Introduction
Üç bağımsız gruplar 1-3 2001 yılında ilk açıklama beri i n utero elektroporasyon kemirgen, merkezi sinir sisteminde gen ifadesini analiz etmek için yaygın olarak kullanılan standart bir araç haline gelmiştir. Sürekli gelişen teknikler, hala zaman ve para kolaylığından dolayı, rahimde elektroporasyon temyiz tüketen rağmen bir nakavt farelerin nesil ile karşılaştırıldığında. Yani, in utero elektroporasyon hızlı ve verimli gain- ve zarar-fonksiyon çalışmalarını 4 sağlar.
Serebral bölgeleri transfekte etmek için, negatif yüklü plasmid ihtiva eden bir çözelti, ventrikül içine enjekte edilir. Elektrik akımının sırasında, negatif yüklü DNA pozitif kutbuna doğru hareket eder ve bu nedenle, transfekte edilmiş bölgenin pozitif kutup konumunu değiştirerek basitçe seçilebilir. Sık sık, merkezi sinir sisteminin pek çok bölge ta olabilir gösterilmiştir3,5-8 rgeted. Örneğin, son çalışmalar hipokampus, striatum piriform kortekste veya 9-11 belirli transfections göstermektedir. Ancak, uygun pozisyonlar hakkında bilgiler genellikle sadece nadiren standardize ve her zaman farklı fare suşları aktarmak kolay değildir.
Bazı embriyonik evrelerinin Transfeksiyon önemsiz olmaktan uzaktır. Utero elektroporasyon spesifik için set-up seçerken Birçok etkileyen faktörler dikkate alınmalıdır. İlk olarak, optimum ilgili embriyonik aşamalarında transfect uygun gerilimlerinin hakkında bilgiye ihtiyaç vardır. Düşük gerilimler transfeksiyon verimi 2,3,12 azaltmak ise yüksek gerilim, hayatta kalma oranını düşürmek. Ayrıca elektrot raket boyutu, önemli bir rol oynar düşürülmüş özgüllük çok büyük sonuçlar ya bağlı kalp ritmi 4,12,13 ve sevgi ile ölüme neden olabilir elektrot kürekler kullanımı nedeniyle. Uygulanangerilim ve boyut ve elektrot kürek konumu dikkat edilmesi gereken en önemli özelliklerdir, ancak DNA çözümün uygulanan miktarı gibi, elektroporasyon sonucu etkileyen başka faktörler de vardır.
Biz C57BL / 6 fare 12 farklı beyin bölgelerinin hızlı ve etkin transfeksiyon sağlayan ayrıntılı bir protokol geliştirdik. Bu protokolde gerilimlerde hakkında ayrıntılı bilgiler kullanılmak üzere geliştirilmiş ve özgünlük için elektrot raket boyutu sağlanır. Bundan başka, ventrikül ilgili bilgiler plazmid solüsyonu miktarı ve elektrodun pozisyonu için öneriler sağlanır birlikte doldurulacak. Bir harita ve bu pozisyonlarda daha görselleştirme ayrıntılı konum bilgisi göstergesi retrosplenial korteks, motor korteks, somatosensoriyel korteks, piriform korteks, t utero elektroporasyon basit özgü ve verimli sağlarO ammonis 1-3, dentat girus, striatum, yan septal çekirdek, talamus ve hipotalamus Cornu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Beyanı: Farelerde ve deneysel prosedürlerin işleme hayvan bakımı için, Avrupa, ulusal ve kurumsal kurallara uygun olarak yapılmıştır.
1. Giriş Utero Elektroporasyon
Not: Daha önce 12,14 yayınlanan utero elektroporasyon gerçekleştirildi. Bu nedenle, yöntem aşağıdaki (Şekil 1) kısaca tarif okunur.
- Hazırlıklar
- Daha önce açıklandığı gibi 12 (1,5 pCAGGS içeren) Hızlı Yeşil renkli endotoksin içermeyen gelişmiş transfeksiyon dereceli plazmid çözüm hazırlayın.
- Enjeksiyonlar için (35 ° açı) borosilikat cam kılcal (0,8-0,9 çap) çekin ve eziyet.
- Aletleri sterilize edin.
- Cerrahlık
- Ameliyat öncesi analjezikler (karprofen, 4 mg / kg vücut ağırlığı, sc, 24 saat depo) en az 30 dakika uygulayın.
- Uzunluğunu tutun(- cerrahi anestezi aşaması guedel 15'e göre - Evre III maksimal 25-30 dakika) 35-45 dakika arasında en fazla anestezi.
- (: Maske ile% 2.8, ameliyat:% 2.5 indüksiyon bir odasında) izofluran ile zamanlanmış hamile fareler anestezi. Ayak tutam yanıtsızlık ile anestezi onaylayın.
- Anestezi sırasında göz kuruluğu önlemek için göz merhemi sürün.
- % 7.5 providon-İyot çözeltisi ile cerrahi alan sterilize ve maruz sadece cerrahi alana sahip (% 0.9 benzil alkol tuzlu su çözeltisi ile nemli) steril gazlı bez ile fare kaplayın.
- (: 1.5-2 cm, kas kesi: 1-1.5 cm cilt kesisi) bir neşter ile karın boşluğuna açın kesin.
- Veteriner personel veya komite tarafından yönlendirilen ısındı% 0.9 benzil alkol tuzlu su çözeltisi ya da diğer steril izotonik solüsyon ile nemlendirerek kurumasını açılan karın boşluğuna koruyun.
- Dikkatle parmağınızla rahim dokunmayın, halka forseps kullanarak rahim boynuzları (ayıklamaks).
- DNA ve elektroporasyon enjeksiyonu. Not: Belirli bölgeleri hedefleyen için kesin ayrıntılar 2. bölümünde belirtilmiştir.
- Hazırlanan borosilikat camdan aracılığıyla Şekil 1 ve 2. bölümünde belirtildiği gibi yavaşça ventrikül içine renkli DNA çözüm enjekte edilir.
- İlgili embriyonik aşama için uygun gerilim uygulayın (örn. E14 için, 36-38 V) özel forseps tipi platin elektrot (aralık döngüsü uzunluğu 50 ms, aralık duraklama 950 msn) aracılığıyla. Rahim duvarının hasarı en aza indirmek için voltajın uygulanması sırasında elektroporasyon kürekler Pulse.
- Mesaj elektroporasyon / post-operatif bakım
- Dikkatle karın boşluğunda rahim boynuzları değiştirin.
- Kas ve ayrı ayrı cilt kesisi dikin.
- Kurtarma için bir termal destek cihazı fare dinlendirin.
- Kurtarma sırasında fare (davranış, yem denetlemek veSu tüketimi), 4 saat, 24 saat ve 48 saat sonra ameliyat. Gerekirse, 2 gün daha fazla analjezik (karprofen, 4 mg / kg vücut ağırlığı, 24 saat depo) uygulanır.
Belirli Serebral Alanlarının 2. Transfeksiyon
Not: pozitif kutup pozisyonu DNA ana madde çözeltisi (sağ ya da üçüncü ventrikül) ve pozitif kutup konumu ile dolu ventrikül ile dikey merkez çizgisi arasındaki açı olarak gösterilir. Sol ventrikül doldururken pozisyonları ayna ters bulunmaktadır. Şekil 4'te kulak Primordial pozisyonları önemli referans noktaları sağlayan gösterilir.
- Kortikal alanlara transfeksiyonu (Şekil 2A, Tablo 1).
- Bölüm 1.2'de anlatıldığı gibi ameliyat. Kortikal alanların in utero elektroporasyon için E14 embriyolar kullanın.
- Sağ lateral ventrikül 4 ug DNA içeren DNA çözeltisi ul 1.5-2 enjekteHazırlanan borosilikat kılcal damarların üzerinden.
- Dikkatle Ponksiyon üzerinde hiçbir görünür gemiler vardır, böylece halka forseps kullanarak embriyo yerleştirin.
- Yavaş yavaş lambdoidal sütür yaklaşık 0.75 mm koronal ve sagital sütür (Şekil 3) 0,5 mm lateral DNA çözüm enjekte. Ekleme derinliği 1,2 mm (rahim duvarından ölçülen E14) olduğundan emin olun. Keskin bir sınır ile bir mavi-yeşil renk olup olmadığını kontrol edin.
- Özel forseps tipi platin elektrotlar yoluyla gerilim (aralık döngüsü uzunluğu 50 msn'den, aralık duraklama 950 msn) uygulayın.
- 3 ya da 5 mm elektrot raket kullanın.
- 36-38 V arasında değişen bir gerilim kullanın
- Elektrotların kulak primordia sadece ön merkezini yerleştirin.
- , Motor korteks 0-40 ° transfect transfect, somatosensoriyel korteks 40-95 ° transfect, 330-0 ° den retrosplenial korteks kullanım açıları transfectpiriform korteks 95-110 ° (Şekil 2A).
- Bölüm 1.4 de anlatıldığı gibi sonrası elektroporasyon / post-operatif bakım gerçekleştirin. Fareler kurban ve bölüm 3'te tarif edildiği gibi elektroporasyon (E18) sonra, embriyolar 4 gün analiz eder.
- Hipokamp (Şekil 2B, Tablo 1) transfeksiyonu.
- Bölüm 1.2'de anlatıldığı gibi ameliyat. Hipokampal formasyonun utero elektroporasyon için E15 embriyoların kullanın.
- Hazırlanan borosilikat kılcal damarların üzerinden sağ lateral ventrikül içinde 4 ug DNA içeren DNA çözeltisi ul 2 enjekte edilir.
- Özel forseps tipi platin elektrotlar yoluyla gerilim (aralık döngüsü uzunluğu 50 msn'den, aralık duraklama 950 msn) uygulayın.
- 3 ya da 5 mm elektrot raket kullanın.
- 38-40 arasında değişen bir gerilim kullanın.
- Negatif kutup kulak primordiumunun sadece ön merkezi ve merkezi o koyunKulak primordiumunun ortasında pozitif kutup f.
- Dentat girus CA1 250-275 ° (Şekil 2B) transfekte etmek üzere, Ca + 2 230-250 ° transfekte etmek, cornu ammonis (CA) 3 210-230 ° transfekte etmek, 190-210 ° 'den açılarıyla transfekte etmek.
- Bölüm 1.4 de anlatıldığı gibi sonrası elektroporasyon / post-operatif bakım gerçekleştirin. 3. bölümde açıklandığı gibi (doğum, p21 sonra) tamamlandıktan hipokampal oluşumundan sonra analiz gerçekleştirin.
- Lateral septal çekirdeği ve striatum transfeksiyonu (Şekil 2C, Tablo 1)
Not: açıları hipokampus transfecting için olanlar ile örtüşüyor. Etkin bir yanal septal çekirdeğe ve istenmeyen hipokampus transfeksiyon erken embriyonik aşamalarda (E12) olmadan striatum transfect için kullanılmalıdır.- Bölüm 1.2'de anlatıldığı gibi ameliyat. Lateral septal çekirdek ve striat in utero elektroporasyon içinum E12 embriyoları kullanılır.
- Hazırlanan borosilikat kılcal damarların üzerinden sağ lateral ventrikül içinde 4 ug DNA içeren DNA çözeltisi ul 1 enjekte edilir.
- Özel forseps tipi platin elektrotlar yoluyla gerilim (aralık döngüsü uzunluğu 50 msn'den, aralık duraklama 950 msn) uygulayın.
- 0.5 mm'lik bir elektrot kullanın.
- 33 V kullanın
- Kulak primordia düzeyinde elektrotların merkezini yerleştirin.
- Striatum 170-240 ° (Şekil 2C) transfekte edilmesi için, 100-170 ° yanal septal çekirdeği kullanımı açıları transfekte etmek.
- Bölüm 1.4 de anlatıldığı gibi sonrası elektroporasyon / post-operatif bakım gerçekleştirin. Fareler kurban ve bölüm 3'te tarif edildiği gibi elektroporasyon (E18) sonra, embriyolar 6 gün analiz eder.
- Talamus ve hipotalamus Transfeksiyonu (Şekil 2B, Tablo 1)
- Bölüm 1.2'de anlatıldığı gibi ameliyat. U içintalamus ve hipotalamus kullanımı E12-E13 embriyoların tero elektroporasyon.
- Hazırlanan borosilikat camdan aracılığıyla lateral ventrikül (sağ veya sol) 4 ug DNA içeren 1-1.5 ul DNA çözümü enjekte edilir. Çözüm, üçüncü ventrikül içine yayılır kadar, 2-3 dakika bekleyin. Alternatif doğrudan üçüncü ventrikül içine enjekte edilir.
Not: Bu özgüllüğünü arttırır fakat azalmış sağkalım oranı (hasar riski yüksek) neden olabilir. - Özel forseps tipi platin elektrotlar yoluyla gerilim (aralık döngüsü uzunluğu 50 msn'den, aralık duraklama 950 msn) uygulayın.
- 0.5 veya 3 mm elektrot kullanın.
- 33-35 V arasında değişen bir gerilim kullanın
- Kulaktan Primordia posterior elektrot merkezi yerleştirin.
- Hipotalamus 90-180 ° (Şekil 2D) transfect, 25-40 ° ile talamus kullanım açıları transfect.
- Des gibi post elektroporasyon / post-operatif bakım gerçekleştirinbölüm 1.4 açıklanan şekilde. Fareler kurban ve bölüm 3'te tarif edildiği gibi elektroporasyon (E18) sonra, embriyolar 6 gün analiz eder.
3. Perfüzyon Fixation
- Hazırlıklar
- Sıcak% 4 paraformaldehid (PFA) 37 ° C arasındadır.
- PBS ile 50 ml şırınga (4 ° C) ve ısıtılmış PFA ile ikinci bir şırınga doldurun. Kabarcıkları kaçının.
- Üç yollu için şırınga bağlayın. Kanatlı infüzyon seti (kelebek) üçüncü ucunu.
- PBS ile kanatlı infüzyon seti yıkayın.
- Serpilme
- Derin subkutan ketamin hidroklorür uygulama (60 mg / kg) ve ksilazin (7.5 mg / kg) ile (gebe veya doğum sonrası transfekte edilmiş) fareler anestetize.
- Ayak tutam yanıtsızlık cerrahi tolerans sahne onaylayın.
- Sadece göğüs kafesine altında karın boşluğuna açın.
- Dikkatle diyaframı kesti.
- Dikkatle e bir kesim üzerinden göğüs kafesini açmakköprücük kemiği kadar ach sitesi.
- (Kalbin apeks başlayarak) sol kalp odasına kelebeğin ucu takın.
- Sol atriyal apendiks kesin.
- Yavaş yavaş PBS (yaklaşık 10 mi) ile fare serpmek.
- Üç yönlü stopcock geçin.
- 5-10 ml% 4 PFA ile fareyi serpmek.
- Makas kullanılarak fare başını kesmek ve foramen magnum başlayan beyin teşrih. Daha önce 16 yayınlanan diseksiyon.
- % 4 PFA 2 gün beyin Postfixate. Karanlıkta 4 ° C'de tutun beyinleri.
4. İmmünhistokimya
- (Bir vibratome ile örneğin) 70 mikron bölümleri oluşturun.
- İsteğe bağlı: antikor boyama ile floresan geliştirin.
- Oda sıcaklığında 1 saat için bloke bölümleri (% 0.1-0.2 Triton X-100,% 5 normal keçi serumu)
- Uygun bir antikor (: 1000 anti-GFP, 1) ile O / N inkübe
- Yıkama 30.1 M fosfat tamponu ile -5 kez.
- Uygun floresan-konjuge sekonder antikor (: 1000 Alexa Fluor 488 konjuge edilmiş anti-tavşan IgG, 1), 3-5 saat inkübe edin.
- İsteğe bağlı: 1 dakika süre ile (0,1 M fosfat tampon maddesi içinde DAPI, 0.2 ug / ml), 4-6-diaminodino-2-fenilindol ile Counterstain.
- Uygun bir floresan mikroskop ile floresan analiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 2, retrosplenial korteks içine gelişen bölgelerin utero elektroporasyon belirli için örnekler gösterir, motor korteks, somatosensorial korteks, piriform korteks, cornu 1-3 ammonis, dentat girus, striatum, yan septal çekirdek , talamus ve hipotalamus. Transfeksiyonlarının sonuçları tavsiye açı (Şekil 2) yanında gösterilmiştir. In vivo açıları daha iyi görüntülenmesi için elektrot (0,5 mm) konumu da (amniotik kese içinde Şekil 5'te, rahimde embriyo, embriyo, disseke embriyo) bir embriyo üzerinde gösterilir. Sağlamak için genel bir bakış Tablo 1 spesifik transfeksiyon için ilgili gerçekleri özetlenmiştir.
Bundan başka, bu elektrodun boyutu özgüllük (Şekil 6) çok önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Elektrot kürekler büyük boyutlu la yol açarörnek teşkil eden, Şekil 6'da gösterildiği gibi, rger alanları, transfekte edildi. Bundan başka, embriyo çok çok büyük örten elektrodlar, ve böylece embriyolar kalp ritmini (Şekil 7) etki riski artar. Örneğin 10 mm elektrot kürek bütün E12 embriyo (Şekil 7) kapsar.
Utero elektroporasyon Şekil 1.. Utero elektroporasyon performans temel adımlar gösterilmektedir. Bir ocak yerleştirilmiştir fare zaten izofluran ile anestezi ile (A), cerrahinin tüm kurulum gösterir. (B), cerrahi alanın dezenfeksiyonu farenin karın boşluğuna (C) açmadan önce çok önemli bir adımdır. (D) DNA içeren çözelti, hızlı G ile renklendirilirBaşarılı enjeksiyon görselleştirme sağlar reen, (E, F). Lateral ventrikül içine Başarılı enjeksiyon hilal şeklinde spot içine sonuçlanır. Uygun voltaj forseps türü platin elektrotları ile uygulanır Enjeksiyondan sonra (G). (H) dikkatlice cerrahi yara dikilir karın boşluğuna rahim değiştirdikten sonra. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Murin korteks, hipokampüs, yanal septal çekirdek, striatum, talamus belirli alanlara elektroporasyonu ve hipotalamusta Şekil 2. Açılı-haritası. Pozitif ve negatif kutup için uygun pozisyonlar, şematik çizimde gösterilmiştir. (AC için ng>) konumları sağ ventrikül içine bir DNA-çözeltisi enjekte etmek için endikedir. Sol ventrikül içine enjeksiyonlar için, açılar ayna ters bulunmaktadır. Belirli transfeksiyonlar histolojik teyit edildi. (A) kortikal alanlar transfecting için pozitif ve negatif kutup pozisyonları gösterir (retrosplenial korteks (RSC), motor korteks (MC), somatosensorial korteks (SSC) ve piriform korteks (PC). (B) gösterir hipokampal oluşumları transfecting için pozitif ve negatif kutup pozisyonları (cornu 1-3 (CA1, CA2, CA3) ve dentat girus (DG). (C) striatum transfecting için pozitif ve negatif kutup pozisyonları gösterir ammonis (STR) ve Baumgart J. & batağan N., 2015, 12 uyarlanmıştır yanal septal çekirdeği (LS). (D) talamus (TH) ve hipotalamus (HY) transfecting için elektrotların uygun pozisyonları gösterir.. ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/53303/53303fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Delinme sitesi. DNA çözüm enjeksiyon için en uygun pozisyon Yaklaşık lambdoidal sütür ve 0.5 mm koronal 0.75 mm sagital sütür gelen yanal. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Kulak primordiumunun Şekil 4. Pozisyonu. Kulak primordiumunun pozisyonu açıkça (ok) tanımlanır."nk> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Bir embriyo üzerinde açıları Şekil 5. Görselleştirme. Daha iyi görselleştirme için kortikal alanların belirli transfeksiyonları (retrosplenial korteks, motor korteks, somatosensoriyel korteks, piriform pozitif (mavi artı işareti ile gösterilir) ve negatif kutup için uygun pozisyonları korteks), hipokampal alanlar (cornu ammonis (CA) 1-3, dentat girus (DG)),Yanal septal çekirdek, striatum, talamus ve hipotalamus utero bir embriyo gösterilir, amniyon kesesinde ve disseke embriyo (bütün E15,5) bir embriyo. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Elektrot boyutuna bağlı olarak transfeksiyonunun Şekil 6. Özgünlük. Elektrot raketin Artırıldı boyutu transfeksiyonunun özgünlüğünü azaltır. Bu geç embriyonik aşamalarda (E17, alt) özellikle genç embriyonik aşamalarında (E12, üst) bariz, ama aynı zamanda görülebilir. Baumgart J. & batağan N., 2015, 12 uyarlanmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Bir E12 embriyo büyüklüğüne göre elektrot raket Şekil 7. Boyut. Embriyonun çok çok büyük kapak ve bu nedenle kalp ritminin sevgi riskini artırabilir elektrotlar. Örneğin, (sağda) 10 mm elektrot özgünlüğü temel amacı olmasa bile, bütün E12 embriyo kapsar ve bu nedenle tavsiye edilmez. Baumgart J. & batağan N., 2015, 12 uyarlanmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Hedeflenen bölge | Açı | Elektrot konumu | Embriyonun Yaş | DNA Amount / konsantrasyon | Voltaj | Elektrot boyutları | |
| Retrosplenial kortekste | 330 ° - 0 ° | Kulak primordia elektrotların merkezi sadece ön | E14 (E11-E17) | 1.5- 2 ul / / Ml 2.7- 2 ug | 36- 38 | 3- 5 mm | |
| Motor korteks | 0 ° - 40 ° | Kulak primordia elektrotların merkezi sadece ön | E14 (E11-E17) | 1.5- 2 ul / / Ml 2.7- 2 ug | 36- 38 | 3- 5 mm | |
| Somatosensori Cortex | 40 ° - 95 ° | Kulak primordia elektrotların merkezi sadece ön | E14 (E11-E17) | 1.5- 2 ul / / Ml 2.7- 2 ug | 36- 38 | 3- 5 mm | |
| Piriform Cortex | 95 ° - 110 ° | Kulak primordia elektrotların merkezi sadece ön | E14 (E11-E17) | 1.5- 2 ul / / Ml 2.7- 2 ug | 36-3 8 | 3- 5 mm | |
| Cornu ammonis (CA) 1 | 250 ° - 275 ° | Kulak primordiumunun ortasında pozitif kutup Merkezi | (E14-) E15 | 2 ul / / Ml 2 ug | 38- 40 | 3- 5 mm | |
| CA2 | 230 ° - 250 ° | Kulak primordiumunun ortasında pozitif kutup Merkezi | (E14-) E15 | 2 ul / / Ml 2 ug | 38- 40 | 3- 5 mm | |
| CA3 | 210 ° - 230 ° | Kulak primordiumunun ortasında pozitif kutup Merkezi | (E14-) E15 | 2 ul / / Ml 2 ug | 38- 40 | 3- 5 mm | |
| Kıvrımlarının | 190 ° - 210 ° | Kulak primordiumunun ortasında pozitif kutup Merkezi | (E14-) E15 | 2 ul / / Ml 2 ug | 38- 40 | 3- 5 mm | |
| Striatum | 170 ° - 240 ° | Kulak primordia seviyesinde elektrot hizmetleri | E12 | 1 ul / / Ul 4 ug | 33 | 0,5 mm | |
| Yanal Septal Nucleus | 100 ° - 170 ° | Kulak primordia seviyesinde elektrot hizmetleri | E12 | 1 ul / / Ul 4 ug | 33 | 0,5 mm | |
| Talamus | 25 ° - 40 ° | Electodes merkezi sadece kulak pri posteriormordia | E12- E13 | 1-1,5 ul / / Ml 4-2,7 ug | 33- 35 | 0.5- 3 mm | |
| Hipotalamus | 90 ° - 180 ° | Electodes merkezi sadece kulak Primordia posterior | E12- E13 | 1-1,5 ul / / Ml 4-2,7 ug | 33- 35 | 0.5- 3 mm | |
Tablo 1:. Sonuçların Özeti bu tabloda dahil açıklanan kortikal alanların belirli transfeksiyon ilgili tüm bilgiler. Bu hedeflenen bölge, açı, elektrodun pozisyonu, embriyonik aşamada, DNA çözeltisi, gerilim uygulanan miktarı ve konsantrasyonu ve elektrot boyutu hakkında ayrıntılı bilgiler yer almaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Fast Green | Roth | 0301.1 | |
| pCAGGS | Addgene | ||
| borosilicate glass capillaries (0.8-0.9 mm diameter) | Wold Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| Isoflurane (Forene) | Abbott | PZN 4831850 | |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer GmbH | approval number: 400684.00.00 | |
| eye ointment (Bepanthen Augen und Nasensalbe) | Bayer | PZN 01578681 | |
| 0.9% benzyl alcohol 0.9% saline solution | Pharmacy of the University Medical Center Mainz |
||
| gauze (ES-Kompressen) | Hartmann | 407835 | |
| sterile 5-0 Perma-Hand Silk Suture | Ethicon Johnson & Johnson | K890H | |
| ring forceps 1/ 1.5 mm | Fine Science Tools | 11101-09 | |
| ring forceps 4.8/ 6 mm | Fine Science Tools | 11106-09 | |
| ring forceps 2.2/ 3 mm | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Adson Forceps-Serrated Straight 12 cm | Fine Science Tools | 1106-12 | |
| IrisScissors-Delicate Straight-Sharp/Blunt 10 cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Mayo-Stille Scissors-Straight 15 cm | Fine Science Tools | 14012-15 | |
| Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Castroviejo NeedleHolder-with Lock-Tungsten Carbide 14 cm | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Elektroporator CUY21 SC | Nepa Gene Co. | ||
| FST 250 Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Microgrinder EG-44 | Narishige | ||
| P-97 Micropette Puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Platinum electrodes 650P 0.5 mm | Nepagene | CUY650P0.5 | |
| Platinum electrodes 650P 3 mm | Nepagene | CUY650P3 | |
| Platinum electrodes 650P 5 mm | Nepagene | CUY650P5 | |
| Platinum electrodes 650P 10 mm | Nepagene | CUY650P10 | |
| Anesthesia system | Rothacher-Medical GmbH | CV-30511-3 Vapor 19.3 | |
| Heating plate | Rothacher-Medical GmbH | HP-1M | |
| Temperature Controller 220V AC | Rothacher-Medical GmbH | TCAT-2LV |
References
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19 Suppl 1. (July), i120-i125 (1991).
- Nakahira, E., Yuasa, S. Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation. J Comp Neurol. 483 (3), 329-340 (2005).
- Navarro-Quiroga, I., Chittajallu, R., Gallo, V., Haydar, T. F. Long-term, selective gene expression in developing and adult hippocampal pyramidal neurons using focal in utero electroporation. J Neurosci. 27 (19), 5007-5011 (2007).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. J Neurosci Methods. 143 (2), 151-158 (2005).
- Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. M. Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders. FNMOL. 4 (November), 37 (2011).
- Tomita, K., Kubo, K. I., Ishii, K., Nakajima, K. Disrupted-in-schizophrenia-1 (Disc1) is necessary for migration of the pyramidal neurons during mouse hippocampal development. Hu Mol Gen. 20 (14), 2834-2845 (2011).
- Niwa, M., Kamiya, A., et al. Knockdown of DISC1 by In Utero Gene Transfer Disturbs Postnatal Dopaminergic Maturation in the Frontal Cortex and Leads to Adult Behavioral Deficits. Neuron. 65 (4), 480-489 (2010).
- Nakahira, E., Kagawa, T., Shimizu, T., Goulding, M. D., Ikenaka, K. Direct evidence that ventral forebrain cells migrate to the cortex and contribute to the generation of cortical myelinating oligodendrocytes. Dev Biol. 291 (1), 123-131 (2006).
- Baumgart, J., Grebe, N. C57BL/6-specific conditions for efficient in utero electroporation of the central nervous system. J Neurosci Methods. 240, 116-124 (2015).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. JoVE. (54), (2011).
- Guedel, A. E. Inhalation anesthesia: a fundamental guide. , Macmillan. New York. (1937).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. JoVE. (65), e3564 (2012).
- Mizutani, K., Saito, T. Progenitors resume generating neurons after temporary inhibition of neurogenesis by Notch activation in the mammalian cerebral cortex. Development. 132 (6), 1295-1304 (2005).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev, Growth & Differ. 50 (6), 507-511 (2008).
