This protocol describes the use of excised intestinal tissue preparations or “intestinal sacs” as an ex vivo model of intestinal barrier function. This model may be used to assess integrity of both the epithelial barrier and the mucous gel layer at specific intestinal sites in animal models of digestive disease.
Epitelbarrieren er den første medfødte forsvar af mave-tarmkanalen og selektivt regulerer transport fra lumenet til det underliggende væv rum, der begrænser transport af mindre molekyler over slimhinder og næsten fuldstændigt forbud epitelial makromolekylær transport. Denne selektivitet er bestemt af den mukøse gellaget, som begrænser transporten af lipofile molekyler og begge de apikale receptorer og stramme forbindelsesepitoper proteinkomplekser af epitelet. In vitro-cellekultur modeller af epitelet er bekvemme, men som en model, mangler de kompleksitet samspillet mellem mikrobiota, slim-gel, epitel og immunsystemet. På den anden side, kan udføres in vivo vurdering af intestinal absorption eller permeabilitet, men disse assays måler den overordnede gastrointestinal absorption, uden angivelse af site-specificitet. Ex vivo permeabilitet assays ved hjælp af "intestinale sække"; er en hurtig og følsom metode til måling enten samlet intestinal integritet eller sammenlignende transport af et specifikt molekyle, med den ekstra fordel af intestinal websted specificitet. Her beskriver vi udarbejdelsen af intestinale sække for permeabilitet undersøgelser og beregning af den tilsyneladende permeabilitet (P app) af et molekyle gennem tarmbarrieren. Denne teknik kan anvendes som en metode til vurdering lægemiddelabsorption, eller undersøge regional epitelbarriere dysfunktion i dyremodeller af gastrointestinal sygdom.
Tarmens epitelbarriere af mave-tarmkanalen er en slimhindeoverflade område anslås til 400 m 2 i den humane voksne. Følgelig er det konstant udsat for slås fra mikrober, indtaget lægemidler, næringsstoffer og bakterielle toksiner. Værten skal ikke kun skelne mellem tolerable kommensale bakterier og potentielle patogener, men skal forhindre disse arter og deres udskilte molekyler fra kryds epitelbarrieren, mens den på samme tid tillader absorption af næringsstoffer. Således rolle tarmepitelet er at fungere som en selektiv barriere til de luminale indhold 1. Dette opnås til dels ved den medfødte epitel- forsvarssystem ved slimhinden, som virker gennem en responsiv biologisk system bestående af konstitutive og inducerbare mekanismer 2.
Tab af Epitelbarrierefunktionen er en patologi, der er karakteristisk for en række gastrointestinale sygdomme. In vivoundersøgelse af epitelial barrierefunktion kan vurderes ved oral sonde af et sporstof molekyle og efterfølgende serum analyse 3. Denne teknik giver ingen indikation med hensyn til stedet for barriere dysfunktion. In vitro og ex vivo evaluering af transepitel modstand ved hjælp Transwell systemer 3 og Ussing kamrene 4,5 henholdsvis er almindeligt ansat som surrogatmarkører for epitelial barrierefunktion, men mangler de bidragydende sygdom fysiologi dyremodeller 6. I denne protokol beskriver vi en ex vivo vævspræparat model, der tillader direkte og lokaliseret vurdering af intestinal integritet, og som kan anvendes til at vurdere mucosal barrierefunktion ved en række niveauer. Vigtigt er det, kan denne teknik anvendes på dyremodeller for sygdom, eller kan være farmakologisk manipuleres for at muliggøre en grundig søgning i slimhindebarrieren dysfunktion.
Her har vi beskrevet isolering og fremstilling af intestinale sække til vurdering mucosal barrierefunktion ex vivo. Intestinal sac præparater er primært anvendt i farmaceutisk forskning, undersøge absorptionen af lægemiddelkandidater i hele tarmen. Imidlertid er dette assay lige velegnet til undersøgelse af intestinal sygdom. Intestinal permeabilitet kan variere meget fra område til område og stedet konkret vurdering af permeabilitet giver en bedre forståelse af den regionale betydning af slimhin…
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by National Health and Medical Research Project Grant APP1021582 and a Hunter Medical Research Institute grant sponsored by Sparke Helmore/NBN Triathlon and the Estate of the late Leslie Kenneth McFarlane.
Dekantel Non-absorbable Silk suture | Braintree Scientific | SUT-S 116 | |
Media 199 (TC199) | Life Technologies | 11043-023 | No phenol red as this interferes with fluorescence |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 21063-045 | No phenol red as this interferes with fluorescence |
N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | Use at 10mM in media | |
Small animal vascular cathether: Physiocath | Data Sciences International | 277-1-002 | |
FITC-Dextran 4400 MW | Sigma Aldrich | FD-4 | |
FITC-Dextran 20,000 MW | Sigma Aldrich | FD-20 | |
FITC-Dextran 70,000 MW | Sigma Aldrich | FD-70 |