This protocol describes the use of excised intestinal tissue preparations or “intestinal sacs” as an ex vivo model of intestinal barrier function. This model may be used to assess integrity of both the epithelial barrier and the mucous gel layer at specific intestinal sites in animal models of digestive disease.
La barrière épithéliale est la première défense innée du tractus gastro-intestinal et régule de manière sélective le transport de la lumière dans les compartiments de tissu sous-jacentes, ce qui limite le transport de petites molécules à travers l'épithélium et presque complètement interdisant le transport macromoléculaire épithéliale. Cette sélectivité est déterminée par la couche de gel muqueux, ce qui limite le transport de molécules lipophiles et les deux récepteurs apical et les complexes protéiques de jonction serrées de l'épithélium. Modèles in vitro de culture de cellules de l'épithélium sont pratiques, mais en tant que modèle, il leur manque la complexité des interactions entre le microbiote, muqueux-gel, l'épithélium et du système immunitaire. D'autre part, l'évaluation in vivo de l'absorption intestinale ou de la perméabilité peut être effectuée, mais ces dosages mesurent absorption gastro-intestinale dans l'ensemble, sans aucune indication de spécificité de site. Ex vivo en utilisant des essais de perméabilité intestinale "sacs"; sont une méthode rapide et sensible de mesurer soit l'intégrité intestinale globale ou le transport comparative d'une molécule spécifique, avec l'avantage supplémentaire de l'intestin spécificité du site. Nous décrivons ici la préparation de sacs intestinaux pour les études de perméabilité et le calcul de la perméabilité apparente (Papp) d'une molécule à travers la barrière intestinale. Cette technique peut être utilisée comme méthode d'évaluation de l'absorption du médicament, ou d'examiner dysfonctionnement de la barrière épithéliale régionale dans des modèles animaux de maladies gastro-intestinales.
La barrière épithéliale intestinale du tractus gastro-intestinal est une surface mucosale à environ 400 m 2 chez l'adulte humain. Par conséquent, il est constamment exposé à contester des microbes, des médicaments ingérés, les nutriments et les toxines bactériennes. L'hôte doit non seulement faire la distinction entre les bactéries commensales acceptables et des agents pathogènes potentiels, mais doit empêcher ces espèces et de leurs molécules sécrétées de traverser la barrière épithéliale, tout en permettant en même temps l'absorption des nutriments. Ainsi, le rôle de l'épithélium intestinal est d'agir comme une barrière sélective le contenu luminal 1. Ceci est obtenu, en partie, par le système de défense innée à épithéliale de la muqueuse, ce qui agit à travers un système biologique sensible constitué de mécanismes constitutifs et inductibles 2.
Perte de la fonction barrière épithéliale est une pathologie qui est caractéristique d'un certain nombre de maladies gastro-intestinales. In vivoExamen de la fonction de barrière épithéliale peut être évaluée par gavage oral d'une molécule de traceur et l'analyse subséquente du sérum 3. Toutefois, cette technique présente aucune indication quant à l'emplacement du dysfonctionnement de la barrière. In vitro et ex vivo évaluation de la résistance transepitheliale Transwell en utilisant des systèmes 3 et des chambres d'Ussing 4,5 respectivement, sont couramment utilisés comme marqueurs de substitution de la fonction de barrière épithéliale, mais il leur manque la physiologie de la maladie à part entière de modèles animaux 6. Dans ce protocole, nous décrivons un modèle de préparation des tissus ex vivo qui permet une évaluation directe et localisée de l'intégrité intestinale et qui peut être utilisé pour évaluer la fonction de barrière mucosale à un certain nombre de niveaux. Fait important, cette technique peut être appliquée à des modèles animaux de la maladie, ou peut être manipulée afin de permettre le plan pharmacologique en profondeur interrogation d'un dysfonctionnement de la barrière muqueuse.
Ici, nous avons détaillé l'isolement et la préparation des sacs intestinaux pour évaluer la fonction de barrière mucosale ex vivo. Préparations sac intestinal ont principalement été utilisés dans la recherche pharmaceutique, en examinant l'absorption de médicaments candidats à travers l'intestin. Cependant, ce test est également bien adapté à l'étude de la maladie intestinale. la perméabilité intestinale peut varier considérablement d'une région et d'évaluation spéci…
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by National Health and Medical Research Project Grant APP1021582 and a Hunter Medical Research Institute grant sponsored by Sparke Helmore/NBN Triathlon and the Estate of the late Leslie Kenneth McFarlane.
Dekantel Non-absorbable Silk suture | Braintree Scientific | SUT-S 116 | |
Media 199 (TC199) | Life Technologies | 11043-023 | No phenol red as this interferes with fluorescence |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 21063-045 | No phenol red as this interferes with fluorescence |
N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | Use at 10mM in media | |
Small animal vascular cathether: Physiocath | Data Sciences International | 277-1-002 | |
FITC-Dextran 4400 MW | Sigma Aldrich | FD-4 | |
FITC-Dextran 20,000 MW | Sigma Aldrich | FD-20 | |
FITC-Dextran 70,000 MW | Sigma Aldrich | FD-70 |