Ex vivo-Darm-Sacs zu beurteilen Durchlässigkeit der Schleimhaut in Modelle von Magen-Darm-Krankheit
Summary
This protocol describes the use of excised intestinal tissue preparations or “intestinal sacs” as an ex vivo model of intestinal barrier function. This model may be used to assess integrity of both the epithelial barrier and the mucous gel layer at specific intestinal sites in animal models of digestive disease.
Abstract
Die epitheliale Barriere ist der erste angeborenen Abwehr des Gastrointestinaltraktes und regelt selektiv Verkehr von dem Lumen zu dem darunter liegenden Gewebe Fächer, den Transport von kleineren Molekülen über das Epithel zu beschränken und nahezu vollständig zu verbieten epithelialen makromolekulare Transport. Diese Selektivität wird durch die Schleimhaut Gelschicht bestimmt, die den Transport von lipophilen Molekülen und sowohl den apikalen Rezeptoren und enge Verbindungsprotein-Komplexe des Epithels begrenzt. In-vitro-Zellkulturmodellen des Epithels sind bequem, aber als ein Modell, es fehlt ihnen die Komplexität der Wechselwirkungen zwischen der Mikroflora, Schleim-Gel, Epithel und Immunsystem. Auf der anderen Seite, in vivo Beurteilung der intestinale Absorption oder Durchlässigkeit kann durchgeführt werden, aber diese Tests insgesamt Magen-Darm-Absorption zu messen, ohne Angabe von Ortsspezifität. Ex-vivo-Durchlässigkeit Tests "Darmsäcken" können; sind eine schnelle und empfindliche Verfahren entweder Gesamtdarm Integrität oder Vergleichs Transport eines spezifischen Moleküls, mit dem zusätzlichen Vorteil der intestinalen Ortsspezifität messen. Hier haben wir die Herstellung von Darmsäcken für Durchlässigkeit Studien und die Berechnung des scheinbaren Durchlässigkeit (P app) beschreiben eines Moleküls durch die Darmbarriere. Diese Technik kann als ein Verfahren zur Beurteilung der Arzneimittelabsorption verwendet werden, oder regional Epithelbarriere Dysfunktion in Tiermodellen von gastrointestinalen Erkrankungen zu untersuchen.
Introduction
Die intestinale epitheliale Barriere des Gastrointestinaltraktes ist Bereich einer Schleimhautoberfläche bei 400 m 2 in dem erwachsenen Menschen geschätzt. Folglich wird es ständig ausgesetzt von Mikroben, eingenommene Drogen, Nährstoffe und bakterielle Toxine in Frage zu stellen. Der Host muss nicht nur zwischen tolerierbaren kommensalen Bakterien und potentielle Pathogene unterscheiden, aber müssen diese Arten und ihre sezernierten Moleküle vor der Kreuzung die Epithelbarriere, während zur gleichen Zeit ermöglicht die Aufnahme von Nährstoffen zu vermeiden. Somit ist die Rolle des Darmepithels als selektive Barriere zu der luminalen Inhalte 1 zu wirken. Dies wird dadurch erreicht, teilweise durch das angeborene epithelialen Abwehrsystem an der Schleimhaut, die eine reaktions biologischen System wirkt über 2 konstitutiver und induzierbarer Mechanismen aus.
Verlust von epithelialen Barrierefunktion ist eine Pathologie, die charakteristisch für eine Reihe von Magen-Darm-Erkrankungen ist. In vivoPrüfung der epithelialen Barrierefunktion kann durch orale Gabe von Tracer-Molekül und anschließende Serumanalyse 3 bewertet werden. Allerdings bietet diese Technik keinen Hinweis auf den Ort der Schrankenstörung. In-vitro- und Ex-vivo-Bewertung der transepithelialen Widerstand mit Transwell-Systeme 3 und Ussing-Kammern 4,5 bzw. werden als Surrogatmarker der epithelialen Barrierefunktion häufig verwendet, aber nicht über die beitragenden Krankheit Physiologie von Tiermodellen 6. In diesem Protokoll beschreiben wir eine ex vivo Gewebepräparationsmodell, das direkte und lokale Bewertung der Darm-Integrität ermöglicht und die verwendet werden können Schleimhautbarrierefunktion in mehreren Ebenen zu beurteilen. Wichtig ist, kann diese Technik zu Tiermodellen von Krankheiten angewendet werden, oder pharmakologisch manipuliert werden kann, in der Tiefe Abfrage von Schleimhaut-Barriere Dysfunktion zu ermöglichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier haben wir die Isolierung und Herstellung von Darmsäcken detailliert Schleimhautbarrierefunktion ex vivo zu beurteilen. Darmsack Vorbereitungen sind in der pharmazeutischen Forschung genutzt, die Prüfung der Aufnahme von Wirkstoffkandidaten über den Darm in erster Linie ist. Allerdings ist dieser Test gleichermaßen gut für die Untersuchung von Darmerkrankungen geeignet. Darmdurchlässigkeit kann stark von Region und standortspezifische Bewertung der Durchlässigkeit ermöglicht ein besseres Verständni…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by National Health and Medical Research Project Grant APP1021582 and a Hunter Medical Research Institute grant sponsored by Sparke Helmore/NBN Triathlon and the Estate of the late Leslie Kenneth McFarlane.
Materials
| Dekantel Non-absorbable Silk suture | Braintree Scientific | SUT-S 116 | |
| Media 199 (TC199) | Life Technologies | 11043-023 | No phenol red as this interferes with fluorescence |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 21063-045 | No phenol red as this interferes with fluorescence |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | Use at 10mM in media | |
| Small animal vascular cathether: Physiocath | Data Sciences International | 277-1-002 | |
| FITC-Dextran 4400 MW | Sigma Aldrich | FD-4 | |
| FITC-Dextran 20,000 MW | Sigma Aldrich | FD-20 | |
| FITC-Dextran 70,000 MW | Sigma Aldrich | FD-70 |
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