Protocols for microbiologically induced calcite precipitation (MICP) using the bacterium Sporosarcina pasteurii are presented here. The precipitated calcium carbonate was characterized through optical microscopy and scanning electron microscopy (SEM). It is also shown that exposure to MICP increases the compressive strength of sponge.
Den spesielle bakterien under etterforskning her (S. pasteurii) er unik i sin evne, under de rette forholdene, for å indusere hydrolyse av urea (ureolysis) i naturlig forekommende miljøer gjennom utskillelse av et enzym urease. Denne prosessen med ureolysis, gjennom en kjede av kjemiske reaksjoner, fører til dannelse av kalsiumkarbonat utfellinger. Dette er kjent som Mikrobiologisk Induced Kalsitt nedbør (MICP). De riktige kultur protokoller for MICP er beskrevet her. Til slutt ble visualiserings forsøk under forskjellige moduser av mikroskopi utført for å forstå forskjellige aspekter av utfellingsprosessen. Teknikker som optisk mikroskopi, ble Scanning elektronmikroskopi (SEM) og X-Ray foto-elektronspektroskopi (XPS) som anvendes for kjemisk å karakterisere sluttproduktet. Videre ble evnen til disse utfellinger for å tette porene i et naturlig porøst medium demonstrert gjennom en kvalitativ eksperiment hvor svampPlatene ble brukt til å etterligne en pore-nettverk med en rekke lengdeskala. En svamp bar dyppet i dyrkningsmedium inneholdende bakteriecellene stivner på grunn av tilstopping av porene som følge av den kontinuerlige prosessen med kjemisk utfelling. Dette herdet svamp bar viser overlegen styrke sammenlignet med en kontrollgruppe svamp bar som blir komprimert og presset under påvirkning av en påført ytre belastning, mens herdet baren er i stand til å støtte den samme vekten med lite deformasjon.
Sporosarcina pasteurii er en gram-positive bakterien i stand til å overleve i svært alkaliske miljøer (pH ~ 10) 1 og er en av de bakteriearter som kan bli en utløsende agent for et fenomen som kalles Mikrobiologisk Induced Kalsitt nedbør (MICP) 2-4. MICP er en prosess hvori utfelling av kalsiumkarbonat induseres av visse mikroorganismer under egnede forhold i omgivelsene. S. pasteurii har antatt betydning i de siste årene på grunn av sin identifikasjon som et mulig middel for å fremkalle betydelige mengder MICP under visse betingelser. Denne mulighet stammer fra det faktum at S. pasteurii har den unike evnen til å skille ut store mengder av enzymet urease. Dette enzym virker som en katalysator, fremme en akselerert lysering av urea (et naturlig forekommende biokjemisk forbindelse med utbredt og rikelig tilførsel) i nærvær av vannmolekyler. Gjennom en kaskade av reaksjoner, er denne prosessen endeligely fører til generering av negativt ladede karbonationer. Disse ioner, i sin tur reagerer med positive metallioner som kalsium til slutt danne utfellinger av kalsiumkarbonat (kalsitt); derfor etiketten MICP 5-9.
Prosessen med MICP har vært kjent og studert i flere tiår 10,11. I løpet av de siste årene, har MICP blitt undersøkt for et bredt spekter av engineering og miljøprodukter inkludert bottom-up grønn konstruksjon 12, forbedring av store strukturer 13,14 og karbonbinding og lagring 15,16.
For eksempel Cunnigham 17 et. al utformet et høyt trykk moderat temperatur strømningsreaktor inneholdende en Berea sandsteinskjerne. Reaktoren ble inokulert med bakterier S. fridgidimarina og under forhold med høyt trykk kritisk karbondioksyd injeksjon, en massiv akkumulering av biomasse på innsiden av pore volvolumer ble observert, noe som førte til mer enn 95% reduksjon i permeabilitet. Jonkers og Schlangen 18 studert effekten av visse spesielle stammer av bakterier på selvhelbredende prosess i betong. Eksternt vann transportert inn i pore-nettverk som trenger inn gjennom de overflateporer er forventet å aktivere den sovende bakterier som i sin tur bidrar til strukturell styrke via MICP. Tobler 19 et al. har sammenlignet ureolytic aktiviteten av S. pasteurii med en innfødt grunnvann ureolytic mikrokosmos under betingelser som favoriserer store MCIP og fant at S. pasteurii har en konsekvent evne til å forbedre kalsitt nedbør selv når urfolkssamfunn manglet før urease aktivitet. Mortensen 20 et.al har studert effekten av ytre faktorer som jordtype, konsentrasjon av ammoniumklorid, saltholdighet, oksygenkonsentrasjon og lysis av celler på MICP. Deres demonstrasjon på at den biologiske renseprosessen er meget robust med respect til en stor variasjon i parameter plass underbygger trenings av denne prosessen for en rekke store utbedring programmer som tilbys en skikkelig berikelse prosess for å forsterke bakteriene er foretatt. Phillips 21 et. al utformet eksperimenter for å studere forandringer i permeabilitet og styrke av en sand-kolonne og en sandsteinkjerne etter å ha blitt injisert med S. pasteurii kulturer. De fant at mens permeabiliteten redusert 2 – 4 ganger så lenge bruddstyrken økes tre ganger.
S. pasteurii og dens rolle i MICP er tema for aktiv forskning og flere spørsmål knyttet til mekanismen for kjemisk felling er fortsatt ikke fullt ut forstått. I lys av dette, er det svært viktig å ha et sett av konsistente standardiserte protokoller for nøyaktig kultur en passende beriket lager av S. pasteurii å oppnå MICP. Her skisserer vi en streng protokoll som vil sikre repeterbarhet og reproduserbarhet. dette manuscript beskriver detaljerte protokoller for dyrking S. pasteurii og hensiktsmessig å anrike kulturmediet for å indusere utfelling. Prosessen blir undersøkt ved forskjellige mikroskopiske teknikker så som optiske og Scanning elektronmikroskopi (SEM) og X-Ray foto-elektronspektroskopi (XPS). Fokuset i manuskript er på prosessen med MICP. Prosedyrer som SEM og SIMS, blir veletablerte standardprotokoller, ikke er særskilt beskrevet.
Kritiske trinn: Dette manuskriptet beskriver i detalj de protokoller for dyrking av en levedyktig utvalg av S. pasteurii. Etter at kulturen er blitt klargjort, må det være passende beriket. Dette er et viktig skritt avgjørende for å lykkes med forsøket fordi en unnlatelse av å gi riktig kjemisk miljø fører til enten svært lange tidsskalaer av nedbør eller en komplett mangel. S. pasteurii er ganske følsom for flere eksterne etater og må dyrkes med en høy grad av omsorg og p…
The authors have nothing to disclose.
We wish to acknowledge the partners in the Helmholtz-Alberta Initiative, the Helmholtz Association and the University of Alberta, for the support resulting from participation in this collaboration. Research funding is provided by the Helmholtz Association’s Initiative and Networking Fund, the participating Helmholtz Centers and by the Government of Alberta through Alberta Environment’s ecoTrust program.
Dr. Tanushree Ghosh is gratefully acknowledged for her critical inputs at a number of crucial stages.
Petridish | Fisher Scientific | FB0875712 | Petridishes being used as Agar plate |
Pyrex Flasks | Fisher Scientific | S63268 | Corning Erlenmeyer |
Tris-Base | Promega | H5133 | being used to make Tris-Buffer |
Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | H9892 | 1.0 N, Bioreagent, suitable for cell culture |
Agar Powder | Sigma-Aldrich | A1296 | microbiology tested, plant cell culture tested, cell culture tested, powder |
Ammonium Sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | for Molecular Biology |
Yeast extract powder | Sigma-Aldrich | 51475 | |
Measuring Cylinder | Cole-Parmer | CP08559GC | Cole-Parmer Class A Graduated Cylinder w/Cal Cert,TC;1000ml,1/Pk |
Analytical Balance | OHAUS | AX124E | being used to measure weight of reagents |
Autoclave | Brinkmann | 58619000 | |
Autoclave Tape | VWR | 52428864 | |
Aluminum Foil | Sigma-Aldrich | Z185140 | being used to seal the flask before placing it in Autoclave |
Bacterial Stock | Cedarlane | 11859 | -80°C stock of S. pasteurii, ATCC No. is mentioned against Cat. No. |
Mline Single-Channel Mechanical Pipettors, Variable Volume | Biohit | 725010 | Marketed by VWR under catalog number 14005976 |
Micropipette Tip | Fisher Scientific | 212772B | Used for scratching Agar plates |
Incubator | Binder | 80079098 | Microbiology Incubator,BF Series |
Shaking Incubator | VWR | 14004300 | VWR Signature Benchtop Shaking Incubators |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P7059 | |
BD Falcon Express Pipet-Aid Pipetting Device | BD Biosciences | 357590 | Marketed by VWR under catalog number 53106220 |
Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | Being used to seal Agar plates |
Urea | Sigma-Aldrich | U1250 | Enrichment for nutrient medium |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8875 | Enrichment for nutrient medium |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | Enrichment for nutrient medium |