Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

فيفو السابقين المعوية الحويصلات لتقييم الأغشية المخاطية النفاذية في نماذج من الأمراض المعوية

doi: 10.3791/53250 Published: February 9, 2016

Abstract

الحاجز الظهاري هو أول دفاع الفطرية في الجهاز الهضمي، وينظم بشكل انتقائي النقل من التجويف إلى المقصورات الأنسجة الكامنة، وتقييد نقل جزيئات أصغر عبر الظهارة وتقريبا تحظر تماما نقل الجزيئات الظهارية. يتم تحديد هذه الانتقائية من قبل طبقة جل المخاطية، مما يحد من نقل جزيئات محبة للدهون وكل من مستقبلات قمي والمجمعات البروتين صلي ضيقة من الظهارة. في المختبر نماذج ثقافة خلية من خلايا ظهارة هي مريحة، ولكن كنموذج، فإنها تفتقر إلى تعقيد التفاعلات بين الجراثيم، المخاطية هلام، ظهارة والجهاز المناعي. من ناحية أخرى، يمكن أداؤها في الجسم الحي تقييم امتصاص الأمعاء أو النفاذية، ولكن هذه المقايسات قياس امتصاص الجهاز الهضمي بشكل عام، مع عدم وجود دليل على خصوصية الموقع. فيفو السابقين فحوصات النفاذية باستخدام "الحويصلات المعوية". هي طريقة أسرع وأكثر دقة لقياس إما سلامة المعوية العامة أو وسائل النقل المقارن من جزيء محدد، مع ميزة إضافية تتمثل في الأمعاء الموقع خصوصية. نحن هنا وصف إعداد الحويصلات المعوية للدراسات النفاذية وحساب نفاذية واضحة (P التطبيق) من جزيء عبر الحاجز المعوي. ويمكن استخدام هذه التقنية كوسيلة لتقييم امتصاص الدواء، أو لفحص الخلل حاجز الظهارية الإقليمي في النماذج الحيوانية من الأمراض المعوية.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

حاجز الظهارية في الأمعاء الجهاز الهضمي هو منطقة سطح الغشاء المخاطي تقدر ب 400 م 2 في الإنسان البالغ. ونتيجة لذلك، يتعرض باستمرار للطعن من الميكروبات، والمخدرات بلعها، المواد الغذائية والسموم البكتيرية. المضيف يجب أن لا يميز فقط بين البكتيريا المتعايشة مقبولة ومسببات الأمراض المحتملة، ولكن يجب منع هذه الأنواع والجزيئات التي يفرزها من عبور حاجز الظهارية، بينما في نفس الوقت مما يتيح امتصاص المواد الغذائية. وهكذا، فإن دور ظهارة الأمعاء هو بمثابة حاجز انتقائي لمحتويات اللمعية 1. ويتحقق ذلك، في جزء منه، من قبل نظام الدفاع الظهارية الفطري في الغشاء المخاطي، الذي يعمل من خلال نظام بيولوجي استجابة تتألف من آليات التأسيسية ومحرض 2.

فقدان وظيفة طلائي الحاجز هو علم الأمراض الذي هو سمة من عدد من أمراض الجهاز الهضمي. وفي الجسم الحييمكن تقدير فحص وظيفة حاجز الظهارية من خلال أنبوب تغذية عن طريق الفم من جزيء التتبع وتحليل مصل الدم لاحق 3. ومع ذلك، فإن هذا الأسلوب لا يقدم أي إشارة إلى موقع الخلل الحاجز. في المختبر، وبحكم فيفو تقييم المقاومة بطريق الظهارة باستخدام أنظمة Transwell 3 و غرفة أوسينج 4،5 على التوالي، يعملون عادة كعلامات بديلة من وظيفة حاجز الظهارية، ولكنها تفتقر إلى علم وظائف الأعضاء الأمراض المساهمة في النماذج الحيوانية 6. في هذا البروتوكول وصفنا نموذج إعداد الأنسجة خارج الحي الذي يسمح بتقييم مباشر ومترجم من سلامة الأمعاء والتي يمكن استخدامها لتقييم وظيفة حاجز المخاطية في عدد من المستويات. الأهم من ذلك، يمكن تطبيق هذه التقنية على نماذج حيوانية من المرض، أو قد يتم التلاعب بها دواء للسماح في عمق الاستجواب من ضعف الغشاء المخاطي الحاجز.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

يتم تنفيذ جميع الأعمال الحيوان في هذا البروتوكول مع الالتزام الصارم من جامعة نيوكاسل جنة الأخلاقيات الحيوانية وافق الإجراءات.

1. إعداد الآلات، وسائل الإعلام الثقافة وصحون

  1. قبل دافئ وسائل الإعلام 199 (TC199) أو Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) وسائل الاعلام إلى 37 ° C. قبل الأوكسجين والمتوسطة التي ظهرت على السطح مع 95٪ O 2/5٪ CO 2. تأكد من وسيلة لديه درجة الحموضة النهائية من 7.3.
  2. إعداد خياطة بقطع اثنين من 5 أقسام سم لكل كيس. حلقة الغرز إلى عقدة مغلقة.

2. تشريح وإعداد الجهاز الهضمي

  1. سحب الصلبة الغذاء 12 ساعة قبل القتل الرحيم. إذا رغبت في ذلك، وضع الحيوانات على ملاحق جل المواد الغذائية خلال هذا الوقت.
  2. الموت ببطء الفئران عن طريق جرعة زائدة من الصوديوم بنتوباربيتون ([200 مغ / كغ]، حقن داخل الصفاق) تليها خلع عنق الرحم وفقا لأخلاقيات بروتو المؤسسيالعواميد ورذاذ الايثانول 70٪ على البطن والصدر.
  3. باستخدام مقص، وجعل شق أفقي في منتصف البطن وفضح البريتوني.
  4. انتقل إلى فصل وإزالة الجهاز الهضمي عن طريق خفض الأمعاء الدقيقة العلوي من المعدة في العضلة العاصرة البوابية وقطع الأمعاء الغليظة على حافة الشرج. استخدام ملقط لإزالة بلطف مساريق. ضع الأمعاء في قبل تحسنت والمتوسطة الاوكسيجين.
  5. تحديد الجزء من الأمعاء إلى تقييم للنفاذية (الشكل 1) وقطع هذا القسم الحر عن بقية الأمعاء.
    1. من أجل الحفاظ على الاتساق بين الحيوانات، وقياس أجزاء من العفج والصائم نسبة إلى المعدة، وقياس أجزاء من القولون والدقاق نسبة إلى الأعور.
    2. عند اختيار شرائح الأنسجة، لاحظ وجود الغشاء المخاطي المرتبطة الأنسجة اللمفاوية مثل بقع باير ل. ويمكن تحديد هذه كما إيماءة صغيرةules على الجانب المصلي من التجويف.
    3. باستخدام حقنة 1 مل، تدفق بلطف محتويات اللمعية الجزء الأمعاء في طبق بتري مع برنامج تلفزيوني قبل ساخنة (37 درجة مئوية). قد يتم تجاهل هذه المحتويات البرازية أو تخزينها في -80 ° C لتحليل المستقبل كما تريد.

3. إعداد المعوية الحويصلات

  1. تحضير حقنة 1 مل مع حجم 300 ميكرولتر من مركب اختبار أو الجزيء. لسلامة الغشاء المخاطي، 1 ملغ / مل حل من FITC-ديكستران M.Wt. 4400 يمكن استخدامها. تحقيقات تتراوح بين 4،400-70،000 دا في حجم يمكن أن تستخدم لزيادة حساسية. تناسب بشكل آمن صغيرة قسطرة الأوعية الدموية الحيوانية على الحقنة.
  2. قياس 5 سم من افتتاح الجزء الأمعاء وربط القطاع مغلقة بإحكام مع خياطة حلقة في هذه المرحلة. وضع بلطف خياطة حلقة مرتبطة مسبقا حول فتحة الأمعاء وادخال القسطرة أضعفت. سحب الخناق مغلقة وذلك لتأمين جزء الأمعاءوالافراج عن حجم 300 ميكرولتر من الحقنة في الأمعاء، وضمان أن كل حل يتم حقن.
  3. إزالة بلطف القسطرة في حين سحب في وقت واحد الخناق خياطة لتأمين إغلاق الكيس المعوي. قطع كيس معوي فضفاض من الأمعاء والمكان الى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل مليئة 20 مل من المتوسط ​​الاوكسيجين، مسخن الى 37 ° C.

4. قياس النفاذية

  1. مكان الأنابيب المخروطية التي تحتوي على الأكياس المعوية في حمام الماء الساخن لتعيين 37 ° C. في 0، 30، 60، 90، و 120 نقطة زمنية دقيقة، أخذ عينة 100 ميكرولتر من أنبوب مخروطي الشكل ونقل إلى 96 لوحة جيدا، لتحل محل وحدة التخزين مع 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام الجديدة في كل حالة.
  2. بعد أخذ العينة النهائية، وقطع الأكياس المفتوحة عند نقطة خياطة ونزولا على طول هذا الجزء، وتعريض سطح الغشاء المخاطي.
  3. قياس طول وعرض كل جزء في الأمعاء. إذا دسالأحمر، والمفاجئة تجميد شرائح ومخزن في -80 ° C للبروتين أو تحليل الكيمياء الحيوية، أو بدلا من ذلك، مخزن في حل استقرار RNA لفحوصات الجزيئية.
  4. بناء منحنى مستوى التخفيفات سجل لجزيئات ذات الكلمات الدلالية FITC النطاق 1-1 × 10 -6.
  5. عينات قياس ومعايير لFITC على قارئ لوحة نيون، FITC الإثارة / الانبعاثات: 495 نانومتر / 519 نانومتر.

5. حساب نفاذية على ما يبدو، لكل المعوية كيس الفردية

  1. تحويل وحدات الوقت للثانية.
  2. لكل نقطة زمنية، وحساب تركيز التراكمي، س

    س ر = (C ر * V ص) + (س ر المبلغ * V ق)،
    حيث:

    س ر = تركيز التراكمي في الوقت t
    C ر = تركيز في الوقت t
    V ص = حجم التداول في الجانب المتلقي
    س ر مبلغ = مجموع كل س ر السابق
    V ق =حجم عينات
  3. مؤامرة س مقابل الوقت (T) وحساب المنحدر: δQ / δt
  4. حساب نفاذية واضحة (التطبيق P)

    P التطبيق = (δQ / δt) / (A * التعاون)، حيث:

    A = مساحة من الأنسجة
    C 0 = تركيز الأولي

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ويمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة التغيرات الإقليمية في وظيفة حاجز المعوية في النماذج الحيوانية من الأمراض المعوية. عن طريق قياس تدفق تحقيق paracellular عبر سطح الغشاء المخاطي في مناطق مختلفة من الجهاز الهضمي 7، وسلامة منعطفات ضيقة الظهارية يمكن تقييم. وبالإضافة إلى ذلك، من خلال تغيير طبيعة التحقيق paracellular حسب الحجم (الشكل 2) أو للا مائية (الشكل 3)، ودرجة الاضطراب الظهارية، أو سلامة طبقة جل المخاطية، كما يمكن قياسها. توظيف أكبر علامات الوزن الجزيئي يسمح للاستجواب أكثر حساسية من نفاذية paracellular من الغشاء المخاطي، كشف عن تغيرات الرصينة، التي قد لا تكون واضحة من قبل القياسات الكهربية مثل بطريق الظهارة المقاومة الكهربائية (طير)، ولكن الذي سيكون كافيا للسماح النقل paracellular (الشكل 2). مخاطيةسال الالتهاب قد يؤدي إلى فقدان الخلايا الكأس والحد من هلام المخاطي الواقي الذي يعتلي بشكل طبيعي ويحمي واجهة الظهارية. باستخدام مجسات مسعور، وسلامة طبقة جل المخاطية المعوية ويمكن أيضا فحص (الشكل 3). وبالإضافة إلى ذلك، سلامة حاجز الإقليمية يمكن فحص من خلال إعداد معين من الحويصلات المعوية من المناطق المعوية المختلفة. التغييرات الإقليمية في وظيفة حاجز تختلف في نماذج حيوانية مختلفة من المرض، وبالتالي، فإن استخدام الأكياس المعوية يسمح لتقييم المترجمة من وظيفة حاجز المعوية (الشكل 4)، بالمقارنة مع أنبوب تغذية عن طريق الفم من التحقيقات وفحص مصل لاحق.

الشكل 1
الشكل 1. مخطط الجهاز الهضمي الفئران. التخطيطي الجهاز الهضمي من C57BL / 6 الماوس، من المعدة إلى رانه الشرج. تقاطعات الأمعاء الصغيرة لا يمكن التفريق بسهولة ظاهريا وأخذ العينات تتفق يساعد على التقليل من الماوس لاختلاف الماوس. لأغراض خلق الحويصلات في الأمعاء، وعلى بعد 5 سم الجزء القاصي إلى العضلة العاصرة البوابية تشمل الاثني عشر. وهناك قسم 10 سم تمتد بشكل قريب من الأعور تشمل الدقاق. تمثل الأنسجة المعوية الصغيرة المتبقية الصائم. يقع المستقيم 2 سم الأقرب إلى فتحة الشرج، مع الأمعاء الغليظة المتبقية، وتمتد إلى الأعور تمثل القولون 8. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الرقم 2.   النقل paracellular تعتمد على حجم الجزيئات FITC-ديكستران على الرغم من أن الغشاء المخاطي الظهارية في السيطرة ومفاجآت صيف دبي التهاب القولون أنيماوقد أعدت ليرة سورية. الحويصلات المعوية من نقطتين لمفاجآت صيف دبي الفئران 10 يوما في مسار المرض. تم تحميل الحويصلات مع 1 ملغ / مل حل من FD-4 (MW 4400 دا)، FD-20 (MW 20،000 دا) أو FD-70 (70،000 دا) وتدفق علامة نفاذية FITC-ديكستران تم قياس أكثر من 120 دقيقة. واستخدمت العمر يقابل الحيوانات السليمة والضوابط. N = 5، 2 مكررات التقنية في N. ** ف <0.01، الطالب اختبار t. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3) :. أعدت تأثير الطبقة المخاطية هلام على سلامة عائقا أمام المركبات مسعور. الحويصلات المعوية من نقطتين لمفاجآت صيف دبي الفئران 10 يوما في مسار المرض. واستخدمت العمر يقابل الحيوانات السليمة والضوابط. من أجل السيطرة المخاطي جل السلبية، والأمعاءتم تحميلها مع 10 ملي ن أسيتيل سيستين (بريدا) (300 حجم ميكرولتر لكل 5 سم من الأمعاء) وحضنت في 37 ° مئوية لمدة 15 دقيقة وطهرتها مع متوسطة جديدة قبل أعدت الحويصلات. تم تحميل الحويصلات مع الحل 1 ملغ / مل من FD-4 (MW 4400 دا) وتدفق يقاس على مدى 120 دقيقة. N = 3، 2 مكررات التقنية في ن * ع <0.05، ** ف <0.01، الطالب اختبار t. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
تم إعداد الشكل 4. نفاذية الإقليمية من الأمعاء إلى FD-4 في نماذج الفئران من التهاب الأمعاء. المعوية الحويصلات من الصائم، اللفائفي أو القولون من الحيوانات السليمة والحيوانات مفاجآت صيف دبي أو المضادات الحيوية التي يسببها dysbiosis (AID) الحيوانات. تم تحميل الحويصلات مع 1 ملغ / مل حل من FD-4 (MW 4400 دا) و fلوكس قياس أكثر من 120 دقيقة. N = 3، 2 مكررات التقنية في ن * ع <0.05، ** ف <0.01، الطالب اختبار t. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

هنا، نحن في تفصيل العزلة وإعداد الحويصلات في الأمعاء لتقييم وظيفة حاجز المخاطية خارج الحي. وقد استخدمت الاستعدادات كيس معوي في المقام الأول في مجال البحوث الدوائية، دراسة امتصاص الأدوية مرشح عبر الأمعاء. ومع ذلك، هذا الاختبار هو على قدم المساواة مناسبة تماما لدراسة مرض معوي. نفاذية الأمعاء قد تختلف اختلافا كبيرا حسب المنطقة والموقع تقييم محدد من نفاذية تسمح لفهم أفضل لأهمية إقليمية للسلامة الغشاء المخاطي في أمراض الجهاز الهضمي. فحص قوي وتحت الظروف الفسيولوجية الصحيحة، لا تزال الأنسجة المعزولة قابلة للحياة لمدة تصل إلى 6 ساعات بعد الوفاة. بعد القتل الرحيم، وسرعة إعداد الأنسجة مهمة ويجب أن يتم مسح الأمعاء من محتوياتها ونقلها إلى وسط الاوكسيجين بأسرع وقت ممكن. من أجل ضمان الاتساق بين الحيوانات، فمن الضروري أن المناطق المعوية الصحيحة identifiإد (الشكل 1). ينصح أن يتم قياس شرائح القولون واللفائفية من الأعور، بينما يتم قياس شرائح العفج والصائم من المعدة. لأن سلالات مختلفة، ونماذج أو الحيوانات المعدلة وراثيا قد يكون أكبر، ويكون GITs لفترة أطول، الأمر يستحق تميز متوسط ​​طول أو كل جزء من الأمعاء في النموذج الخاص بك قبل الشروع في فحوصات النفاذية.

بالإضافة إلى التناسق الإقليمي، فمن المهم التأكد من أن كل كيس معوي هو قطع لطول متساوى وشغل في الكيس مع حجم الصحيح من السوائل. والتناقض في هذه العوامل تؤدي إلى انتفاخ غير المتكافئ للالغشاء المخاطي بين المقايسات. تحت انتفاخ الجزء المعوية لا يقلل فقط من تعرض محتويات اللمعية إلى سطح الغشاء المخاطي، ولكن أيضا يزيد من سماكة الأنسجة من خلالها علامة يجب أن السفر. الإفراط في انتفاخ الجزء قد يؤدي إلى تلف الأنسجة أو تنشيط الإجهاد الردود في الأنسجة، مما قد شاركالنتائج nfounding. وتجدر الإشارة إلى أن لحساب ف التطبيق لا تمثل المساحة السطحية للهيكل الزغابي. في حين أن هذا يؤدي إلى خطأ في حساب نفاذية الظاهرة الفعلية للأنسجة، فإنه لا يؤثر على النتائج المقارنة بين النماذج، كما يتم احتساب المساحة السطحية كما ثابت. يتم تسوية أي تغييرات في مساحة السطح بسبب المرض عن طريق فقدان النزاهة الظهارية والبروتوكول هو قوي بما فيه الكفاية لتحديد التغيرات في نفاذية مع تطور المرض 6.

من المستحسن استخدام المتوسطة زراعة الأنسجة. في الدراسات التي يقوم بها بارت وآخرون تم العثور على استخدام TC199 إلى زيادة كبيرة في طول العمر الجدوى الظهارية والنسيج الهندسة المعمارية النسيجية، بالمقارنة مع مخازن الملح بسيطة 9. في دراساتنا الحفاظ عليها في DMEM وTC199 المتوسطة في 37 قدمت ° C الظروف المثلى لبقاء الأنسجة 5،6،10. وسائل الإعلام الصحيحلوازم ظهارة مع العناصر الغذائية اللازمة للحفاظ على سلامة الأنسجة، مع الحفاظ على درجة الحرارة خلال فحص يضمن التمثيل الغذائي الأنسجة الأمثل الذي هو التكامل صلي ضيقة الأساسية والمقايسات التي تنطوي على النقل النشط عبر مسارات العابر لل. درجة حرارة أقل من 37 ° C يسبب فقدان الجدوى الأنسجة، وزيادة النقل paracellular وخفض النقل العابر لل11. وهكذا، وإطالة بقاء الأنسجة مع الظروف المثلى أمر ضروري وبذلك، يمكن استخدامها لفحص ليس فقط لفحص سلامة حاجز الإقليمية ولكن أيضا لدراسة الدراسات التدخل والاستجابات الفسيولوجية والنسخي.

في حين تستخدم في المقام الأول للدراسات امتصاص الدواء، وتقنيات لفحص النفاذية واضحة (P التطبيق) من جزيء علامة عبر حاجز الظهارية هي قياس حساسة للغاية لسلامة الأمعاء 12-15. وعلى النقيض من بديلة خارج الجسم الحي measuremeاليلة من وظيفة الحاجز، مثل طير، P التطبيق هو القياس المباشر وحساسة للغاية من الجدار المعوي 4. ومن الجدير بالذكر أن القياسات طير ونفاذية مقاسا التطبيق P من جزيئات علامة لا تتطابق دائما. قياسات طير تشمل مقاومة كل من منعطفات ضيقة والمقاومات متوازية العابر لل16. لذلك طير هو قياس المقاومة مجتمعة التي تقدمها منعطفات ضيقة والخلايا نفسها. إذا كانت الجمعيات خلية خلية ضعيفة (وهذا هو، ومنعطفات ضيقة هي راشح) ثم هذه المساهمة إلى المقاومة الشاملة للأحادي الطبقة سوف تكون منخفضة. وهكذا تغييرات صغيرة في المقاومة صلي مشددة لظهارة راشح تصبح التغييرات ضئيلة الشأن في المقاومة من ظهارة ككل. في المقابل، ف المقايسات التطبيق تقيس قدرة جزيء لعبور حاجز الغشاء المخاطي 17 و في الواقع، لحساسية قياسات P التطبيق قد يكون اللهمحله من خلال اختيار مختلف الجزيئات علامة الحجم (الشكل 1). النظر في حجم علامة مهم بالنسبة لنموذج من مرض معوي يجري بحثها. قد تكون نماذج من الحساسية أو وظيفي مرض 18،19، حيث فقدان النزاهة هي خفيفة الى معتدلة، أكثر ملاءمة لانخفاض علامات الوزن الجزيئي، الأمر الذي سيتيح تحديد التغييرات الطفيفة على وظيفة الحاجز المعوي. في المقابل، مع نماذج مثل مفاجآت صيف دبي التهاب القولون، والتي تنطوي على تعرية ظهارة الأمعاء، قد تكون علامات أكبر من الأنسب لتقييم الشفاء المخاطية، كما سيتم تسليط الضوء زيادات صغيرة نسبيا في سلامة الحاجز.

في حين تقدم الحويصلات المعوية نموذجا ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية وظيفة الجهاز الهضمي الحاجز، هناك بعض القيود فيما يتعلق تنوع النماذج الحيوانية التي تحتاج إلى النظر فيها. على سبيل المثال، في حالة إفرازية أو ظهارة يمكن أن تؤثر في كل من النقل paracellular عبر INTESطينة 20 وسلامة طبقة جل المخاطية 5. بينما خارج الجسم الحي المقايسات دمج القياسات الكهربية، مثل الاستعدادات غرفة أوسينج، قد تكون مسؤولة عن هذا، الحويصلات المعوية لا. ثانيا، في إعداد الحويصلات المعوية الباحثون أن تشكل هياكل اللمفاوية، مثل بقع باير، وضمن الاستعدادات الكيس، وهذه قد تؤثر على نفاذية النسيج 21. وعلى الرغم من هذه الاعتبارات، على عكس العديد من النماذج ثقافة الخلية، وتستخدم لتقييم سلامة الظهارية، والحويصلات المعوية تقدم مساهمة كل من طبقة جل المخاطية والصفيحة المخصوصة الكامنة. مساهمة من طبقة جل المخاطية، على وجه الخصوص، يمكن تقييمها من خلال استخدام وكلاء حال للبلغم، مثل السيستين ن أسيتيل، أو جزيئات التتبع مسعور، مثل ديكساميثازون 5،17. قد يكون هذا أهمية خاصة في تقييم نفاذية الأمعاء في نماذج من علاج السرطان أو مرض التهاب الأمعاء، ثهنا فقدان الحاجز المخاطي يمكن أن يكون علم الأمراض في وقت مبكر من التهاب الغشاء المخاطي 22،23. وبالمثل، في نماذج من أمراض الإسهال وأمراض الجهاز الهضمي وظيفية أو dysbiosis، إنتاج المخاط في الأمعاء والشاملة سلامة هلام المخاطية قد يكون تغيير في المواقع الإقليمية 5،19،24. أنبوب تغذية عن طريق الفم من علامات النفاذية وأخذ العينات المصل اللاحقة هو خيار آخر لتقييم نفاذية الأمعاء في الجسم الحي. في حين أن هذا الأسلوب له التلاعب الحد الأدنى من الأنسجة، وهو مقياس مركب من وظيفة الحاجز المعوي وأنها لا تقييم المساهمات الإقليمية إلى الحاجز بشكل عام. من المحتمل أن يكون مواقع مختلفة من الأهمية النسبية التي لن تكون استأثرت به النهج أنبوب تغذية عن طريق الفم نماذج مختلفة من أمراض الجهاز الهضمي. استخدام الأكياس المعوية، وبالتالي فحص السريع وحساسة وذات الصلة من الناحية الفسيولوجية التي يمكن أن تستخدم لفحص سلامة الغشاء المخاطي في الأمعاء الإقليمية في نماذج حيوانية صغيرة من المرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dekantel  Non-absorbable Silk suture Braintree Scientific SUT-S 116
Media 199 (TC199)  Life Technologies 11043-023 No phenol red as this interferes with fluorescence
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies 21063-045 No phenol red as this interferes with fluorescence
N-acetylcysteine Sigma Aldrich Use at 10 mM in media
Small animal vascular cathether: Physiocath Data Sciences International 277-1-002
FITC-Dextran 4,400 MW Sigma Aldrich FD-4
FITC-Dextran 20,000 MW Sigma Aldrich FD-20
FITC-Dextran 70,000 MW Sigma Aldrich FD-70

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goggins, B. J., Chaney, C., Radford-Smith, G. L., Horvat, J. C., Keely, S. Hypoxia and Integrin-Mediated Epithelial Restitution during Mucosal Inflammation. Frontiers in immunology. 4, 272 (2013).
  2. Otte, J. M., Kiehne, K., Herzig, K. H. Antimicrobial peptides in innate immunity of the human intestine. Journal of gastroenterology. 38, 717-726 (2003).
  3. Robinson, A., et al. Mucosal protection by hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibition. Gastroenterology. 134, 145-155 (2008).
  4. Feighery, L., et al. Increased intestinal permeability in rats subjected to traumatic frontal lobe percussion brain injury. The Journal of trauma. 64, 131-137 (2008).
  5. Keely, S., et al. Chloride-led disruption of the intestinal mucous layer impedes Salmonella invasion: evidence for an 'enteric tear' mechanism. Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 28, 743-752 (2011).
  6. Keely, S., et al. Contribution of epithelial innate immunity to systemic protection afforded by prolyl hydroxylase inhibition in murine colitis. Mucosal immunology. 7, 114-123 (2014).
  7. Sourisseau, T., et al. Regulation of PCNA and cyclin D1 expression and epithelial morphogenesis by the ZO-1-regulated transcription factor ZONAB/DbpA. Mol Cell Biol. 26, 2387-2398 (2006).
  8. Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).
  9. Barthe, L., Woodley, J. F., Kenworthy, S., Houin, G. An improved everted gut sac as a simple and accurate technique to measure paracellular transport across the small intestine. European journal of drug metabolism and pharmacokinetics. 23, 313-323 (1998).
  10. Marks, E., et al. Oral Delivery of Prolyl Hydroxylase Inhibitor: AKB-4924 Promotes Localized Mucosal Healing in a Mouse Model of Colitis. Inflammatory bowel diseases. 21, 267-275 (2015).
  11. Keely, S., et al. Hypoxia-inducible factor-dependent regulation of platelet-activating factor receptor as a route for gram-positive bacterial translocation across epithelia. Mol Biol Cell. 21, 538-546 (2010).
  12. Brayden, D. J., Bzik, V. A., Lewis, A. L., Illum, L. CriticalSorb promotes permeation of flux markers across isolated rat intestinal mucosae and Caco-2 monolayers. Pharmaceutical research. 29, 2543-2554 (2012).
  13. Hubbard, D., Ghandehari, H., Brayden, D. J. Transepithelial transport of PAMAM dendrimers across isolated rat jejunal mucosae in ussing chambers. Biomacromolecules. 15, 2889-2895 (2014).
  14. Keely, S., et al. In vitro and ex vivo intestinal tissue models to measure mucoadhesion of poly (methacrylate) and N-trimethylated chitosan polymers. Pharmaceutical research. 22, 38-49 (2005).
  15. Maher, S., et al. Evaluation of intestinal absorption enhancement and local mucosal toxicity of two promoters. I. Studies in isolated rat and human colonic mucosae. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 38, 291-300 (2009).
  16. Balda, M. S., et al. Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein. The Journal of cell biology. 134, 1031-1049 (1996).
  17. Behrens, I., Stenberg, P., Artursson, P., Kissel, T. Transport of lipophilic drug molecules in a new mucus-secreting cell culture model based on HT29-MTX cells. Pharmaceutical research. 18, 1138-1145 (2001).
  18. Stefka, A. T., et al. Commensal bacteria protect against food allergen sensitization. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 13145-13150 (2014).
  19. Keely, S., et al. Activated fluid transport regulates bacterial-epithelial interactions and significantly shifts the murine colonic microbiome. Gut microbes. 3, 250-260 (2012).
  20. Barrett, K. E., Keely, S. J. Chloride secretion by the intestinal epithelium: molecular basis and regulatory aspects. Annual review of physiology. 62, 535-572 (2000).
  21. Soni, J., et al. Rat, ovine and bovine Peyer's patches mounted in horizontal diffusion chambers display sampling function. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 115, 68-77 (2006).
  22. Justino, P. F., et al. Regulatory role of Lactobacillus acidophilus on inflammation and gastric dysmotility in intestinal mucositis induced by 5-fluorouracil in mice. Cancer chemotherapy and pharmacology. (2015).
  23. Tran, C. D., Sundar, S., Howarth, G. S. Dietary zinc supplementation and methotrexate-induced small intestinal mucositis in metallothionein-knockout and wild-type mice. Cancer biology & therapy. 8, 1662-1667 (2009).
  24. Musch, M. W., Wang, Y., Claud, E. C., Chang, E. B. Lubiprostone decreases mouse colonic inner mucus layer thickness and alters intestinal microbiota. Digestive diseases and sciences. 58, 668-677 (2013).
<em>فيفو السابقين</em> المعوية الحويصلات لتقييم الأغشية المخاطية النفاذية في نماذج من الأمراض المعوية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mateer, S. W., Cardona, J., Marks, E., Goggin, B. J., Hua, S., Keely, S. Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease. J. Vis. Exp. (108), e53250, doi:10.3791/53250 (2016).More

Mateer, S. W., Cardona, J., Marks, E., Goggin, B. J., Hua, S., Keely, S. Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease. J. Vis. Exp. (108), e53250, doi:10.3791/53250 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter