Sacs Ex Vivo המעיים להעריך חדירות ריריות מודלים של מחלות במערכת העיכול
Summary
This protocol describes the use of excised intestinal tissue preparations or “intestinal sacs” as an ex vivo model of intestinal barrier function. This model may be used to assess integrity of both the epithelial barrier and the mucous gel layer at specific intestinal sites in animal models of digestive disease.
Abstract
המכשול אפיתל היא ההגנה מולדת הראשונה של מערכת העיכול באופן סלקטיבי מסדיר תחבורה מן לומן אל תאי הרקמה הבסיסית, הגבלת התחבורה של מולקולות קטנות יותר ברחבי האפיתל וכמעט לחלוטין האוסר תחבורה macromolecular אפיתל. סלקטיביות זו נקבעת ע"י שכבת ג'ל הרירי, אשר מגביל את התחבורה של מולקולות lipophilic ושניהם הקולטנים הפסגה ומכלולי חלבון junctional ההדוקים של האפיתל. במודלי תרבית תאים במבחנה של האפיתל הם נוחים, אבל כמודל, הם חסרים את המורכבות של האינטראקציות בין החיידקים, ג'ל רירי, האפיתל ואת המערכת החיסונית. מצד שני, in vivo הערכה של קליטה או חדירות מעי עשויה להתבצע, אבל אלה מבחנים למדוד כוללת קליטת עיכול, ללא ציון סגולי אתר. Ex vivo מבחני חדירות באמצעות "צקי מעיים"; הם שיטה מהירה ורגישה למדידת טוהר מידות מעיים הכלל או תחבורה השוואתית של מולקולה מסוימת, עם יתרון נוסף של סגוליות אתר מעיים. כאן אנו מתארים את הכנת שקי מעיים ללימודי חדירות והחישוב של חדירות לכאורה (אפליקציה P) של מולקולה על פני מחסום המעי. טכניקה זו ניתן להשתמש כשיטה ספיגת תרופות בהערכת, או לבחון תפקוד מחסום האזורי אפיתל במודלים של בעלי חיים של מחלות במערכת העיכול.
Introduction
המכשול אפיתל במעי של מערכת העיכול הוא שטח הפנים הרירית מוערך ב -400 מ '2 ב המבוגר אדם. כתוצאה מכך, היא חשופה כל הזמן לאתגר מחיידקים, תרופות בליעה, חומרים מזינים רעלנים חיידקיים. המארח אסור להבדיל רק בין חיידקי commensal נסבלים פתוגנים פוטנציאליים, אבל חייב למנוע מינים אלה והמולקולות המופרשות שלהם לחצות את מחסום האפיתל, ואילו באותו הזמן המאפשר ספיגת מזון בגוף. לכן, את התפקיד של האפיתל במעי הוא לפעול כמחסום סלקטיבי לתכנים luminal 1. זו המושגת, בין יתר, על ידי מערכת ביטחון אפיתל מולד בבית הרירי, אשר פועלת באמצעות מערכת ביולוגית תגובה המורכבת מנגנוני מכונן מושרים 2.
אובדן תפקוד המחסום אפיתל היא פתולוגית אופיינית של מספר מחלות מערכת העיכול. בשנת vivoבחינת תפקוד המחסום אפיתל ניתן להעריך באמצעות gavage הפה של מולקולה נותב וניתוח בסרום לאחר 3. עם זאת, הטכניקה הזו מציעה שום אינדיקציה לגבי האתר של תפקוד מחסום. במבחנה לשעבר vivo הערכת התנגדות transepithelial באמצעות מערכות Transwell 3 ו Ussing תאי 4,5 בהתאמה, מועסקים בכינויו סמנים פונדקאיים של תפקוד מחסום אפיתל, אך חסרים את פיזיולוגית המחלה התורמת של מודלים של בעלי חיים 6. בפרוטוקול זה אנו מתארים מודל הכנת vivo לשעבר רקמות המאפשר הערכה ישירה ונקודות של שלמות מעיים אשר עשוי לשמש כדי להעריך תפקוד מחסום רירי בכמה רמות. חשוב לציין, טכניקה זו ניתן להחיל במודלים של בעלי חיים של מחלה, או עלולה להיות מניפולציות פרמקולוגית לאפשר בחקירה מעמיקה של תפקוד מחסום רירי.
Protocol
Representative Results
Discussion
הנה, יש לנו מפורטי הבידוד והכנה צקי מעיים להעריך תפקוד מחסום רירי vivo לשעבר. הכנות צק מעיים כבר נוצלו בעיקר במחקר של תרופות, בחינת ספיגת תרופות מועמד מעבר במעי. עם זאת, assay זה מתאים היטב באותה מידה לחקר מחלת מעיים. חדירות מעי עשוי להשתנות במידה רבה בהתאם לאזור והערכ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by National Health and Medical Research Project Grant APP1021582 and a Hunter Medical Research Institute grant sponsored by Sparke Helmore/NBN Triathlon and the Estate of the late Leslie Kenneth McFarlane.
Materials
| Dekantel Non-absorbable Silk suture | Braintree Scientific | SUT-S 116 | |
| Media 199 (TC199) | Life Technologies | 11043-023 | No phenol red as this interferes with fluorescence |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 21063-045 | No phenol red as this interferes with fluorescence |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | Use at 10mM in media | |
| Small animal vascular cathether: Physiocath | Data Sciences International | 277-1-002 | |
| FITC-Dextran 4400 MW | Sigma Aldrich | FD-4 | |
| FITC-Dextran 20,000 MW | Sigma Aldrich | FD-20 | |
| FITC-Dextran 70,000 MW | Sigma Aldrich | FD-70 |
References
- Goggins, B. J., Chaney, C., Radford-Smith, G. L., Horvat, J. C., Keely, S. Hypoxia and Integrin-Mediated Epithelial Restitution during Mucosal Inflammation. Frontiers in immunology. 4, 272 (2013).
- Otte, J. M., Kiehne, K., Herzig, K. H. Antimicrobial peptides in innate immunity of the human intestine. Journal of gastroenterology. 38, 717-726 (2003).
- Robinson, A., et al. Mucosal protection by hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibition. Gastroenterology. 134, 145-155 (2008).
- Feighery, L., et al. Increased intestinal permeability in rats subjected to traumatic frontal lobe percussion brain injury. The Journal of trauma. 64, 131-137 (2008).
- Keely, S., et al. Chloride-led disruption of the intestinal mucous layer impedes Salmonella invasion: evidence for an ‘enteric tear’ mechanism. Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 28, 743-752 (2011).
- Keely, S., et al. Contribution of epithelial innate immunity to systemic protection afforded by prolyl hydroxylase inhibition in murine colitis. Mucosal immunology. 7, 114-123 (2014).
- Sourisseau, T., et al. Regulation of PCNA and cyclin D1 expression and epithelial morphogenesis by the ZO-1-regulated transcription factor ZONAB/DbpA. Mol Cell Biol. 26, 2387-2398 (2006).
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice–part 1. Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).
- Barthe, L., Woodley, J. F., Kenworthy, S., Houin, G. An improved everted gut sac as a simple and accurate technique to measure paracellular transport across the small intestine. European journal of drug metabolism and pharmacokinetics. 23, 313-323 (1998).
- Marks, E., et al. Oral Delivery of Prolyl Hydroxylase Inhibitor: AKB-4924 Promotes Localized Mucosal Healing in a Mouse Model of Colitis. Inflammatory bowel diseases. 21, 267-275 (2015).
- Keely, S., et al. Hypoxia-inducible factor-dependent regulation of platelet-activating factor receptor as a route for gram-positive bacterial translocation across epithelia. Mol Biol Cell. 21, 538-546 (2010).
- Brayden, D. J., Bzik, V. A., Lewis, A. L., Illum, L. CriticalSorb promotes permeation of flux markers across isolated rat intestinal mucosae and Caco-2 monolayers. Pharmaceutical research. 29, 2543-2554 (2012).
- Hubbard, D., Ghandehari, H., Brayden, D. J. Transepithelial transport of PAMAM dendrimers across isolated rat jejunal mucosae in ussing chambers. Biomacromolecules. 15, 2889-2895 (2014).
- Keely, S., et al. In vitro and ex vivo intestinal tissue models to measure mucoadhesion of poly (methacrylate) and N-trimethylated chitosan polymers. Pharmaceutical research. 22, 38-49 (2005).
- Maher, S., et al. Evaluation of intestinal absorption enhancement and local mucosal toxicity of two promoters. I. Studies in isolated rat and human colonic mucosae. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 38, 291-300 (2009).
- Balda, M. S., et al. Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein. The Journal of cell biology. 134, 1031-1049 (1996).
- Behrens, I., Stenberg, P., Artursson, P., Kissel, T. Transport of lipophilic drug molecules in a new mucus-secreting cell culture model based on HT29-MTX cells. Pharmaceutical research. 18, 1138-1145 (2001).
- Stefka, A. T., et al. Commensal bacteria protect against food allergen sensitization. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 13145-13150 (2014).
- Keely, S., et al. Activated fluid transport regulates bacterial-epithelial interactions and significantly shifts the murine colonic microbiome. Gut microbes. 3, 250-260 (2012).
- Barrett, K. E., Keely, S. J. Chloride secretion by the intestinal epithelium: molecular basis and regulatory aspects. Annual review of physiology. 62, 535-572 (2000).
- Soni, J., et al. Rat, ovine and bovine Peyer’s patches mounted in horizontal diffusion chambers display sampling function. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 115, 68-77 (2006).
- Justino, P. F., et al. Regulatory role of Lactobacillus acidophilus on inflammation and gastric dysmotility in intestinal mucositis induced by 5-fluorouracil in mice. Cancer chemotherapy and pharmacology. , (2015).
- Tran, C. D., Sundar, S., Howarth, G. S. Dietary zinc supplementation and methotrexate-induced small intestinal mucositis in metallothionein-knockout and wild-type mice. Cancer biology & therapy. 8, 1662-1667 (2009).
- Musch, M. W., Wang, Y., Claud, E. C., Chang, E. B. Lubiprostone decreases mouse colonic inner mucus layer thickness and alters intestinal microbiota. Digestive diseases and sciences. 58, 668-677 (2013).
