Ex Vivo Bağırsak Sacs Gastrointestinal Hastalık Modelleri mukozal geçirgenliği Değerlendirmek için
Summary
This protocol describes the use of excised intestinal tissue preparations or “intestinal sacs” as an ex vivo model of intestinal barrier function. This model may be used to assess integrity of both the epithelial barrier and the mucous gel layer at specific intestinal sites in animal models of digestive disease.
Abstract
epitelyal bariyer gastrointestinal sistemin ilk doğal savunma ve seçici küçük epitel boyunca moleküller ve neredeyse tamamen epitel makromoleküler taşıma yasaklayan taşınmasını kısıtlayan, altta yatan doku bölmelerine lümenin ulaşım düzenler. Bu seçicilik, lipofilik moleküller ve hem apikal reseptörleri ve epitelyumun dar kavşak protein kompleksleri taşıma sınırlar mukoza jel tabakası ile tespit edilir. Epitel in vitro hücre kültürü modelleri uygun olmakla birlikte, bir model olarak, bu eksikliği Mikrobiyota, mukoza-jel, epitel ve bağışıklık sistemi arasındaki etkileşimlerin karmaşıklığı. Öte yandan, alana özgü hiçbir gösterge ile bağırsak emilim veya geçirgenlik in vivo değerlendirilmesi gerçekleştirilebilir, ancak bu deneyler, genel olarak mide-bağırsak absorpsiyonu ölçülür. Ex vivo geçirgenlik deneyleri "intestinal kesesi" kullanılarak; Bağırsak sitesi özgüllük avantajıyla genel bağırsak bütünlüğü veya belirli bir molekülün karşılaştırmalı taşınmasını ya ölçme hızlı ve hassas bir yöntemdir. Burada geçirgenlik çalışmaları için bağırsak keseleri hazırlanması ve belirgin geçirgenlik (P app) hesaplanmasını tarif intestinal bariyer boyunca bir molekülün. Bu teknik değerlendirme ilaç emiliminin bir yöntem olarak kullanılabilir, ya da gastrointestinal hastalıkların hayvan modellerinde bölge epitelyal bariyer yetmezliği incelemek.
Introduction
Mide-bağırsak sisteminin intestinal epitelyal bariyer Yetişkin bir insanda, 400 m2'de yaklaşık mukozal yüzey alanıdır. Sonuç olarak, sürekli mikrop, yutulan ilaç, besin ve bakteriyel toksinler karşı maruz kalmaktadır. ev sahibi sadece tolere ortakçı bakteri ve potansiyel patojenler arasında ayrım olmamalıdır, ama aynı zamanda besinlerin emilimini sağlarken, epitel bariyerini geçen bu türlerin ve salgılanan molekülleri engellemek gerekir. Bu nedenle, bağırsak epiteli rolü lümen içeriği 1 için seçici bir bariyer olarak hareket etmektir. Bu kurucu ve uyarılabilir mekanizma 2 oluşan bir yanıt biyolojik sistem yoluyla hareket mukozada doğuştan gelen epitel savunma sistemi tarafından, kısmen, elde edilir.
Epitelyal bariyer işlevinin kaybı gastrointestinal hastalıkların bir dizi özelliği olan bir patolojidir. In vivoepitelyal bariyer fonksiyonunun incelenmesi bir izleme molekülünün oral sonda ve sonraki serum analizi 3 ile değerlendirilebilir. Ancak, bu teknik bariyer disfonksiyonu siteye hiçbir gösterge sunar. In vitro ve Transwell sistemlerini 3 kullanılarak sırasıyla odaları 4,5 Ussing transepitelyal direnci ex vivo değerlendirmede, yaygın epitelyal bariyer fonksiyonunun taşıyıcı belirteç olarak kullanılan, ancak hayvan modellerinde 6 katkıda hastalık fizyolojisini yoksundur. Bu protokolde düzeylerde bir dizi mukozal bariyer fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılabilecek bağırsak bütünlüğü ve doğrudan ve lokalize değerlendirmesini sağlayan bir ex vivo doku hazırlama modeli açıklanmaktadır. Önemli olarak, bu teknik, hastalığın hayvan modellerinde de uygulanabilir, veya farmakolojik olarak mukozal bariyer işlev bozukluğu derinliği sorgusunda izin vermek için manipüle edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, mukozal bariyer fonksiyonunu ex vivo değerlendirmek için izolasyon ve bağırsak keselerinin hazırlanmasını ayrıntılı var. Bağırsak kese hazırlıkları öncelikle bağırsak boyunca aday ilaçların emilimini inceleyerek, ilaç araştırma faydalanılmıştır. Bununla birlikte, bu deney, eşit ölçüde iyi barsak hastalığı çalışma için uygundur. bölge ve geçirgenlik sahaya özgü değerlendirilmesi ile büyük ölçüde değişebilir bağırsak geçirgenliği sindirim hastalıklar?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by National Health and Medical Research Project Grant APP1021582 and a Hunter Medical Research Institute grant sponsored by Sparke Helmore/NBN Triathlon and the Estate of the late Leslie Kenneth McFarlane.
Materials
| Dekantel Non-absorbable Silk suture | Braintree Scientific | SUT-S 116 | |
| Media 199 (TC199) | Life Technologies | 11043-023 | No phenol red as this interferes with fluorescence |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 21063-045 | No phenol red as this interferes with fluorescence |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | Use at 10mM in media | |
| Small animal vascular cathether: Physiocath | Data Sciences International | 277-1-002 | |
| FITC-Dextran 4400 MW | Sigma Aldrich | FD-4 | |
| FITC-Dextran 20,000 MW | Sigma Aldrich | FD-20 | |
| FITC-Dextran 70,000 MW | Sigma Aldrich | FD-70 |
References
- Goggins, B. J., Chaney, C., Radford-Smith, G. L., Horvat, J. C., Keely, S. Hypoxia and Integrin-Mediated Epithelial Restitution during Mucosal Inflammation. Frontiers in immunology. 4, 272 (2013).
- Otte, J. M., Kiehne, K., Herzig, K. H. Antimicrobial peptides in innate immunity of the human intestine. Journal of gastroenterology. 38, 717-726 (2003).
- Robinson, A., et al. Mucosal protection by hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibition. Gastroenterology. 134, 145-155 (2008).
- Feighery, L., et al. Increased intestinal permeability in rats subjected to traumatic frontal lobe percussion brain injury. The Journal of trauma. 64, 131-137 (2008).
- Keely, S., et al. Chloride-led disruption of the intestinal mucous layer impedes Salmonella invasion: evidence for an ‘enteric tear’ mechanism. Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 28, 743-752 (2011).
- Keely, S., et al. Contribution of epithelial innate immunity to systemic protection afforded by prolyl hydroxylase inhibition in murine colitis. Mucosal immunology. 7, 114-123 (2014).
- Sourisseau, T., et al. Regulation of PCNA and cyclin D1 expression and epithelial morphogenesis by the ZO-1-regulated transcription factor ZONAB/DbpA. Mol Cell Biol. 26, 2387-2398 (2006).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice–part 1. Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).
- Barthe, L., Woodley, J. F., Kenworthy, S., Houin, G. An improved everted gut sac as a simple and accurate technique to measure paracellular transport across the small intestine. European journal of drug metabolism and pharmacokinetics. 23, 313-323 (1998).
- Marks, E., et al. Oral Delivery of Prolyl Hydroxylase Inhibitor: AKB-4924 Promotes Localized Mucosal Healing in a Mouse Model of Colitis. Inflammatory bowel diseases. 21, 267-275 (2015).
- Keely, S., et al. Hypoxia-inducible factor-dependent regulation of platelet-activating factor receptor as a route for gram-positive bacterial translocation across epithelia. Mol Biol Cell. 21, 538-546 (2010).
- Brayden, D. J., Bzik, V. A., Lewis, A. L., Illum, L. CriticalSorb promotes permeation of flux markers across isolated rat intestinal mucosae and Caco-2 monolayers. Pharmaceutical research. 29, 2543-2554 (2012).
- Hubbard, D., Ghandehari, H., Brayden, D. J. Transepithelial transport of PAMAM dendrimers across isolated rat jejunal mucosae in ussing chambers. Biomacromolecules. 15, 2889-2895 (2014).
- Keely, S., et al. In vitro and ex vivo intestinal tissue models to measure mucoadhesion of poly (methacrylate) and N-trimethylated chitosan polymers. Pharmaceutical research. 22, 38-49 (2005).
- Maher, S., et al. Evaluation of intestinal absorption enhancement and local mucosal toxicity of two promoters. I. Studies in isolated rat and human colonic mucosae. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 38, 291-300 (2009).
- Balda, M. S., et al. Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein. The Journal of cell biology. 134, 1031-1049 (1996).
- Behrens, I., Stenberg, P., Artursson, P., Kissel, T. Transport of lipophilic drug molecules in a new mucus-secreting cell culture model based on HT29-MTX cells. Pharmaceutical research. 18, 1138-1145 (2001).
- Stefka, A. T., et al. Commensal bacteria protect against food allergen sensitization. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 13145-13150 (2014).
- Keely, S., et al. Activated fluid transport regulates bacterial-epithelial interactions and significantly shifts the murine colonic microbiome. Gut microbes. 3, 250-260 (2012).
- Barrett, K. E., Keely, S. J. Chloride secretion by the intestinal epithelium: molecular basis and regulatory aspects. Annual review of physiology. 62, 535-572 (2000).
- Soni, J., et al. Rat, ovine and bovine Peyer’s patches mounted in horizontal diffusion chambers display sampling function. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 115, 68-77 (2006).
- Justino, P. F., et al. Regulatory role of Lactobacillus acidophilus on inflammation and gastric dysmotility in intestinal mucositis induced by 5-fluorouracil in mice. Cancer chemotherapy and pharmacology. , (2015).
- Tran, C. D., Sundar, S., Howarth, G. S. Dietary zinc supplementation and methotrexate-induced small intestinal mucositis in metallothionein-knockout and wild-type mice. Cancer biology & therapy. 8, 1662-1667 (2009).
- Musch, M. W., Wang, Y., Claud, E. C., Chang, E. B. Lubiprostone decreases mouse colonic inner mucus layer thickness and alters intestinal microbiota. Digestive diseases and sciences. 58, 668-677 (2013).
