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Medicine

पूर्व vivo आंतों थैलियों जठरांत्र रोग के मॉडल में श्लैष्मिक पारगम्यता का आकलन करने के लिए

doi: 10.3791/53250 Published: February 9, 2016

Abstract

उपकला बाधा जठरांत्र पथ के पहले जन्मजात बचाव है और चुनिंदा, अंतर्निहित ऊतक डिब्बों को लुमेन से परिवहन को नियंत्रित करता है उपकला भर में छोटे अणुओं और लगभग पूरी तरह से उपकला macromolecular परिवहन पर रोक लगाने के परिवहन सीमित। इस चयनात्मकता श्लेष्मा जेल परत है, जो lipophilic अणुओं और दोनों शिखर रिसेप्टर्स और उपकला की तंग जंक्शनल प्रोटीन परिसरों के परिवहन की सीमा से निर्धारित होता है। इन विट्रो उपकला के सेल संस्कृति मॉडल सुविधाजनक हैं, लेकिन एक मॉडल के रूप में, वे कमी माइक्रोबायोटा, श्लेष्मा-जेल, उपकला और प्रतिरक्षा प्रणाली के बीच बातचीत की जटिलता। दूसरी ओर, अवशोषण आंतों या पारगम्यता के vivo मूल्यांकन "आंतों की थैलियों" का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन इन assays समग्र जठरांत्र अवशोषण को मापने, साइट विशिष्टता के कोई संकेत नहीं है। पूर्व vivo पारगम्यता assays; , या तो समग्र आंतों अखंडता या एक विशेष अणु का तुलनात्मक परिवहन मापने आंतों साइट विशिष्टता का जोड़ा लाभ के साथ की एक तेजी से और संवेदनशील तरीका है। यहाँ हम पारगम्यता अध्ययन के लिए आंतों की थैलियों की तैयारी और स्पष्ट पारगम्यता (पी एपीपी) की गणना का वर्णन आंत्र बाधा पार एक अणु की। इस तकनीक को जठरांत्र रोग के पशु मॉडल में क्षेत्रीय उपकला बाधा रोग की जांच करने के आकलन दवा अवशोषण की एक विधि के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, या।

Introduction

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जठरांत्र संबंधी मार्ग की आंतों उपकला बाधा एक mucosal सतह मानव वयस्क में 400 एम 2 का अनुमान लगाया क्षेत्र है। नतीजतन, यह लगातार रोगाणुओं, जाता दवाओं, पोषक तत्वों और विषाक्त पदार्थों को जीवाणु से चुनौती से अवगत कराया है। मेजबान केवल सहनीय खानेवाला बैक्टीरिया और संभावित रोगजनकों के बीच भेद नहीं करना चाहिए, लेकिन एक ही समय में पोषक तत्वों का अवशोषण की इजाजत दी, उपकला बाधा पार करने से इन प्रजातियों और उनके स्रावित अणुओं को रोकने चाहिए। इस प्रकार, आंतों उपकला की भूमिका ल्यूमिनल सामग्री 1 करने के लिए एक बाधा के रूप में कार्य करने के लिए चयनात्मक है। इस भाग में हासिल की है, म्यूकोसा में जन्मजात उपकला रक्षा प्रणाली है, जो विधान और inducible तंत्र 2 से मिलकर एक संवेदनशील जैविक प्रणाली के माध्यम से कार्य करता है।

उपकला बाधा समारोह के नुकसान एक विकृति है कि जठरांत्र रोगों के एक नंबर की विशेषता है। विवो मेंउपकला बाधा समारोह की परीक्षा एक अनुरेखक अणु की मौखिक gavage और बाद में सीरम विश्लेषण 3 के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकता है। हालांकि, इस तकनीक बाधा रोग के स्थल के रूप में कोई संकेत प्रदान करता है। इन विट्रो और पूर्व vivo Transwell सिस्टम 3 का उपयोग और क्रमश: 4,5 कक्षों ussing transepithelial प्रतिरोध के मूल्यांकन में, आमतौर पर उपकला बाधा समारोह के किराए की मार्कर के रूप में कार्यरत हैं, लेकिन पशु मॉडल 6 का योगदान रोग शरीर क्रिया विज्ञान कमी कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल में हम एक पूर्व vivo ऊतक तैयारी मॉडल है कि आंतों की अखंडता और जो स्तरों के एक नंबर पर श्लैष्मिक बाधा समारोह का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की प्रत्यक्ष और स्थानीय मूल्यांकन की अनुमति देता का वर्णन है। महत्वपूर्ण बात है, इस तकनीक को रोग के पशु मॉडल को लागू किया जा सकता है, या औषधीय श्लैष्मिक बाधा रोग की गहराई में पूछताछ की अनुमति के लिए चालाकी से किया जा सकता है।

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Protocol

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इस प्रोटोकॉल में सभी जानवर काम प्रक्रियाओं को मंजूरी दे दी न्यूकैसल पशु आचार समिति के विश्वविद्यालय के लिए सख्त पालन के साथ किया जाता है।

1. उपकरण, संस्कृति, मीडिया और व्यंजन की तैयारी

  1. पूर्व गर्म मीडिया 199 (TC199) या Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM), 37 को मीडिया सी। पूर्व आक्सीजन के 95% 2 हे / 5% सीओ 2 के साथ बुदबुदाती माध्यम। चेक मध्यम 7.3 के अंतिम पीएच है।
  2. प्रत्येक थैली के लिए दो वर्गों 5 सेमी काटने से सिवनी तैयार करें। लूप एक खुला हुआ गाँठ में टांके।

2. विच्छेदन और जठरांत्र संबंधी मार्ग की तैयारी

  1. इच्छामृत्यु से पहले ठोस आहार 12 घंटा वापस ले लें। अगर वांछित, इस समय के दौरान पोषक तत्वों की जेल की खुराक पर जानवरों जगह है।
  2. सोडियम pentobarbitone अधिक मात्रा द्वारा चूहों euthanize ([200 मिलीग्राम / किग्रा], intraperitoneal इंजेक्शन) संस्थागत नैतिकता आद्य के अनुसार गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बादकर्नल स्प्रे और पेट और छाती पर 70% इथेनॉल।
  3. एक कैंची का प्रयोग, पेट के बीच में एक क्षैतिज चीरा बनाने के लिए और पेरिटोनियम बेनकाब।
  4. अलग करने के लिए और जठरनिर्गम दबानेवाला यंत्र में पेट से ऊपरी छोटी आंत काटने और गुदा कगार पर बड़ी आंत काटने से जठरांत्र संबंधी मार्ग को हटाने के लिए आगे बढ़ें। एक संदंश का प्रयोग धीरे अन्त्रपेशी हटा दें। पूर्व गर्म, ऑक्सीजन माध्यम में आंत्र पथ रखें।
  5. आंत की धारा को पहचानें पारगम्यता (चित्रा 1) के लिए मूल्यांकन और इस खंड आंत्र पथ के बाकी हिस्सों से मुक्त कटौती करने के लिए।
    1. आदेश में, जानवरों के बीच निरंतरता बनाए रखने के पेट में ग्रहणी और सूखेपन रिश्तेदार के वर्गों को मापने, और cecum करने के लिए पेट के और लघ्वान्त्र रिश्तेदार के वर्गों को मापने के लिए।
    2. जब ऊतक खंडों का चयन, ऐसे Peyer पैच के रूप में म्यूकोसा जुड़े लसीकावत् ऊतकों की उपस्थिति ध्यान दें। इन छोटे मंजूरी के रूप में पहचाना जा सकता हैलुमेन के serosal पक्ष पर ules।
    3. 1 मिलीलीटर सिरिंज का प्रयोग, धीरे पूर्व गर्म पीबीएस (37 डिग्री सेल्सियस) के साथ एक पेट्री डिश में आंतों खंड की luminal सामग्री फ्लश। ये मल सामग्री खारिज किया जा सकता है या संग्रहीत -80 भविष्य के विश्लेषण के लिए ° सी के रूप में वांछित।

3. आंतों थैलियों की तैयारी

  1. परीक्षण यौगिक या अणु के एक 300 μl मात्रा के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज तैयार करें। श्लैष्मिक अखंडता, एक 1 मिलीग्राम / FITC-dextran M.Wt. मिलीलीटर समाधान के लिए 4400 में इस्तेमाल किया जा सकता है। 4,400-70,000 दा से आकार में लेकर जांच वृद्धि की संवेदनशीलता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सुरक्षित सिरिंज पर एक छोटा सा जानवर संवहनी कैथेटर फिट बैठते हैं।
  2. उपाय आंतों खंड के उद्घाटन से 5 सेमी और खंड टाई सुरक्षित रूप से इस बिंदु पर एक सिवनी-पाश के साथ बंद हुआ। धीरे आंत के उद्घाटन के आसपास एक पूर्व बंधे सिवनी-पाश जगह और पा कैथेटर डालने। फंदा बंद कर दिया खींचो के रूप में तो आंतों खंड सुरक्षित करने के लिएऔर आंत में सिरिंज से 300 μl मात्रा जारी है, यह सुनिश्चित करना कि सभी समाधान इंजेक्ट किया जाता है।
  3. जबकि एक साथ आंतों थैली के बंद होने से सुरक्षित करने के लिए सिवनी फंदा खींच धीरे कैथेटर को हटा दें। आंतों की थैली आंत से ढीला में कटौती और एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ऑक्सीजन माध्यम के 20 मिलीलीटर से भरा ट्यूब, 37 तक के लिए छोड़ देते में जगह सी।

4. पारगम्यता के मापन

  1. प्लेस शंक्वाकार एक गर्म पानी के स्नान में आंतों की थैलियों युक्त ट्यूबों 37 के लिए सेट सी। 0, 30, 60, 90 और 120 मिनट का समय बिंदुओं पर, प्रत्येक उदाहरण में ताजा मीडिया के 100 μl के साथ मात्रा की जगह, शंक्वाकार ट्यूब और एक 96 अच्छी तरह से थाली करने के लिए स्थानांतरण से एक 100 μl नमूना ले।
  2. बाद अंतिम नमूना लिया जाता है, सीवन के बिंदु पर और खंड की लंबाई नीचे खुला थैलियों में कटौती, mucosal सतह उजागर।
  3. लंबाई और प्रत्येक आंतों खंड की चौड़ाई को मापने। अगर देसीलाल, स्नैप -80 में खंडों और दुकान फ्रीज प्रोटीन या जैव रासायनिक विश्लेषण, या वैकल्पिक रूप से, दुकान आणविक assays के लिए आरएनए स्थिरीकरण के लिए समाधान में सें।
  4. FITC टैग 1 से 1 एक्स 10 -6 को लेकर अणुओं के लिए लॉग dilutions की एक मानक वक्र का निर्माण।
  5. एक फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर पर उपाय के नमूने और FITC के लिए मानकों, FITC / उत्तेजना उत्सर्जन: 495 एनएम / 519 एनएम।

प्रत्येक व्यक्ति आंतों सैक के लिए स्पष्ट पारगम्यता की गणना 5.

  1. सेकंड कन्वर्ट करने के लिए समय इकाइयों।
  2. हर समय बिंदु के लिए, संचयी एकाग्रता, क्यू की गणना

    क्यू टी = (सी टी वी आर *) + (क्यू टी योग * वी एस),
    कहां:

    क्यू टी = समय टी में संचयी एकाग्रता
    सी टी = समय टी में एकाग्रता
    वी आर = रिसीवर पक्ष में खंड
    सभी पिछले क्यू टी क्यू टी योग = योग
    वी एस =खंड जांचा
  3. बनाम समय (टी) प्लॉट क्यू और ढलान की गणना: δQ / δt
  4. स्पष्ट पारगम्यता की गणना (पी एपीपी)

    पी एप्लिकेशन = (δQ / δt) / (एक * सह), कहां:

    ऊतक के एक = क्षेत्र
    सी 0 = प्रारंभिक एकाग्रता

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Representative Results

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इस प्रोटोकॉल जठरांत्र रोग के पशु मॉडल में आंत्र बाधा समारोह में क्षेत्रीय परिवर्तन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। जठरांत्र पथ 7 के अलग क्षेत्रों में श्लैष्मिक सतह भर में एक paracellular जांच के प्रवाह को मापने के द्वारा, उपकला तंग जंक्शनों की अखंडता का आकलन किया जा सकता है। इसके अलावा, चित्रा (2) या hydrophobicity (चित्रा 3), उपकला गड़बड़ी की डिग्री है, या श्लेष्मा जेल परत की अखंडता आकार से paracellular जांच की प्रकृति अलग से भी मापा जा सकता है। बड़ा आणविक वजन मार्कर को रोजगार म्यूकोसा की paracellular पारगम्यता की एक और अधिक संवेदनशील पूछताछ के लिए अनुमति देता है, विचारशील परिवर्तन, कि इस तरह के transepithelial विद्युत प्रतिरोध (तीर) के रूप में electrophysiological माप से स्पष्ट नहीं हो सकता है का पता लगाने, लेकिन जो paracellular परिवहन की अनुमति देने के लिए पर्याप्त होगा (चित्रा 2)। mucoसाल सूजन सुरक्षात्मक श्लेष्मा जेल है कि सामान्य रूप से overlies और उपकला इंटरफेस की रक्षा में जाम कोशिकाओं का एक नुकसान और कमी हो सकती है। हाइड्रोफोबिक जांच का प्रयोग, आंतों की म्यूकस जेल परत की अखंडता की भी जांच की जा सकती है (चित्रा 3)। इसके अलावा, क्षेत्रीय अखंडता बाधा अलग आंतों क्षेत्रों से आंतों की थैलियों की विशेष तैयारी के माध्यम से जांच की जा सकती है। बाधा समारोह में क्षेत्रीय परिवर्तन रोग के विभिन्न पशु मॉडल के भीतर भिन्न है और इस प्रकार, आंतों की थैलियों के उपयोग को जब जांच के मौखिक gavage और बाद में सीरम परख की तुलना में, चित्रा (4) आंत्र बाधा समारोह के अनुवादित मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है।

आकृति 1
टी करने के लिए चित्रा 1. murine जठरांत्र संबंधी मार्ग के आरेख। एक C57BL 6 / माउस के जठरांत्र संबंधी मार्ग का एक योजनाबद्ध, पेट सेवह गुदा। छोटी आंतों जंक्शनों आसानी से macroscopically भेदभाव नहीं किया जा सकता है और लगातार नमूना माउस बदलाव करने के लिए माउस को कम मदद मिलती है। आंतों की थैलियों बनाने के प्रयोजनों के लिए, जठरनिर्गम दबानेवाला यंत्र को एक 5 सेमी खंड बाहर का ग्रहणी धरना देंगे। एक 10 सेमी खंड अंधान्त्र से proximally का विस्तार लघ्वान्त्र धरना देंगे। शेष छोटे आंतों के ऊतकों सूखेपन का प्रतिनिधित्व करता है। मलाशय, गुदा के 2 सेमी समीपस्थ स्थित है शेष बड़ी आंत के साथ, अंधान्त्र पेट के 8 का प्रतिनिधित्व करने के लिए बढ़ा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्र 2।   आकार पर निर्भर FITC-dextran अणुओं के paracellular परिवहन हालांकि नियंत्रण और डीएसएस कोलाइटिस एनिमा में उपकला म्यूकोसारास। आंतों की थैलियों DSS चूहों के कॉलन रोग के पाठ्यक्रम में 10 दिनों से तैयार थे। थैलियों 1 मिलीग्राम / FD-4 (4,400 मेगावाट दा) की मिलीलीटर समाधान, एफडी -20 (मेगावाट 20,000 दा) या एफडी-70 (70,000 दा) और प्रवाह FITC-dextran पारगम्यता मार्कर के 120 मिनट से अधिक मापा गया था के साथ भरी हुई थी। स्वस्थ पशुओं से मिलान उम्र नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया। एन = 5, एन प्रति 2 तकनीकी प्रतिकृति ** पी <0.01, छात्र की टी परीक्षण। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्र तीन:। हाइड्रोफोबिक यौगिकों को बाधा अखंडता पर श्लेष्मा जेल परत के प्रभाव। आंतों की थैलियों DSS चूहों के कॉलन रोग के पाठ्यक्रम में 10 दिनों से तैयार थे। स्वस्थ पशुओं से मिलान उम्र नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया। नकारात्मक श्लेष्मा जेल नियंत्रण के लिए, आंतों10 मिमी एन एसिटाइल सिस्टीन (एनएसी) (आंत के 5 सेमी प्रति 300 μl मात्रा) के साथ भरी हुई थी और 37 में incubated 15 मिनट के लिए ° सी और ताजा माध्यम से प्लावित पहले थैलियों तैयार थे। थैलियों FD-4 के 1 मिलीग्राम / एमएल समाधान (4,400 मेगावाट दा) और प्रवाह 120 मिनट से अधिक मापा साथ भरी हुई थी। एन = 3, प्रति एन * पी ​​<0.05 2 तकनीकी प्रतिकृति, ** पी <0.01, छात्र की टी परीक्षण। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. क्षेत्रीय आंतों में सूजन की murine मॉडल में एफडी से 4 आंत की पारगम्यता। आंतों की थैलियों सूखेपन, लघ्वान्त्र या स्वस्थ जानवर, डीएसएस जानवरों या एंटीबायोटिक प्रेरित dysbiosis (सहायता) पशुओं के पेट के से तैयार थे। थैलियों 1 मिलीग्राम FD-4 के / एमएल समाधान के साथ भरी हुई थी (मेगावाट 4,400 दा) और चलक्स 120 मिनट से अधिक मापा। एन = 3, प्रति एन * पी ​​<0.05 2 तकनीकी प्रतिकृति, ** पी <0.01, छात्र की टी परीक्षण। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

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यहाँ, हम श्लैष्मिक बाधा समारोह पूर्व vivo का आकलन करने के अलगाव और आंतों की थैलियों की तैयारी विस्तृत है। आंतों थैली तैयारियों मुख्य रूप से दवा अनुसंधान के क्षेत्र में उपयोग किया गया है, आंत भर में उम्मीदवार दवाओं के अवशोषण की जांच। हालांकि, इस परख भी उतना ही अच्छा आंत्र रोग के अध्ययन के लिए अनुकूल है। आंतों पारगम्यता क्षेत्र और पारगम्यता की साइट विशिष्ट आकलन से बहुत भिन्न हो सकते हैं पाचन रोगों में श्लैष्मिक अखंडता के क्षेत्रीय महत्व के एक बेहतर समझ की अनुमति देता है। परख मजबूत है और सही शारीरिक शर्तों के तहत, पृथक ऊतकों अप करने के लिए 6 घंटा पोस्टमार्टम के लिए व्यवहार्य रहते हैं। इच्छामृत्यु के बाद, ऊतक तैयार करने की गति महत्वपूर्ण है और आंत इसकी सामग्री के प्लावित और संभव के रूप में तेजी से ऑक्सीजन युक्त मध्यम करने के लिए स्थानांतरित किया जाना चाहिए। आदेश में पशुओं के बीच स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए, यह जरूरी है कि सही आंतों क्षेत्रों identifi हैंएड (चित्रा 1)। यह सलाह दी जाती है कि colonic और ileal क्षेत्रों, अंधान्त्र से मापा जाता है, जबकि ग्रहणी और सूखेपन के क्षेत्रों पेट से मापा जाता है। क्योंकि विभिन्न प्रकारों, मॉडल या ट्रांसजेनिक जानवरों बड़ा हो सकता है, और अब GITS है, यह पारगम्यता assays में उलझाने से पहले अपने मॉडल में औसत लंबाई या प्रत्येक आंतों खंड निस्र्पक के लायक है।

क्षेत्रीय स्थिरता के लिए इसके अलावा, यह सुनिश्चित करें कि प्रत्येक आंतों थैली बराबर लंबाई में कटौती कर रहा है और थैली तरल पदार्थ की सही मात्रा के साथ भरा है महत्वपूर्ण है। इन कारकों में विसंगति assays के बीच म्यूकोसा के असमान बढ़ाव में परिणाम होगा। अंडर बढ़ाव आंतों खंड की न केवल mucosal सतह को ल्यूमिनल सामग्री के जोखिम को कम करता है, लेकिन यह भी ऊतक जिसके माध्यम से यात्रा करना चाहिए मार्कर की मोटाई बढ़ जाती है। ओवर-बढ़ाव खंड के ऊतकों में ऊतकों को नुकसान या तनाव प्रतिक्रियाओं को सक्रिय कर सकते, संभावित सह कीNfounding का परिणाम है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए, उस के लिए पी एप्लिकेशन की गणना विलस संरचना की सतह क्षेत्र के लिए खाते में नहीं है। इस ऊतक के वास्तविक स्पष्ट पारगम्यता की गणना में त्रुटि की ओर जाता है, यह, मॉडलों के बीच तुलनात्मक परिणाम को प्रभावित नहीं करता है के रूप में सतह क्षेत्र एक निरंतर रूप में गणना की है। बीमारी के कारण सतह के क्षेत्र में कोई भी परिवर्तन उपकला अखंडता के नुकसान की भरपाई कर रहे हैं और प्रोटोकॉल रोग प्रगति 6 के साथ पारगम्यता में परिवर्तन की पहचान करने के लिए पर्याप्त रूप से मजबूत है।

ऊतक संस्कृति के माध्यम के उपयोग की सिफारिश की है। BARTHE एट अल द्वारा किया जाता अध्ययन में। TC199 का उपयोग काफी उपकला ऊतक व्यवहार्यता और ऊतकीय वास्तुकला, की लंबी उम्र बढ़ाने के लिए जब साधारण नमक बफ़र्स 9 की तुलना में मिला था। हमारे अध्ययन में दोनों DMEM और मध्यम TC199 37 पर बनाए रखा डिग्री सेल्सियस टिशू अस्तित्व 5,6,10 के लिए इष्टतम स्थितियों प्रदान की है। सही मीडिया, ऊतक अखंडता को बनाए रखने के लिए आवश्यक पोषक तत्वों के साथ उपकला की आपूर्ति जबकि परख के दौरान तापमान को बनाए रखने के इष्टतम ऊतक चयापचय जो आवश्यक तंग जंक्शनल अखंडता और transcellular रास्ते के माध्यम से सक्रिय परिवहन को शामिल assays है सुनिश्चित करता है। 37 से नीचे तापमान ऊतक व्यवहार्यता की डिग्री सेल्सियस कारण हानि, paracellular परिवहन बढ़ रही है और transcellular परिवहन 11 कम। इस प्रकार, इष्टतम शर्तों के साथ ऊतक व्यवहार्यता के समय को बढ़ाने के लिए आवश्यक है और ऐसा करने में, परख क्षेत्रीय बाधा अखंडता और जांच करने के लिए न केवल इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह भी हस्तक्षेप अध्ययन और शारीरिक और transcriptional प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए।

मुख्य रूप से दवा अवशोषण अध्ययन के लिए इस्तेमाल करते हैं, तकनीक एक उपकला बाधा पार एक मार्कर अणु के स्पष्ट पारगम्यता (पी एपीपी) की जांच के लिए आंतों की अखंडता को 12-15 के एक बेहद संवेदनशील माप कर रहे हैं। इसके विपरीत में किराए के लिए पूर्व vivo measuremeइस तरह के तीर के रूप में बाधा समारोह के एनटीएस, पी एप्लिकेशन आंत्र बाधा 4 का एक सीधा और बेहद संवेदनशील माप है। यह ध्यान देने योग्य है कि Teer माप और पारगम्यता के रूप में मार्कर अणुओं के पी एप्लिकेशन द्वारा मापा हमेशा मेल नहीं खाते हैं लायक है। Teer माप दोनों तंग जंक्शनों और transcellular समानांतर प्रतिरोधों 16 के प्रतिरोध धरना। इसलिए Teer तंग जंक्शनों और कोशिकाओं को स्वयं द्वारा की पेशकश की संयुक्त प्रतिरोध की एक माप है। सेल सेल संघों कमजोर कर रहे हैं (जो है, तंग जंक्शनों टपकाया) कर रहे हैं तो एक monolayer के समग्र प्रतिरोध करने के लिए इस योगदान कम हो जाएगा। इस प्रकार टपकाया उपकला के लिए तंग जंक्शनल resistances में छोटे परिवर्तन एक पूरे के रूप में उपकला के प्रतिरोध के लिए नगण्य परिवर्तन हो जाते हैं। इसके विपरीत, पी एप्लिकेशन assays श्लैष्मिक बाधा पार 17 और वास्तव में करने के लिए एक अणु की क्षमता, पी एप्लिकेशन माप की संवेदनशीलता अल हो सकता है मापनेअलग अलग आकार के अणुओं मार्कर (चित्रा 1) के चयन के माध्यम से tered। मार्कर आकार के विचार आंत्र रोग के मॉडल के संबंध में महत्वपूर्ण जांच की जा रही है। एलर्जी या कार्यात्मक रोग 18,19, जहां अखंडता के नुकसान उदारवादी हल्के है, की मॉडल और अधिक कम आणविक वजन मार्कर, जो आंतों बाधा समारोह को सूक्ष्म परिवर्तनों की पहचान के लिए अनुमति देगा के लिए उपयुक्त हो सकता है। इसके विपरीत, इस तरह के डीएसएस कोलाइटिस, जो आंतों उपकला के denuding शामिल है के रूप मॉडलों के साथ, बड़ा मार्कर अधिक उपयुक्त है, श्लैष्मिक चिकित्सा का आकलन करने के रूप में बाधा अखंडता में अपेक्षाकृत छोटे बढ़ जाती है पर प्रकाश डाला जाएगा हो सकता है।

जबकि आंतों की थैलियों सैनिक बाधा समारोह की एक physiologically प्रासंगिक मॉडल प्रस्तुत करते हैं, वहाँ पशु मॉडल जो विचार करने की आवश्यकता की परिवर्तनशीलता के संबंध में कुछ सीमाएं हैं। उदाहरण के लिए, स्रावी राज्य या उपकला intes भर में दोनों paracellular परिवहन प्रभावित कर सकते हैंशाखा 20 और श्लेष्मा जेल परत 5 की अखंडता। पूर्व vivo assays ऐसे ussing चैम्बर की तैयारी के रूप में electrophysiological माप, शामिल है, इस के लिए खाते सकता है, आंतों की थैलियों को नहीं है। दूसरे, आंतों की थैलियों के शोधकर्ताओं की तैयारी, थैली की तैयारियों के भीतर, इस तरह के Peyer पैच के रूप में लसीकावत् संरचनाओं, के लिए खाते के रूप में इन ऊतक 21 की पारगम्यता प्रभावित कर सकते हैं चाहिए। इन विचारों के बावजूद, कई सेल संस्कृति मॉडल, उपकला अखंडता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल के विपरीत, आंतों की थैलियों दोनों एक चिपचिपा जेल परत और एक अंतर्निहित लामिना propria के योगदान की पेशकश करते हैं। श्लेष्मा जेल परत का योगदान है, विशेष रूप से, इस तरह के dexamethasone 5,17 के रूप में ऐसी एन एसिटाइल सिस्टीन, या हाइड्रोफोबिक दरियाफ्त अणुओं के रूप में mucolytic एजेंटों, के उपयोग के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकता है। यह कैंसर के उपचार या सूजन आंत्र रोग के मॉडल में आंतों पारगम्यता का आकलन करने में विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो सकता है, wयहाँ श्लेष्मा बाधा के नुकसान श्लैष्मिक सूजन 22,23 में एक प्रारंभिक विकृति हो सकता है। इसी तरह, डायरिया रोग, कार्यात्मक सैनिक रोग या dysbiosis, आंतों बलगम उत्पादन और समग्र श्लेष्मा जेल अखंडता के मॉडल में क्षेत्रीय साइटों 5,19,24 में बदला जा सकता है। पारगम्यता मार्करों और बाद में सीरम के नमूने की मौखिक gavage विवो में आंतों पारगम्यता का आकलन करने के लिए एक और विकल्प है। हालांकि इस पद्धति के ऊतकों की न्यूनतम हेरफेर किया है, यह आंतों बाधा समारोह की एक समग्र उपाय है और यह समग्र बाधा को क्षेत्रीय योगदान का आकलन नहीं करता। सैनिक रोग के विभिन्न मॉडलों के सापेक्ष महत्व है जो मौखिक gavage दृष्टिकोण के हिसाब से नहीं लिया जाएगा के विभिन्न साइटों है की संभावना है। आंतों की थैलियों का उपयोग करते हैं, इसलिए एक तेजी से, संवेदनशील और physiologically प्रासंगिक परख जो रोग के छोटे पशु मॉडल में क्षेत्रीय आंतों श्लैष्मिक अखंडता की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dekantel  Non-absorbable Silk suture Braintree Scientific SUT-S 116
Media 199 (TC199)  Life Technologies 11043-023 No phenol red as this interferes with fluorescence
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies 21063-045 No phenol red as this interferes with fluorescence
N-acetylcysteine Sigma Aldrich Use at 10 mM in media
Small animal vascular cathether: Physiocath Data Sciences International 277-1-002
FITC-Dextran 4,400 MW Sigma Aldrich FD-4
FITC-Dextran 20,000 MW Sigma Aldrich FD-20
FITC-Dextran 70,000 MW Sigma Aldrich FD-70

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References

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<em>पूर्व vivo</em> आंतों थैलियों जठरांत्र रोग के मॉडल में श्लैष्मिक पारगम्यता का आकलन करने के लिए
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Mateer, S. W., Cardona, J., Marks, E., Goggin, B. J., Hua, S., Keely, S. Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease. J. Vis. Exp. (108), e53250, doi:10.3791/53250 (2016).More

Mateer, S. W., Cardona, J., Marks, E., Goggin, B. J., Hua, S., Keely, S. Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease. J. Vis. Exp. (108), e53250, doi:10.3791/53250 (2016).

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