 유리 슬라이드 또는 폴리 카보네이트 막의 피브로넥틴 표면에 6.0 × 105 세포 / ml 농도의 초기와 10 % FBS / DMEM에서 한 ML되는 EC.
- 37 ° C, 5 % CO 2 인큐베이터에서 배양 한 세포, 및 10 % FBS 120 분.
- 37 ° C에서 인큐베이터에서 추가로 10 % FBS / DMEM으로 세포 및 장소를 포함하는 커버 슬라이드, 5 % CO 2 O / N, 70 % -80 %의 합류까지.
유체 점도 및 체적 유량 2. 결정
참고 : 회전 점도계 민감한 장비, 그리고 점도계 사용자 설명서는, 교정 제로, 또는 측정을 수행하기 전에 참고해야한다.
- 실험의 대상으로 혈관의 문학에서 원하는 유체 전단 (τ)를 결정합니다.
- 지표 성과회전 점도계를 사용하여 E 1 % FBS / (μ) DMEM 점도.
- Poiseuille 식으로부터 필요한 체적 유량 (Q)을 결정 :
,
여기서 τ = 유체 전단, μ = 점도, Q = 권. 유량, W = 챔버 폭, H = 챔버 높이). - 설정 펌프는 단계 2.3에서 파생 된 유량, 이후의 모든 단계에 사용하는.
, 박동 지수 3. 결정
주 : 시스템 내의 모든 연결 포트는 적절한 크기의 로크 링 투 미늘 또는 암형 루어 투 미늘 연결부와 연결되어야한다. 연결 PVC 튜빙은 미늘 이음쇠에 접속 될 수 있고, 회로는 완성했다.
- 올바른 흐름 방향 챔버 (그림 3) 초음파 유량계를 감쇠와, 그림 2에서와 같이 흐름 회로를 연결합니다.
초음파 유량계는 장비의 중요한 부분이며, 참고사용자 설명서는 사용하기 전에 참고해야한다. - 저장 볼륨 내에서 침수 (펌프하기 위해) 저수지 배출 튜브를 보장함으로써, DI 물 흐름 회로와 저수지를 입력합니다. 유량계를 사용하여 흐름 파형을 시각화.
- 댐핑 챔버에 야외 방출 밸브는 유체 / 풍량 비율을 변경합니다. 가까이 다른 오일 레벨 간격으로 공기 방출 밸브 및 계산 박동 지수 (PI = (V 맥스 - V 최소) / V 평균) 흐름 파형 피크 (V 최대), 통 (V 최소)를 사용하여, 그리고 의미 (V 평균). 노트북에 기록 PI 값.
- 마크는 향후 사용을 위해 팁 펠트, 영구적 인 잉크 펜을 사용하여, 댐핑 챔버에 오일 레벨 및 PI를 결과. 병리 문학 (11)에서 원하는 PI 수준을 결정합니다.
- 실리콘 튜브 Formation- 선택, 제어 박동의 더 진보 된 방법
- 예 (BAS을 다른 비율로 실리콘 엘라스토머 기재와 경화제를 혼합1-36 : 10의 전자 - 투 - 가교제 비율. 1) 변경 대상 탄성 계수를 들어, 이전에 도시 한 바와 같이 2
- 간단히 소정의베이스 - 가교제 비율로 실리콘 프리폴리머 혼합물에 강 캐 뉼러 (14 G)에 침지 반복 침지 처리에 의해 경화 실리콘 튜브를 제작.
- 경화 공정의 중간에 방향 전환, 캐 뉼러 상에 폴리머 코팅을 경화시키기 4 시간 동안 60 ℃에서 오븐 세트로 예비 코팅 된 캐 뉼러를 배치했다.
- 같은 실리콘 엘라스토머 혼합물로 침지 과정을 반복 0.3 ~에 mm 두께의 튜브 결과 추가로 4 시간에 대해 다시 오븐에 넣습니다.
- 스테인레스 스틸 정맥에서 얇은 실리콘 튜브를 제거합니다.
- 3.3에서와 같이 각 대신 챔버 댐핑 회로 및 테스트 PI를 흐름에 튜브를 연결합니다.
4. 펌프 살균
- 1에서 유량 용기 (그림 2), PVC 튜브, 가스켓을 담가0 % 과산화수소 (H 2 O 2). 4 단계 전에 멸균 디 씻으시오.
- 예비 보육 선반에 혈액 펌프를 놓습니다.
주 : 인큐베이터 선반 스테인리스, 그리고 전체 유동 회로의 무게를 지탱할 수 있어야한다. - 저장 볼륨 내에 잠기 저장조 출구 관 (펌핑하기 위해)하도록함으로써 10 % H 2 O 2 유동 회로 및 저장조를 채운다. 에 UV 광으로 층류 후드에서 20 분 동안 회로를 통해 펌핑하여 H 2 O 2를 순환.
- 기음 모든 H 2 O 튜브 2, 및 흐름 회로를 통해 펌핑에 의해 멸균 PBS로 씻는다.
5. 유량 용기 조립
참고 : 유량 용기는 진공 포트와 입구 및 출구 흐름 포트 (그림 2 참조), 아크릴, 사용자 정의 만든 판으로 구성되어 있습니다. 챔버 어셈블리 문화 슬라이드 상단의 유량 용기 및 개스킷을 배치 구성, 프로perly 정렬하고 설명한다.
- 37 ° C의 물을 욕조에 1 % FBS / DMEM을 따뜻하게하고 유량 용기를 준비합니다.
- 세포면을 위로하여 상단에 장소 가스켓 (단계 1.13)에서 용지가 EC 슬라이드를 가져 가라.
- (선택 사항) 미디어에서 PC 멤브레인을 가지고 세포면을 위로하여 상단에 장소 가스켓 (단계 1.13에서). PC 막 아래 시드 SMC (단계 1.12.2)와 공동 문화 슬라이드를 놓습니다.
- 개스킷의 구멍 (그림 2)와 유량 용기의 진공 채널을 맞 춥니 다.
- 진공에 어떤 미디어 누수를 보장하지 진공 포트 (그림 2)에 진공 튜브를 연결합니다.
- 스프링 클램프, 유량 용기의 각면 (그림 2와 5)에 하나의 유리 슬라이드 클램프 유량 용기 어셈블리 아래 장소의 폴리 카보네이트 시트.
- 장소 흐름 37 ° C에서 인큐베이터 시스템 및 5 % CO 2, 낮은 박동에 가득 저수지에서 펌핑에 의해 미디어와 회로를 입력합니다.세포를 전처리하는 4 시간 동안이 흐름을 유지한다.
- 원하는 시간에 대한 유체 표시된 PI 수준으로 챔버 댐핑에 볼륨과 문화를 조정합니다.
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Representative Results
유동 조건의 유지 보수 흐름 회로 (그림 1)의 정확한 조립에 의존하고있다. 직경 튜브하기 전에 배양 한 후 챔버 유동 저항 및 후속 압력 강하를 감소시키는 큰 직경 어셈블리에서 중요한 선택이다. 의도 압력 및 유속을 보장하기 위해 의도 된 튜빙 실험 전에 유량계 시스템을 조립한다. 실리콘 가스켓 (사진 없음)에 절취선이있는 문화 챔버 진공 채널 (그림 2)의 정렬, 흐름 회로 내에서 밀봉 유지한다. 시일을 보장하기 위해, 스프링 클램프는 개스킷에 추가적인 압력을 적용하는데 사용될 수있다. 유리 슬라이드, 폴리 카보네이트 시트에 의해 보호 챔버 영역 (그림 6)에 맞게 절단해야한다. 유속이 별도로 유지 시일 합병증에 기여할 수 있기 때문에, 미디어는 미디어의 점도를 증가시키기 위해 덱스 트란의 첨가를 통해 변경 될 수있다. 증가 viscos 통해성만은, 유체는 낮은 전단 속도에서 유지할 수있다. 시스템 응답 및 무결성 단순히 댐핑 실과 리저버 (도 3) 내의 유체 레벨 및 유체 색을 관찰하여 실험 중간에 체크 될 수있다. 유체 수준이 일정한 값을 유지한다. 초기 오일 레벨은 저장 및 검진 비교 챔버 댐핑 모두에 표시되어야한다. 조정은 실험 개시 또는 댐핑 챔버에 공기의 입구를 가능 매체에 첨가함으로써 제조 될 수있다. (4)는 유속의 대표적인 기록을 도시한다. 페놀 붉은 채색 실험의 과정을 통해 감소한다. 실험 종료 후, 매체는 회로로부터 배출하도록 허용되어야하고, 미래의 사용을위한 계수 또는 -80 ° C에 냉동 장치에 보관. 대사 미디어 콘텐츠 분석 또는 사이토 카인을 방출, 또는 세포 컬트 대를 사용하여 세포 반응에 분비 신호를 모니터링하기 위해 사용될 수있다URE. 세포 형태와 포화 상태 (그림 5)에 대한 위상차 현미경 아래에 몇 군데있다. 형태 등의 스핀들은 24 시간 (그림 7)를 통해 HPF 후되는 EC에서 관찰된다.
도 1 흐름은 회로도. 방식 내에 표시된 유량계는 댐핑 실에 의해 설정된 박동 인덱스 수준을 측정하기 위해 사용된다. 흐름 파형이 시스템 압력이 생리적 남아 있도록하기위한 연결 관의 직경을 측정한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 흐름 차mber 설계 및 측정. 외부 채널은 진공에 연결되어 있습니다. 센터 사진 챔버의 클램핑을 보여줍니다. 오른쪽 사진은 가스켓 디자인을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 흐름 댐핑 상공 회의소. 흐름 댐핑 챔버 설계도는 흐름 방향 및 연결을위한 나타냅니다. 공기 방출 밸브 출구 밸브가 폐쇄되며, 개방되고, 유체는 PI 원하는 레벨로 챔버를 채운다. 출구 밸브와 공기 방출 밸브, 유량 이력서 및 챔버 수준을 유지하고 내 유체 수준의 폐쇄 열 때. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 
그림 4. 다양한 박동 지수와 샘플 흐름 파도. 높은 박동 흐름 (왼쪽)와 낮은 박동 흐름 (오른쪽). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 공동 문화 흐름 도식. 공동 문화 콜라겐 젤의 평활근 세포와 내피 세포를 통해 타악기 흐름을 보여줍니다. 세포에서 사이토 카인의 방출은 다공성 폴리 카보네이트 막을 통해 통과 할 수 있습니다. 하시기 바랍니다이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. 흐름 조건과 내피 세포의 형태학 변화. 작용 폴리 카보네이트 막에 플루 내피 세포 배양. (왼쪽) 전에 흐름 및 흐름 (오른쪽) 후에 제시된. 흐름은 서로 다른 조건, 정적 (NO 속도), 정상 (일정 속도), 높은 펄스 (높은 박동) 아래에 표시됩니다. 세포가 2 % 크리스탈 바이올렛으로 염색된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7. 부드러운 근육세포 단백질 발현 흐름 조건을 변경합니다. 다른 조건, 정적 (NO 속도), 정상 흐름 (일정한 속도), 높은 펄스에서 α-평활근 액틴 (SMA)과 미오신 중쇄 (SM-MHC)의 평활근 세포 식입니다. 크게 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 버전입니다.
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Discussion
이 프로토콜은 시험관 내에서 맥동 흐름을 재생하는 방법을 설명하고, 질환 병리에 유동 조건의 기여도를 결정하는 수단이 최초의 단계가 될 수도있다. 이 프로토콜을 사용하여 이전의 연구는이 프로토콜을 경험 연구소를 대상으로, 유동 조건은 또한 혈관 염증 반응. 1, 10에 기여 발견했다. 이와 같이, 어느 깊이 유체 역학 않으며 생화학 분석은 본원에 기재되어있다. 고급 유체 역학 1 및 고급 기술하기 문헌 상담 장시간은 위에 유체 전단 하에서 세포를 배양 2 긴급 :. 1), 밀봉 된 유동 회로를 유지 저장조를 제외하고, 2) 실험에 걸쳐 오염을 방지한다. 흐름 회로 씰링 원하는 유량 파라미터에 영향을주는 의도적 공기의 도입과 함께, 매체 볼륨 정정 PI 수준을 유지하는데 필수적이다. 시스템 5 월 P의 추가 공기artially, 스트림 내에서의 흐름을 방해 흐름 경로를 방해하고, 전체 시스템의 적합성을 향상시킨다. 용적 유량이 유지 될 수 있지만, 국부적 인 속도가 증가하고, 표면에 불연속 부분이 이어질 것이다 폐색 단면적 감소. 유속의 변화와 표면 불연속 모두 불안정화 흐름에 기여 및 가능 난류 것이다. 마지막으로, 가압 유동 시스템으로 어떠한 갇힌 공기함으로써 소망하는 레벨로부터 PI 감소, 유동의 압축성 댐핑 역할을한다. 흐름 회로는, 일정한 부피 바와 같이, 갇힌 공기는 시간에 따라 대사 산물의 농도를 증가 영향을 미칠 수있는 세포 매체의 누출을 일으킬 것이다. 혈액 펌프 밀봉 및 기능 때문에 인큐베이터에서 펌프의 위치는 밀봉 합병증을 초래할 수있다, 온도에 의존한다. 펌프 밀봉 또는 malfunc 통해 유동 회로와 미디어의 손실 내의 공기의 양이 증가 존재능은 세포 환경의 다양성을 증가시키고, 부정확 한 결과를 가져올 수있다. 실험 기간 동안의 오염 방지는 모든 세포 배양에 중요하다. 흐름 회로는 다시 밀봉뿐 오염물을 방지하기 위해 입구 강조되어야한다. 교류 매체 따라서 사용이 필요하다 직후 회로의 청소, 영양분과 미생물 성장에 필요한 당분을 많이 제공합니다. 또한, 불투명 펌프 커버, 전체 펌프의 살균에 자외선의 효과를 감소시킨다. 이것은, 에탄올 아크릴 피스톤의 호환성과 함께, 회로 이용한 과산화수소의 전체 살균을 요구 (H 2 O 2). 시스템이 사용되지 않는 오염 증가의 방지, 용액을 살균 및 멸균 환경은 모든 오염을 허용 또는 세포 배양 물을 살균하여 어느 합병증을 초래할 수있다 유지 용도. 이 기술의 한계 적절한에 무능력을 포함LY는 생리적 혈류 복잡한 유동 파를 모델링. 흐름 시스템은 유사한 기능을 제공 않지만, 생리적 흐름에서 볼 수있는 복잡한 파형의 다양한 측면을 제어하거나 변경할 수 없습니다. 또한, 흐름을 왕복에 전단 응력을 반대하는 일부 동맥 질환에서 볼 합병증이며,이 흐름 시스템으로 복제 할 수 없습니다에 의해. 또한, 세포 반응의 장기 연구는 주로 펌프의 성능에 더 복잡하고 어려운 일 수있다. 하류 저항을 감소시키는 것은 유동 시스템과 펌핑 효율의 무결성을 유지하는 것이 필수적이다. 마지막으로, 상기 시스템은 생리 맥관계를 모델링하지 않고, 신축성 또는 동맥 기저막 강성으로 인한 기계적 신호를 고려하지 않는 유리 슬라이드 및 폴리 카보네이트 막을 사용한다. 이전에, 한 연구는 주사기를 사용하여 맥동 유동을 재생할 수있는 맥동 체제를 사용한 1 2 펌프. 를 repr에서 시스템의 효능높은 PI를 oducing하는 펌프 속도와 실링에 대한 제한에 의해 영향을받을 수 있습니다. 댐핑 실에있어서 펌프의 프로그래밍을 요구하지 않는, 그 적용에 추가로 간단하다. 유동 시스템의 미래의 애플리케이션 흐름 및 챔버 슬라이드를 대체하는 탄성 튜브의 혼입에 의한 동맥 스트레칭의 결과로서 기계적 시그널링을 허용한다. 이러한 개선을 통해 일치하지 않는 규정 준수 및 내강 표면 불연속 더 연구 할 수있다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
저자는 (중량 HL097246 및 HL119371) AHA (중량 13GRNT16990019) 및 NHLBI을 포함하여 자금 출처를 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 34850 | |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Glass Slide (70 mm x 50 mm) | Sigma-Aldrich | CLS294775X50 | |
| Polycarbonate Membrane | Millipore Corp. | HTTP09030 | |
| Silicone Gasket | Grace Bio-Labs | RD 475464 | |
| Fibronectin (25 μg/ml) | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Collagen Type-I | Sigma-Aldrich | C3867 | |
| NaHCO3 | Fluka | 36486 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Damping Chamber | This chamber is custom made, and may be requested using the engineering drawing of Figure 3. | ||
| Blood Pump | Harvard Apparatus | 529552 | |
| Poly-Vinyl Carbonate Tubing | US Plastic | 65066, 65063, 65062 | Various sizes may be required |
| Luer Connections | Nordson Medical | Various | Various sizes will be required, and a number of parts should be purchased for replacement use. |
| Culture Chamber | Machined in-house | Custom | Acrylic may be purchased in sheets and machined for intended use. The engineering drawing shown in Figure 2 may be used to recreate this chamber. |
| Square Petri Dish | Cole-Parmer | EW-14007-10 | |
| Glass Slide Holder | Capitol Scientific | WHE-900303 | |
| Fetal Bovine Serum | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Flow Meter | Sonotec, GmbH | Sonoflow co.55/060 | |
| Sylgard Elastomer Kit | Sigma-Aldrich | 761036-5EA | |
| 14 G Steel Cannula | General Laboratory Supply | S8365-1 |
References
- Scott-Drechsel, D., Su, Z., Hunter, K., Li, M., Shandas, R., Tan, W. A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves. Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).
- Tan, Y., et al. Stiffening-Induced High Pulsatility Flow Activates Endothelial Inflammation via a TLR2/NF-κB Pathway. PLoS ONE. 9 (7), e102195 (2014).
- Wexler, L., et al. Coronary Artery Calcification: Pathophysiology, Epidemiology, Imaging Methods, and Clinical Implications A Statement for Health Professionals From the American Heart Association. Circulation. 94 (5), 1175-1192 (1996).
- Lan, T. -H., Huang, X. -Q., Tan, H. -M.
- Lee, C. H., et al. Promoting endothelial recovery and reducing neointimal hyperplasia using sequential-like release of acetylsalicylic acid and paclitaxel-loaded biodegradable stents. Int J Nanomedicine. 9, 4117-4133 (2014).
- Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. Vascular Remodeling in Hypertension Roles of Apoptosis Inflammation, and Fibrosis. Hypertension. 38 (3), 581-587 (2001).
- Greil, O., et al. Changes in carotid artery flow velocities after stent implantation: a fluid dynamics study with laser Doppler anemometry. J Endovasc Ther. 10 (2), 275-284 (2003).
- Egorova, A. D., van der Heiden, K., Poelmann, R. E., Hierck, B. P. Primary cilia as biomechanical sensors in regulating endothelial function. Differentiation. 83 (2), S56-S61 (2012).
- Liu, S. Q., Goldman, J. Role of blood shear stress in the regulation of vascular smooth muscle cell migration. IEEE T Bio-Med Eng. 48 (4), 474-483 (2001).
- Scott, D., Tan, Y., Shandas, R., Stenmark, K. R., Tan, W. High pulsatility flow stimulates smooth muscle cell hypertrophy and contractile protein expression. AJP: Lung C. 304 (1), L70-L81 (2013).
- Panaritis, V., et al. Pulsatility Index of Temporal and Renal Arteries as an Early Finding of Arteriopathy in Diabetic Patients. Ann Vasc Surg. 19 (1), 80-83 (2005).
- Miao, H., et al. Effects of Flow Patterns on the Localization and Expression of VE-Cadherin at Vascular Endothelial Cell Junctions: In vivo and in vitro Investigations. J Vasc Res. 42 (1), 77-89 (2005).
