Introduction
منذ أول وصف في عام 2001 من قبل ثلاث مجموعات مستقلة 1-3 ط ن الرحم Electroporation للأصبحت أداة القياسية المستخدمة على نطاق واسع لتحليل التعبير الجيني في النظام العصبي المركزي القوارض. بالمقارنة مع جيل من الفئران خروج المغلوب، الذي هو، على الرغم من تحسن مستمر التقنيات، لا يزال الوقت والمال المستهلكة، والرحم في الطعون Electroporation للبسبب بساطته. لذلك، في الرحم Electroporation للتمكن gain- بسرعة وكفاءة والخسارة من وظيفة الدراسات 4.
ل transfect المناطق الدماغية، يتم حقن محلول يحتوي على البلازميد سالبة الشحنة إلى البطين. خلال النبض الكهربائي، والحمض النووي سالبة الشحنة بترحيل نحو القطب الموجب، وبالتالي يمكن تحديد المنطقة transfected ببساطة عن طريق تغيير موقف القطب الموجب. وكثيرا ما تبين أن العديد من مناطق الجهاز العصبي المركزي يمكن أن يكون تاrgeted 3،5-8. على سبيل المثال، تظهر الدراسات الحديثة transfections محدد من الحصين والقشرة الكمثرية أو المخطط 11/09. ومع ذلك، فإن المعلومات حول المواقف المناسبة غالبا ما تكون موحدة بالكاد فقط وليست دائما سهلة لنقل لسلالات مختلفة الماوس.
ترنسفكأيشن بعض المراحل الجنينية لا يزال بعيدا عن تافهة. يجب أن تؤخذ العديد من العوامل التي تؤثر في الاعتبار عند اختيار مجموعة المتابعة لتحديدا في الرحم Electroporation لل. أولا، ل transfect على النحو الأمثل المراحل الجنينية منها، هناك حاجة إلى معرفة الفولتية المناسبة. الفولتية العالية تقلل من معدل البقاء على قيد الحياة، في حين الفولتية المنخفضة تقلل من 2،3،12 كفاءة ترنسفكأيشن. أيضا حجم مجداف الكهربائي يلعب دورا حاسما، لأن استخدام المجاذيف الكهربائي التي هي نتائج كبيرة جدا في خفض خصوصية أو يمكن أن يسبب الوفاة بسبب المودة من ضربات القلب 4،12،13. وتطبقالجهد وحجم وموقف مجداف الكهربائي هي أهم سمات للنظر، ولكن هناك أيضا عوامل أخرى تؤثر على نتائج Electroporation لل، مثل كمية التطبيقية من الحمض النووي الحل.
قمنا بتطوير بروتوكول مفصلة والتي تمكن ترنسفكأيشن سريعة وفعالة من مختلف المناطق الدماغية من الفأرة 12 C57BL / 6. في هذا البروتوكول على معلومات مفصلة حول الفولتية لاستخدامها ويتم توفير حجم مجداف الكهربائي لتعزيز خصوصية. وعلاوة على ذلك، معلومات عن البطين المراد شغلها جنبا إلى جنب مع ويتم تزويد توصيات لكمية من محلول البلازميد وموقف القطب. في إشارة إلى معلومات الموقع مفصلة في خريطة والتصور مزيد من هذه المواقف يمكن محددة واضحة وفعالة في الرحم Electroporation للمن القشرة خلف الطحال، والقشرة الحركية، والقشرة الحسية الجسدية، والقشرة الكمثرية، رانه قرن آمون 1-3، والتلفيف المسنن، المخطط، نواة الحاجز الأفقي، والمهاد وتحت المهاد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد أجريت التعامل مع الفئران والإجراءات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية الأوروبية والوطنية والمؤسسية لرعاية الحيوان: بيان الأخلاق.
1. في الرحم Electroporation لل
ملاحظة: في الرحم Electroporation للتم تنفيذ كما نشرت سابقا 12،14. لذلك، يتم وصف الطريقة فقط لفترة وجيزة في ما يلي (الشكل 1).
- استعدادات
- إعداد الأخضر السريع ملونة خالية من الذيفان الداخلي المتقدم الحل ترنسفكأيشن الصف البلازميد (التي تحتوي على 1،5 pCAGGS) كما هو موضح سابقا (12).
- سحب وطحن (35 درجة زاوية) الشعيرات الدموية الزجاج البورسليكات (0،8-0،9 القطر) عن طريق الحقن.
- تعقيم الأدوات.
- العملية الجراحية
- إدارة المسكنات (كاربروفين، 4 ملغم / كغم من وزن الجسم، الشوري، 24 ساعة مستودع) لا يقل عن 30 دقيقة قبل البدء في عملية جراحية.
- الحفاظ على طولالتخدير إلى حد أقصى قدره 35-45 دقيقة (المرحلة الثالثة - مرحلة التخدير الجراحي وفقا لGuedel 15 - أقصى 25-30 دقيقة).
- تخدير الفئران توقيت الحوامل مع isoflurane (الاستقراء في غرفة: 2.8٪، والجراحة عن طريق قناع: 2.5٪). تأكيد التخدير التي تجاوب إلى أخمص القدمين قرصة.
- تطبيق مرهم العين لمنع جفاف العين أثناء التخدير.
- تعقيم المنطقة الجراحية مع 7.5٪ Providone-اليود حل وتغطية الماوس مع شاش معقم (رطبة مع حل 0.9٪ البنزيل الكحول المالحة) فقط مع منطقة العمليات الجراحية عرضة للخطر.
- قطع فتح تجويف البطن مع مشرط (شق الجلد: 1.5-2 سم، شق العضلات: 1-1.5 سم).
- الحفاظ على تجويف البطن فتح من الجفاف عن طريق تبليل مع درجة حرارة 0.9٪ محلول ملحي البنزيل الكحول أو غيرها من محلول متساوي التوتر المعقم وفقا لتوجيهات من قبل الموظفين البيطري أو لجنة.
- استخراج بعناية قرون الرحم (باستخدام ملقط حلقة، لا تلمس الرحم مع إصبعق).
- حقن الحمض النووي و electroporation. ملاحظة: يشار إلى التفاصيل الدقيقة لاستهداف مناطق محددة في القسم 2.
- حقن ببطء الحل DNA الملون في البطين كما هو مبين في الشكل 1 والباب 2 عن طريق الشعيرات الدموية البورسليكات المعدة.
- تطبيق الجهد المناسب للمرحلة جنينية المقابلة (على سبيل المثال، 36-38 V لE14) عن طريق ملقط نوع الأقطاب المتخصصة البلاتين (دورة الفاصلة طول 50 ميللي ثانية، الفاصل قفة 950 مللي ثانية). نبض المجاذيف Electroporation للخلال تطبيق الجهد لتقليل الضرر من جدار الرحم.
- آخر Electroporation لل/ الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية
- استبدال بعناية قرون الرحم في تجويف البطن.
- خياطة العضلات وشق الجلد بشكل منفصل.
- ترك بقية الماوس على جهاز دعم الحراري للانتعاش.
- الإشراف على الماوس أثناء الاسترداد (السلوك والعلف واستهلاك المياه)، 4 ساعة، 24 ساعة و 48 ساعة بعد الجراحة. إذا لزم الأمر، وتطبيق المسكنات إضافية (كاربروفين، 4 ملغم / كغم من وزن الجسم، 24 ساعة مستودع) لأيام أخرى 2.
2. ترنسفكأيشن من مناطق دماغية معينة
ملاحظة: يتم عرض موقف القطب الموجب كما الزاوية بين محور الرأسي من خلال البطين مليئة الحل DNA (البطين الأيمن أو الثالث) وموقف القطب الموجب. عند ملء البطين الأيسر المواقف هي مقلوب مرآة. في الشكل 4 تظهر مواقف البدائي الأذن، والتي توفر نقطة مرجعية هامة.
- ترنسفكأيشن من المناطق القشرية (الشكل 2A، الجدول 1).
- إجراء عمليات جراحية كما هو موضح في القسم 1.2. لElectroporation للفي الرحم من المناطق القشرية استخدام الأجنة E14.
- حقن 1،5-2 ميكرولتر الحمض النووي DNA محلول يحتوي على 4 ميكروغرام في البطين الجانبي الأيمنعن طريق الشعيرات الدموية البورسليكات المعدة.
- وضع بعناية الجنين باستخدام ملقط حلقة بحيث لا توجد سفن مرئية فوق موقع ثقب.
- حقن ببطء الحمض النووي حل ما يقرب من 0.75 ملم الاكليلية من الدرز اللامي السفلي و 0.5 ملم الوحشي من الدرز السهمي (الشكل 3). تأكد من أن عمق الإدراج هو 1.2 ملم (E14، تقاس من جدار الرحم). تحقق من وجود التلوين الأزرق والأخضر مع ترسيم حاد.
- تطبيق الجهد عبر المتخصصة ملقط نوع أقطاب البلاتين (دورة الفاصلة طول 50 ميللي ثانية، الفاصل قفة 950 مللي ثانية).
- استخدام 3 أو 5 مم القطب مجداف.
- استخدام التيار الكهربائي تتراوح 36-38 V.
- وضع مركز الأقطاب فقط الأمامي للبراعم الأذن.
- ل transfect الزوايا استخدام القشرة خلف الطحال 330-0 درجة، ل transfect القشرة الحركية 0-40 درجة مئوية، ل transfect القشرة الحسية الجسدية 40-95 درجة مئوية، ل transfectوالقشرة الكمثرية 95-110 درجة (الشكل 2A).
- أداء بعد Electroporation لل/ الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية كما هو موضح في القسم 1.4. التضحية الفئران وتحليل الأجنة 4 أيام بعد Electroporation لل(E18) كما هو موضح في القسم 3.
- ترنسفكأيشن من الحصين (الشكل 2B، الجدول 1).
- إجراء عمليات جراحية كما هو موضح في القسم 1.2. لفي الرحم Electroporation للمن تشكيل الحصين استخدام الأجنة E15.
- حقن 2 ميكرولتر الحمض النووي محلول يحتوي على 4 ميكروغرام الحمض النووي في البطين الجانبي الأيمن عن طريق الشعيرات الدموية البورسليكات المعدة.
- تطبيق الجهد عبر المتخصصة ملقط نوع أقطاب البلاتين (دورة الفاصلة طول 50 ميللي ثانية، الفاصل قفة 950 مللي ثانية).
- استخدام 3 أو 5 مم القطب مجداف.
- استخدام التيار الكهربائي تتراوح 38-40.
- وضع مركز القطب السالب فقط الأمامي من منشم الأذن ومركز سو القطب الموجب في منتصف منشم الأذن.
- ل transfect التلفيف المسنن تستخدم في زوايا 190-210 درجة مئوية، ل transfect في ammonis كورنو (CA) 3 210-230 درجة مئوية، ل transfect في CA2 230-250 درجة مئوية، ل transfect في CA1 250-275 درجة (الشكل 2B).
- أداء بعد Electroporation لل/ الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية كما هو موضح في القسم 1.4. إجراء تحليل بعد تشكيل الحصين كامل (بعد الولادة، P21) كما هو موضح في القسم 3.
- ترنسفكأيشن من نواة الحاجز الأفقي والمخطط (الشكل 2C، الجدول 1)
ملاحظة: زوايا تتداخل مع تلك لtransfecting الحصين. ل transfect فعال نواة الحاجز الأفقي والمخطط دون غير المرغوب فيها الحصين ترنسفكأيشن المراحل الجنينية في وقت سابق (E12) لا بد من استخدامها.- إجراء عمليات جراحية كما هو موضح في القسم 1.2. لElectroporation للفي الرحم من نواة الحاجز الأفقي وstriatأم استخدام الأجنة E12.
- حقن 1 ميكرولتر الحمض النووي محلول يحتوي على 4 ميكروغرام الحمض النووي في البطين الجانبي الأيمن عن طريق الشعيرات الدموية البورسليكات المعدة.
- تطبيق الجهد عبر المتخصصة ملقط نوع أقطاب البلاتين (دورة الفاصلة طول 50 ميللي ثانية، الفاصل قفة 950 مللي ثانية).
- استخدام 0.5 مم الكهربائي.
- استخدام 33 V.
- وضع مركز الأقطاب على مستوى براعم الأذن.
- ل transfect الزوايا استخدام الحاجز النواة الجانبية 100-170 درجة مئوية، ل transfect المخطط 170-240 درجة (الشكل 2C).
- أداء بعد Electroporation لل/ الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية كما هو موضح في القسم 1.4. التضحية الفئران وتحليل الأجنة 6 أيام بعد Electroporation لل(E18) كما هو موضح في القسم 3.
- ترنسفكأيشن من المهاد وتحت المهاد (الشكل 2D، الجدول 1)
- إجراء عمليات جراحية كما هو موضح في القسم 1.2. لفي شتيرو Electroporation للمن المهاد وتحت المهاد استخدام الأجنة E12-E13.
- حقن 1-1،5 ميكرولتر الحمض النووي محلول يحتوي على 4 ميكروغرام الحمض النووي في البطين الجانبي (اليمين أو اليسار) عن طريق الشعيرات الدموية البورسليكات المعدة. الانتظار لمدة 2-3 دقائق، حتى تتفرق حل في البطين الثالث. وبدلا من حقن مباشرة في البطين الثالث.
ملاحظة: هذا يعزز خصوصية ولكن قد تتسبب في معدل البقاء على قيد الحياة انخفضت (خطر كبير من الضرر). - تطبيق الجهد عبر المتخصصة ملقط نوع أقطاب البلاتين (دورة الفاصلة طول 50 ميللي ثانية، الفاصل قفة 950 مللي ثانية).
- استخدام 0.5 أو 3 مم الكهربائي.
- استخدام التيار الكهربائي تتراوح 33-35 V.
- وضع مركز الأقطاب الخلفي عادل للبراعم الأذن.
- ل transfect الزوايا استخدام المهاد 25-40 درجة مئوية، ل transfect منطقة ما تحت المهاد 90-180 درجة (الشكل 2D).
- أداء آخر Electroporation لل/ الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية كما ديسcribed في القسم 1.4. التضحية الفئران وتحليل الأجنة 6 أيام بعد Electroporation لل(E18) كما هو موضح في القسم 3.
3. الإرواء التثبيت
- استعدادات
- الحارة 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) إلى 37 درجة مئوية.
- ملء حقنة 50 مل مع برنامج تلفزيوني (4 درجة مئوية) وحقنة الثانية مع درجة حرارة PFA. تجنب الفقاعات.
- توصيل الحقن إلى محبس ثلاثي. قم بتوصيل الطرف الثالث لمجموعة التسريب المجنح (فراشة).
- تدفق مجموعة التسريب المجنح مع برنامج تلفزيوني.
- نضح
- عميق تخدير الفئران (حامل أو بعد الولادة transfected) مع التطبيق تحت الجلد من هيدروكلوريد الكيتامين (60 ملغ / كلغ) وزيلازين (7.5 ملغ / كلغ).
- تأكيد مرحلة التسامح الجراحية التي تجاوب إلى أخمص القدمين قرصة.
- فتح تجويف البطن فقط تحت القفص الصدري.
- قطع بعناية الحجاب الحاجز.
- فتح بعناية القفص الصدري عن طريق خفض على البريدموقع منظمة العمل ضد الجوع حتى الترقوة.
- إدراج غيض من فراشة في غرفة القلب اليسرى (بدءا من قمة القلب).
- قطع أطرافهم الأذين الأيسر.
- يروي ببطء الفأر مع PBS (حوالي 10 مل).
- تبديل ثلاثي محبس.
- يروي الماوس مع 5-10 مل 4٪ PFA.
- قطع رأس الماوس باستخدام مقص وتشريح الدماغ تبدأ في ماغنوم الثقبة. إجراء تشريح كما نشرت سابقا 16.
- Postfixate الدماغ لمدة 2 أيام في 4٪ PFA. الحفاظ على العقول في 4 درجات مئوية في الظلام.
4. المناعية
- توليد 70 ميكرومتر أقسام (على سبيل المثال، مع vibratome).
- اختياري: تعزيز مضان مع تلوين الأجسام المضادة.
- منع المقاطع لمدة 1 ساعة على RT (0.1-0.2٪ تريتون X-100، 5٪ مصل الماعز العادي)
- احتضان O / N مع الجسم المضاد المناسب (مكافحة GFP، 1: 1000)
- غسل 3-5 مرات مع العازلة 0.1 M الفوسفات.
- احتضان 05/03 ساعة مع مضان مترافق الضد الثانوية المناسب (فلور اليكسا 488 مترافق المضادة للأرنب، مفتش، 1: 1000).
- اختياري: مباين مع 4-6-diaminodino-2-phenylindole (دابي، 0.2 جم / مل في 0.1 M الفوسفات العازلة) لمدة 1 دقيقة.
- تحليل مضان مع مجهر مضان المناسب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الرقم 2، ويبين أمثلة لتحديدا في الرحم Electroporation للمن المناطق النامية في القشرة خلف الطحال، والقشرة الحركية، والقشرة الحسية الجسدية، والقشرة الكمثرية، وقرن آمون 1-3، والتلفيف المسنن، المخطط، نواة الحاجز الجانبية والمهاد وتحت المهاد. وأظهرت نتائج transfections بجوار زاوية موصى بها (الشكل 2). لرؤية أفضل للزوايا في الجسم الحي ترد موقف القطب (0.5 ملم) أيضا على الجنين (الشكل 5، الجنين في الرحم، الجنين في الكيس السلوي، جنين تشريح). من أجل تقديم تلخيص لجدول نظرة عامة 1 الوقائع ذات الصلة لترنسفكأيشن معين.
وعلاوة على ذلك، وقد تبين أن حجم القطب يلعب دورا حاسما لخصوصية (الشكل 6). حجم أكبر من المجاذيف الكهربائي يؤدي إلى لوس أنجليسrger المناطق transfected، كما هو مبين في الشكل (6) مثالية. وعلاوة على ذلك، الأقطاب الكهربائية التي هي غطاء كبير جدا أكثر من اللازم للجنين، مما يعزز من مخاطر تؤثر على إيقاع الأجنة القلب (الشكل 7). على سبيل المثال 10 ملم القطب مجداف يغطي E12 الجنين كله (الشكل 7).
ويبين الشكل 1. في الرحم Electroporation لل. خطوات بسيطة للأداء Electroporation للفي الرحم. (A) يظهر الإعداد كامل من الجراحة، مع الماوس وضعت على موقد تخدير بالفعل مع isoflurane. (B) وتطهير المنطقة الجراحية هو خطوة حاسمة قبل فتح تجويف البطن (C) من الفأرة. (D) الحل التي تحتوي على الحمض النووي هو لون مع سريعة Green، والتي تمكن التصور من نجاح الحقن (E، F). حقن الناجح في البطين الجانبي النتائج إلى بقعة على شكل هلال. (G) بعد حقن يتم تطبيق الجهد المناسب عن طريق ملقط نوع أقطاب البلاتين. (H) بعد استبدال بعناية الرحم في تجويف البطن وخياطة الجروح. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يشار إلى الشكل 2. زاوية خريطة ل electroporation من مناطق معينة في القشرة الفئران، الحصين، الأفقي نواة الحاجز، المخطط، المهاد وتحت المهاد، والمواقف المناسبة لالقطب الإيجابي والسلبي، في الرسم التخطيطي. ل(AC نانوغرام>) يشار إلى مواقف للحقن الحمض النووي الحل إلى البطين الأيمن. لحقن إلى البطين الأيسر، وزوايا هي مقلوب مرآة. وتم التحقق من transfections محددة تشريحيا. (A) ويبين مواقف القطب الإيجابي والسلبي لtransfecting المناطق القشرية (القشرة خلف الطحال (RSC)، والقشرة الحركية (MC)، والقشرة الحسية الجسدية (SSC) والقشرة الكمثرية (PC). (B) ويبين مواقف القطب الإيجابي والسلبي لtransfecting تشكيلات الحصين (قرن آمون و1-3 (CA1، CA2، CA3) والتلفيف المسنن (DG). (C) ويبين مواقف القطب الإيجابي والسلبي لtransfecting المخطط (STR) ونواة الحاجز الأفقي (LS). (D) ويبين المواقف المناسبة من الأقطاب الكهربائية لtransfecting المهاد (TH) ومنطقة ما تحت المهاد (HY). مقتبس من Baumgart J. & الغطاس N.، 2015 12. ملاحظة: //www.jove.com/files/ftp_upload/53303/53303fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. موقع البزل. الموقف الأمثل لحقن محلول الحمض النووي هو ما يقرب من 0.75 ملم الاكليلية من الدرز اللامي السفلي و 0.5 ملم الوحشي من الدرز السهمي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ويعرف الشكل 4. موقف منشم الأذن. إن موقف منشم الأذن بشكل واضح (السهم).NK "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. التصور من زوايا على الجنين. لأفضل تصور المواقف المناسبة للالقطب الموجب (المشار إليها بعلامة زائد الأزرق) والسلبي لtransfections محدد من المناطق القشرية (القشرة خلف الطحال، القشرة الحركية، القشرة الحسية الجسدية، الكمثرية القشرة)، والمناطق الحصين (قرن آمون (CA) 1-3، التلفيف المسنن (DG))،وتظهر نواة الحاجز الأفقي، والمخطط، والمهاد وتحت المهاد على الجنين في الرحم، الجنين في الكيس السلوي وعلى الجنين تشريح (جميع E15،5). الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 6. خصوصية ترنسفكأيشن اعتمادا على حجم القطب، فزيادة حجم مجداف القطب يقلل من خصوصية ترنسفكأيشن. وهذا واضح خصوصا في المراحل الجنينية الأصغر سنا (E12، أعلى)، ولكن أيضا واضحة في المراحل الجنينية في وقت متأخر (E17، أسفل). مقتبس من Baumgart J. & الغطاس N.، 2015 12. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 7. حجم مجداف القطب مقارنة مع حجم الجنين E12. الأقطاب الكهربائية التي هي غطاء كبير جدا أكثر من اللازم للجنين وبالتالي تزيد من خطر المودة من إيقاع القلب. على سبيل المثال، 10 مم الكهربائي (على اليمين) يغطي E12 الجنين كله وبالتالي لا ينصح، حتى لو خصوصية ليست هي الهدف الأساسي. مقتبس من Baumgart J. & الغطاس N.، 2015 12. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| المنطقة المستهدفة | زاوية | موقف القطب | عمر الجنين | عمو DNAتركيز NT / | الجهد االكهربى | حجم القطب | |
| اللحاء خلف الطحال | 330 ° - 0 ° | مركز الأقطاب الأمامي فقط من براعم الأذن | E14 (E11-E17) | 1.5- 2 ميكرولتر / 2.7- 2 ميكروغرام / ميكرولتر | 36- 38 | 3- 5 مم | |
| محرك اللحاء | 0 ° - 40 ° | مركز الأقطاب الأمامي فقط من براعم الأذن | E14 (E11-E17) | 1.5- 2 ميكرولتر / 2.7- 2 ميكروغرام / ميكرولتر | 36- 38 | 3- 5 مم | |
| اللحاء الحسية الجسدية | 40 ° - 95 ° | مركز الأقطاب الأمامي فقط من براعم الأذن | E14 (E11-E17) | 1.5- 2 ميكرولتر / 2.7- 2 ميكروغرام / ميكرولتر | 36- 38 | 3- 5 مم | |
| Piriforم اللحاء | 95 درجة - 110 درجة | مركز الأقطاب الأمامي فقط من براعم الأذن | E14 (E11-E17) | 1.5- 2 ميكرولتر / 2.7- 2 ميكروغرام / ميكرولتر | 36-3 8 | 3- 5 مم | |
| قرن آمون (CA) 1 | 250 ° - 275 ° | مركز القطب الموجب في منتصف منشم الأذن | (E14-) E15 | 2 ميكرولتر / 2 ميكروغرام / ميكرولتر | 38- 40 | 3- 5 مم | |
| CA2 | 230 درجة - 250 درجة | مركز القطب الموجب في منتصف منشم الأذن | (E14-) E15 | 2 ميكرولتر / 2 ميكروغرام / ميكرولتر | 38- 40 | 3- 5 مم | |
| CA3 | 210 درجة - 230 درجة | مركز القطب الموجب في منتصف منشم الأذن | (E14-) E15 | 2 ميكرولتر / 2 ميكروغرام / ميكرولتر | 38- 40 | 3- 5 مم | |
| التلفيف المسنن | 190 درجة - 210 درجة | مركز القطب الموجب في منتصف منشم الأذن | (E14-) E15 | 2 ميكرولتر / 2 ميكروغرام / ميكرولتر | 38- 40 | 3- 5 مم | |
| المخطط | 170 ° - 240 ° | مركز الأقطاب على مستوى براعم الأذن | E12 | 1 ميكرولتر / 4 ميكروغرام / ميكرولتر | 33 | 0.5 مم | |
| الوحشي الحاجزي نواة | 100 درجة - 170 درجة | مركز الأقطاب على مستوى براعم الأذن | E12 | 1 ميكرولتر / 4 ميكروغرام / ميكرولتر | 33 | 0.5 مم | |
| المهاد | 25 ° - 40 ° | مركز electodes الخلفي عادل الحزب الثوري المؤسسي الأذنmordia | E12- E13 | 1-1،5 ميكرولتر / 4-2،7 ميكروغرام / ميكرولتر | 33- 35 | 0.5- 3 مم | |
| المهاد | 90 ° - 180 ° | مركز electodes فقط الخلفي للبراعم الأذن | E12- E13 | 1-1،5 ميكرولتر / 4-2،7 ميكروغرام / ميكرولتر | 33- 35 | 0.5- 3 مم | |
الجدول 1: ملخص النتائج المدرجة في هذا الجدول هو كل المعلومات ذات الصلة لترنسفكأيشن محدد من المناطق القشرية وصفها. أنه يحتوي على تفاصيل حول المنطقة المستهدفة، وزاوية، والموقف من القطب، المرحلة الجنينية، ومقدار التطبيقية وتركيز المحلول DNA، والجهد وحجم القطب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Fast Green | Roth | 0301.1 | |
| pCAGGS | Addgene | ||
| borosilicate glass capillaries (0.8-0.9 mm diameter) | Wold Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| Isoflurane (Forene) | Abbott | PZN 4831850 | |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer GmbH | approval number: 400684.00.00 | |
| eye ointment (Bepanthen Augen und Nasensalbe) | Bayer | PZN 01578681 | |
| 0.9% benzyl alcohol 0.9% saline solution | Pharmacy of the University Medical Center Mainz |
||
| gauze (ES-Kompressen) | Hartmann | 407835 | |
| sterile 5-0 Perma-Hand Silk Suture | Ethicon Johnson & Johnson | K890H | |
| ring forceps 1/ 1.5 mm | Fine Science Tools | 11101-09 | |
| ring forceps 4.8/ 6 mm | Fine Science Tools | 11106-09 | |
| ring forceps 2.2/ 3 mm | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Adson Forceps-Serrated Straight 12 cm | Fine Science Tools | 1106-12 | |
| IrisScissors-Delicate Straight-Sharp/Blunt 10 cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Mayo-Stille Scissors-Straight 15 cm | Fine Science Tools | 14012-15 | |
| Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Castroviejo NeedleHolder-with Lock-Tungsten Carbide 14 cm | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Elektroporator CUY21 SC | Nepa Gene Co. | ||
| FST 250 Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Microgrinder EG-44 | Narishige | ||
| P-97 Micropette Puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Platinum electrodes 650P 0.5 mm | Nepagene | CUY650P0.5 | |
| Platinum electrodes 650P 3 mm | Nepagene | CUY650P3 | |
| Platinum electrodes 650P 5 mm | Nepagene | CUY650P5 | |
| Platinum electrodes 650P 10 mm | Nepagene | CUY650P10 | |
| Anesthesia system | Rothacher-Medical GmbH | CV-30511-3 Vapor 19.3 | |
| Heating plate | Rothacher-Medical GmbH | HP-1M | |
| Temperature Controller 220V AC | Rothacher-Medical GmbH | TCAT-2LV |
References
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19 Suppl 1. (July), i120-i125 (1991).
- Nakahira, E., Yuasa, S. Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation. J Comp Neurol. 483 (3), 329-340 (2005).
- Navarro-Quiroga, I., Chittajallu, R., Gallo, V., Haydar, T. F. Long-term, selective gene expression in developing and adult hippocampal pyramidal neurons using focal in utero electroporation. J Neurosci. 27 (19), 5007-5011 (2007).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. J Neurosci Methods. 143 (2), 151-158 (2005).
- Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. M. Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders. FNMOL. 4 (November), 37 (2011).
- Tomita, K., Kubo, K. I., Ishii, K., Nakajima, K. Disrupted-in-schizophrenia-1 (Disc1) is necessary for migration of the pyramidal neurons during mouse hippocampal development. Hu Mol Gen. 20 (14), 2834-2845 (2011).
- Niwa, M., Kamiya, A., et al. Knockdown of DISC1 by In Utero Gene Transfer Disturbs Postnatal Dopaminergic Maturation in the Frontal Cortex and Leads to Adult Behavioral Deficits. Neuron. 65 (4), 480-489 (2010).
- Nakahira, E., Kagawa, T., Shimizu, T., Goulding, M. D., Ikenaka, K. Direct evidence that ventral forebrain cells migrate to the cortex and contribute to the generation of cortical myelinating oligodendrocytes. Dev Biol. 291 (1), 123-131 (2006).
- Baumgart, J., Grebe, N. C57BL/6-specific conditions for efficient in utero electroporation of the central nervous system. J Neurosci Methods. 240, 116-124 (2015).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. JoVE. (54), (2011).
- Guedel, A. E. Inhalation anesthesia: a fundamental guide. , Macmillan. New York. (1937).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. JoVE. (65), e3564 (2012).
- Mizutani, K., Saito, T. Progenitors resume generating neurons after temporary inhibition of neurogenesis by Notch activation in the mammalian cerebral cortex. Development. 132 (6), 1295-1304 (2005).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev, Growth & Differ. 50 (6), 507-511 (2008).
