Introduction
Desde a primeira descrição em 2001 por três grupos independentes 1-3 i n útero electroporação tornou-se uma ferramenta padrão amplamente utilizado para analisar a expressão génica no sistema nervoso central de roedores. Em comparação com a geração de camundongos knockout, que é, apesar de técnicas de melhoria contínua, ainda que consome tempo e dinheiro, os apelos in utero eletroporação, devido à sua simplicidade. Então, in utero eletroporação permite gain- rápido e eficiente e perda de função estudos 4.
Para transfectar as regiões cerebrais, a solução contendo o plasmídeo carregado negativamente é injectada num ventrículo. Durante o pulso eléctrico, o DNA carregado negativamente migra em direcção ao pólo positivo e, por conseguinte, a região transfectadas podem ser seleccionadas simplesmente alterando a posição do pólo positivo. Tem sido frequentemente demonstrado que várias regiões do sistema nervoso central pode ser TArgeted 3,5-8. Por exemplo, estudos recentes mostram transfecções específicos do hipocampo, córtex piriforme ou o estriado 9-11. No entanto, as informações sobre as posições adequadas são muitas vezes apenas mal padronizados e nem sempre são fáceis de transferir para diferentes linhagens de camundongos.
A transfecção de certos estágios embrionários está longe de ser trivial. Muitos fatores influenciam deve ser levado em consideração ao escolher o set-up para específica in utero eletroporação. Em primeiro lugar, para transfectar de forma otimizada as respectivas fases embrionárias, é necessário o conhecimento sobre as tensões apropriadas. Altas tensões diminuir a taxa de sobrevivência, enquanto que baixas voltagens reduzem a eficiência de transfecção 2,3,12. Também o tamanho da pá eletrodo desempenha um papel crucial, porque o uso de pás de eletrodos que são demasiado grandes resultados em menor especificidade ou podem causar a morte devido ao carinho do ritmo cardíaco 4,12,13. O aplicadatensão e do tamanho e da posição do eletrodo de remo são as características mais importantes a considerar, mas também há outros fatores que influenciam o resultado da eletroporação, como a quantidade aplicada de solução de DNA.
Nós desenvolvemos um protocolo detalhado que permite a transfecção rápido e eficiente de várias regiões do cérebro de C57BL / 6 rato 12. Neste protocolo de informação detalhada sobre as tensões para ser usado e o tamanho do eléctrodo de pá para uma maior especificidade é fornecido. Além disso, as informações sobre o ventrículo para ser preenchido, juntamente com as recomendações para a quantidade de solução de plasmídeo e a posição do eléctrodo é fornecido. A indicação das informações de posição detalhada em um mapa e de uma maior visualização destas posições permite específica simples e eficiente in utero eletroporação do córtex retrosplenial, o córtex motor, o córtex somatossensorial, o córtex piriforme t,cornu Ammonis ele 1-3, o giro denteado, o estriato, o núcleo septal lateral, no tálamo e hipotálamo.
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Protocol
Declaração de Ética: A manipulação dos ratos e os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com as directrizes europeias, nacionais e institucionais para cuidados com os animais.
1. In Utero Eletroporação
Nota: No útero electroporação foi realizada como publicado anteriormente 12,14. Portanto, o método só é descrito resumidamente a seguir (Figura 1).
- Preparativos
- Preparar a solução rápida de cor verde livre de endotoxina avançada plasmídeo transfecção-grade (contendo 1,5 pCAGGS), como descrito anteriormente 12.
- Puxe e moer (35 ° de ângulo de capilares de vidro de borosilicato) (0,8-0,9 de diâmetro) para injectáveis.
- Esterilizar instrumentos.
- Cirurgia
- Administrar analgésicos (carprofeno, 4 mg / kg de peso corporal, sc, 24 h) depósito, pelo menos, 30 min antes de iniciar a cirurgia.
- Manter o comprimento dea anestesia para um máximo de 35-45 min (fase III - fase de anestesia cirúrgica de acordo com a Guedel 15 - máximo de 25-30 min).
- Anestesiar ratos cronometrados grávidas com isoflurano (indução de uma câmara de: 2,8%, a cirurgia por máscara: 2,5%). Confirme anestesia por falta de resposta aos pés-pitada.
- Aplicar pomada para evitar a secura ocular durante a anestesia.
- Esterilizar a área cirúrgica com 7,5% de solução providona-Iodo e cobrir o mouse com gaze estéril (úmido com solução salina 0,9% benzilo álcool), com apenas a área cirúrgica exposta.
- Cortar abrir a cavidade abdominal com um bisturi (incisão na pele: 1.5-2 cm, incisão muscular: 1-1,5 cm).
- Preserve a cavidade abdominal aberta de secar umedecendo com solução salina aquecida álcool benzílico a 0,9% ou outra solução isotônica estéril como dirigido por pessoal veterinário ou comitê.
- Extrair cuidadosamente cornos uterinos (usando uma pinça de anel, não toque no útero com o dedos).
- A injecção de ADN e electroporação. Nota: Os detalhes exatos para segmentar regiões específicas são indicadas na secção 2.
- Injectar-se lentamente a solução de cor de ADN para o ventrículo como indicado na Figura 1 e da secção 2 através dos capilares de borosilicato preparados.
- Aplique a tensão adequada para a fase embrionária correspondente (por exemplo., 36-38 V para E14) através de eletrodos especializados pinças-platina (ciclo de intervalo de comprimento de 50 ms, intervalo de pausa 950 ms). As pás de electroporação de pulso durante a aplicação da tensão para minimizar os danos da parede uterina.
- Publicar eletroporação / cuidados pós-operatórios
- Recolocar cuidadosamente os cornos uterinos na cavidade abdominal.
- Suturar o músculo e a incisão na pele separadamente.
- Deixe o resto do mouse em um dispositivo de suporte térmico para a recuperação.
- Supervisionar o mouse durante a recuperação (comportamento, alimentação econsumo de água), 4 horas, 24 horas e 48 horas após a cirurgia. Se necessário, aplicar analgésicos adicionais (carprofeno, 4 mg / kg de peso corporal, 24 horas depósito) para mais 2 dias.
2. A transfecção de áreas cerebrais específicas
Nota: A posição do pólo positivo é mostrado como o ângulo entre a linha de centro vertical através do ventrículo preenchido com a solução de ADN (o ventrículo direito ou terceira) e a posição do pólo positivo. Ao encher o ventrículo esquerdo as posições são invertidas-espelho. Na Figura 4 as posições da orelha primordial são mostrados, que fornecem importantes pontos de referência.
- A transfecção de áreas corticais (Figura 2A, a Tabela 1).
- Realizar a cirurgia, como descrito na seção 1.2. Para a electroporação em útero de áreas corticais utilizar embriões E14.
- Injectar 1,5-2 ul de solução de ADN-ADN contendo 4 ug no ventrículo lateral direitoatravés dos capilares de borosilicato preparados.
- Posicione cuidadosamente o embrião usando uma pinça anel de modo que não há vasos visíveis acima do local da punção.
- Injectar-se lentamente a solução de DNA de aproximadamente 0,75 mm coronal da sutura lambdoidal e 0,5 mm lateral da sutura sagital (Figura 3). Certifique-se que a profundidade de inserção é de 1,2 mm (E14, medido a partir da parede uterina). Verifique se há uma coloração azul-verde com uma demarcação nítida.
- Aplicar tensão através das pinças-eletrodos de platina especializados (ciclo de intervalo de comprimento de 50 ms, o intervalo de pausa 950 ms).
- Use um eletrodo de pá 3 ou 5 mm.
- Utilize uma tensão que varia de 36-38 V.
- Colocar o centro dos eléctrodos apenas anterior dos primórdios da orelha.
- Para transfectar os ângulos de uso córtex retrospl�icos 330-0 °, para transfectar o córtex motor 0-40 °, para transfectar o córtex somatossensorial 40-95 °, para transfectaro córtex piriforme 95-110 ° (Figura 2A).
- Execute pós eletroporação / cuidados pós-operatórios, como descrito na secção 1.4. Sacrificar os ratos e analisar os embriões de 4 dias após a eletroporação (E18) conforme descrito na seção 3.
- A transfecção do hipocampo (Figura 2B, Quadro 1).
- Realizar a cirurgia, como descrito na seção 1.2. Para a electroporação em útero de formação hipocampal utilizar embriões E15.
- Injectar-2 uL de solução de ADN contendo 4 ug de ADN no ventrículo lateral direito através dos capilares de borosilicato preparados.
- Aplicar tensão através das pinças-eletrodos de platina especializados (ciclo de intervalo de comprimento de 50 ms, o intervalo de pausa 950 ms).
- Use um eletrodo de pá 3 ou 5 mm.
- Utilize uma tensão que varia de 38-40.
- Colocar o centro do pólo negativo imediatamente anterior à orelha e o primórdio do centro Of o pólo positivo no meio de o primórdio da orelha.
- Para transfectar as giro dentado usar ângulos de 190-210 °, para transfectar as Ammonis cornu (CA) 3 210-230 °, para transfectar as CA2 230-250 °, para transfectar as CA1 250-275 ° (Figura 2B).
- Execute pós eletroporação / cuidados pós-operatórios, como descrito na secção 1.4. Análise após a formação do hipocampo completo (após o nascimento, p21) executar conforme descrito na seção 3.
- A transfecção do núcleo septal lateral e corpo estriado (Figura 2C, Tabela 1)
Nota: Os ângulos de sobreposição com aqueles para transfecção do hipocampo. Para transfectar eficazmente o núcleo septal lateral e o corpo estriado sem transfecção hipocampo indesejado fases anteriores embrionárias (E12) tem que ser usado.- Realizar a cirurgia, como descrito na seção 1.2. Para a electroporação in utero do núcleo septal lateral e striathum usar embriões E12.
- Injectar 1 ul de solução de ADN-contendo 4 ug de ADN no ventrículo lateral direito através dos capilares de borosilicato preparados.
- Aplicar tensão através das pinças-eletrodos de platina especializados (ciclo de intervalo de comprimento de 50 ms, o intervalo de pausa 950 ms).
- Usar um eléctrodo de 0,5 mm.
- Use 33 V.
- Colocar o centro dos eléctrodos ao nível dos primórdios da orelha.
- Para transfectar os ângulos de uso do núcleo septal lateral 100-170 °, para transfectar as estriado 170-240 ° (Figura 2C).
- Execute pós eletroporação / cuidados pós-operatórios, como descrito na secção 1.4. Sacrificar os ratos e analisar os embriões 6 dias após a eletroporação (E18) conforme descrito na seção 3.
- A transfecção do tálamo e hipotálamo (Figura 2D, Tabela 1)
- Realizar a cirurgia, como descrito na seção 1.2. Para o em Utero eletroporação do tálamo e hipotálamo uso de embriões E12-E13.
- Injectar-1-1,5 ul de solução de ADN contendo 4 ug de ADN no ventrículo lateral (esquerda ou direita) através de capilares de borosilicato preparados. Espera durante 2-3 min, até a solução se difunde para o terceiro ventrículo. Alternativamente injectar directamente no terceiro ventrículo.
Nota: Isso melhora especificidade, mas pode causar uma taxa de sobrevivência diminuiu (de alto risco de danos). - Aplicar tensão através das pinças-eletrodos de platina especializados (ciclo de intervalo de comprimento de 50 ms, o intervalo de pausa 950 ms).
- Usar um eléctrodo 0,5 ou 3 mm.
- Utilize uma tensão que varia de 33-35 V.
- Colocar o centro dos eléctrodos apenas posterior os primórdios da orelha.
- Para transfectar os ângulos de utilização a partir de 25-40 ° tálamo, para transfectar o hipotálamo 90-180 ° (Figura 2D).
- Execute pós eletroporação / cuidados pós-operatórios como descrita no ponto 1.4. Sacrificar os ratos e analisar os embriões 6 dias após a eletroporação (E18) conforme descrito na seção 3.
3. Perfusão Fixation
- Preparativos
- Quente 4% de paraformaldeído (PFA) a 37 ° C.
- Encha uma seringa de 50 ml com PBS (4 ° C) e uma segunda seringa aquecido com PFA. Evite bolhas.
- Conecte as seringas a uma torneira de três vias. Conecte o terceiro fim a um conjunto de infusão voada (borboleta).
- Lave o conjunto de infusão voado com PBS.
- Perfusão
- Profundamente anestesiar os ratos (ou pós-natal grávida transfectadas) com aplicação subcutânea de cloridrato de cetamina (60 mg / kg) e xilazina (7,5 mg / kg).
- Confirme o estágio de tolerância cirúrgico por falta de resposta aos pés-pitada.
- Abra a cavidade abdominal logo abaixo da caixa torácica.
- Corte cuidadosamente o diafragma.
- Cuidadosamente abra a caixa torácica através de um corte na each local até a clavícula.
- Inserir a ponta da borboleta para dentro da câmara do coração esquerdo (a partir do ápice do coração).
- Corte o apêndice atrial esquerdo.
- Lentamente perfundir o rato com PBS (aproximadamente 10 ml).
- Alterne a torneira de três vias.
- Perfundir o mouse com 5-10 ml PFA 4%.
- Decapitar o mouse com uma tesoura e dissecar o cérebro começando no forame magno. Realize a dissecção como publicado anteriormente 16.
- Postfixate o cérebro por 2 dias em PFA 4%. Manter os cérebros a 4 ° C no escuro.
4. A imuno-histoquímica
- Gerar 70 um secções (por exemplo, com um vibratome).
- Opcional: aumentar a fluorescência com coloração de anticorpos.
- Bloquear as secções durante 1 hora à temperatura ambiente (0,1-0,2% de Triton X-100, 5% de soro de cabra normal)
- Incubar O / N com o anticorpo apropriado (anti-GFP, 1: 1000)
- Lavar 3-5 Vezes com tampão de 0,1 M fosfato.
- Incubar 3-5 h com o anticorpo secundário conjugado com fluorescência apropriado (Alexa Fluor 488 anti-coelho-IgG conjugada, 1: 1000).
- Opcional: contracoloração com 4-6-diaminodino-2-fenilindole (DAPI, 0,2 g / ml em tampão fosfato 0,1 M) durante 1 min.
- Analise de fluorescência com um microscópio de fluorescência apropriado.
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Representative Results
A Figura 2, mostra exemplos para a específica in utero electroporação das regiões em desenvolvimento para o córtex retroesplenial, o córtex motor, o córtex somatossensorial, o córtex piriforme, o cornu Ammonis 1-3, o giro denteado, o estriato, o núcleo septal lateral , o tálamo eo hipotálamo. Os resultados das transfecções são mostrados a seguir ao ângulo recomendado (Figura 2). Para melhor visualização dos ângulos in vivo a posição do eléctrodo (0,5 mm) também são exibidas um embrião (figura 5, embrião no útero, embrião no saco amniótico, dissecados de embriões). A fim de fornecer uma visão geral Tabela 1 resumiu os factos relevantes para transfecção específico.
Além disso, demonstrou-se que o tamanho do eléctrodo desempenha um papel crucial para a especificidade (Figura 6). O maior tamanho das pás de eletrodos leva a larger áreas transfectadas, como exemplar mostrada na Figura 6. Além disso, os eléctrodos que são demasiado grandes demais tampa do embrião, aumentando assim o risco de afectar o ritmo cardíaco embriões (Figura 7). Por exemplo um eléctrodo de pá 10 mm cobre todo o embrião E12 (Figura 7).
Figura 1. No útero electroporação. Os passos básicos do desempenho da electroporação em útero são mostrados. (A) Mostra toda a configuração da cirurgia, com o mouse colocado numa placa de aquecimento já anestesiados com isoflurano. (B) A desinfecção da área cirúrgica é um passo crucial antes de abrir a cavidade abdominal (C) do rato. (D) A solução contendo o DNA é colorida com Fast Lreen, o que permite a visualização de injecção bem sucedida (E, F). Injeção de sucesso em um ventrículo lateral resulta em mancha em forma de meia-lua. (G) Após a injecção a tensão apropriada é aplicada através de eléctrodos de platina do tipo pinça. (H) Depois de substituir cuidadosamente o útero para a cavidade abdominal da ferida cirúrgica é suturada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Ângulo-mapa para electroporação de áreas específicas no córtex murino, hipocampo, núcleo septal lateral, estriado, tálamo e hipotálamo. As posições apropriadas para o pólo positivo e negativo, são indicados no desenho esquemático. Para (AC ng>) as posições são indicados para injectar a solução de DNA-para o ventrículo direito. Para injeções no ventrículo esquerdo, os ângulos são invertido-espelho. As transfecções foram específicos verificada histologicamente. (A) mostra as posições do pólo positivo e negativo para a transfecção de áreas corticais (o córtex retroesplenial (RSC), o córtex motor (MC), o córtex somatossensorial (SSC) e do córtex piriforme (PC). (B) mostra o posições de pólo positivo e negativo para a transfecção das formações do hipocampo (cornu Ammonis a 1-3 (CA1, CA2, CA3) e o giro dentado (DG). (C) mostra as posições dos pólo positivo e negativo para a transfecção do estriado (STR) eo núcleo do septo lateral (LS). (D) Mostra as posições adequadas dos eléctrodos para transfecção do tálamo (TH) e hipotálamo (HY). Adaptado de Baumgart J. & Grebe N. de 2015 12. ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/53303/53303fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. O local da punção. A posição óptima para a injecção da solução de DNA é aproximadamente 0,75 mm coronal da sutura lambdoidal e 0,5 mm lateral da sutura sagital. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Posição de o primórdio da orelha. A posição de o primórdio da orelha está claramente definido (seta).nk "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Visualização dos ângulos de um embrião. Para melhor visualização nas posições apropriadas para o pólo positivo (indicado com um sinal de mais azul) eo negativo para transfections específicas das áreas corticais (córtex retrosplenial, córtex motor, córtex somatosensorial, piriformes córtex), as áreas do hipocampo (cornu Ammonis (CA) 1-3, dentate gyrus (DG)),o núcleo do septo lateral, o estriado, tálamo e hipotálamo são mostrados em um embrião no útero, um embrião no saco amniótico e em um embrião dissecados (tudo E15,5). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. A especificidade da transfecção, dependendo do tamanho do eléctrodo. Aumento do tamanho da pá eléctrodo reduz a especificidade da transfecção. Isto é especialmente evidente nos mais jovens estágios embrionários (E12, top), mas também visível no final dos estágios embrionários (E17, inferior). Adaptado de Baumgart J. & Grebe N. de 2015 12. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7. Tamanho da pá do eléctrodo em comparação com o tamanho de um embrião E12. Os eléctrodos que são demasiado grandes demais tampa do embrião e, portanto, aumentar o risco de afecção do ritmo cardíaco. Por exemplo, um eléctrodo 10 mm (à direita) cobre todo o embrião E12 e, portanto, não é recomendado, mesmo se a especificidade não é o objectivo primário. Adaptado de Baumgart J. & Grebe N. de 2015 12. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Região de destino | Ângulo | Posição do eléctrodo | Age of embrião | Amou DNAconcentração de NT / | Voltagem | Tamanho do eléctrodo | |
| Cortex retrospl�ico | 330 ° - 0 ° | Centro dos eléctrodos apenas anterior da orelha primórdio | E14 (E11-E17) | 1.5- 2 ul / 2.7- 2 ug / uL | 36- 38 | 3- 5 milímetros | |
| Motor Cortex | 0 ° - 40 ° | Centro dos eléctrodos apenas anterior da orelha primórdio | E14 (E11-E17) | 1.5- 2 ul / 2.7- 2 ug / uL | 36- 38 | 3- 5 milímetros | |
| Córtex somatosensorial | 40 ° - 95 ° | Centro dos eléctrodos apenas anterior da orelha primórdio | E14 (E11-E17) | 1.5- 2 ul / 2.7- 2 ug / uL | 36- 38 | 3- 5 milímetros | |
| Piriform Cortex | 95 ° - 110 ° | Centro dos eléctrodos apenas anterior da orelha primórdio | E14 (E11-E17) | 1.5- 2 ul / 2.7- 2 ug / uL | 36-3 8 | 3- 5 milímetros | |
| Cornu Ammonis (CA) 1 | 250 ° - 275 ° | Centro do pólo positivo no meio de o primórdio da orelha | (E14-) E15 | 2 ul / 2 ug / uL | 38- 40 | 3- 5 milímetros | |
| CA2 | 230 ° - 250 ° | Centro do pólo positivo no meio de o primórdio da orelha | (E14-) E15 | 2 ul / 2 ug / uL | 38- 40 | 3- 5 milímetros | |
| CA3 | 210 ° - 230 ° | Centro do pólo positivo no meio de o primórdio da orelha | (E14-) E15 | 2 ul / 2 ug / uL | 38- 40 | 3- 5 milímetros | |
| Dentate Gyrus | 190 ° - 210 ° | Centro do pólo positivo no meio de o primórdio da orelha | (E14-) E15 | 2 ul / 2 ug / uL | 38- 40 | 3- 5 milímetros | |
| Estriado | 170 ° - 240 ° | Centro dos eléctrodos ao nível da orelha primórdio | E12 | 1 ul / 4 ug / uL | 33 | 0,5 mm | |
| Lateral Septal Nucleus | 100 ° - 170 ° | Centro dos eléctrodos ao nível da orelha primórdio | E12 | 1 ul / 4 ug / uL | 33 | 0,5 mm | |
| Tálamo | 25 ° - 40 ° | Centro das electodes apenas posterior a pri ouvidomórdios | E12- E13 | 1-1,5 ul / 4-2,7 ug / uL | 33- 35 | 0,5- 3 mm | |
| Hipotálamo | 90 ° - 180 ° | Centro dos electodes apenas posterior da orelha primórdio | E12- E13 | 1-1,5 ul / 4-2,7 ug / uL | 33- 35 | 0,5- 3 mm | |
Tabela 1:. Resumo dos resultados Incluem-se nesta tabela é toda a informação relevante para a transfecção específico das áreas corticais descritas. Ele contém detalhes sobre a região alvo, o ângulo, a posição do eléctrodo, o estágio embrionário, a quantidade aplicada e a concentração da solução de DNA, a tensão e o tamanho do eléctrodo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Fast Green | Roth | 0301.1 | |
| pCAGGS | Addgene | ||
| borosilicate glass capillaries (0.8-0.9 mm diameter) | Wold Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| Isoflurane (Forene) | Abbott | PZN 4831850 | |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer GmbH | approval number: 400684.00.00 | |
| eye ointment (Bepanthen Augen und Nasensalbe) | Bayer | PZN 01578681 | |
| 0.9% benzyl alcohol 0.9% saline solution | Pharmacy of the University Medical Center Mainz |
||
| gauze (ES-Kompressen) | Hartmann | 407835 | |
| sterile 5-0 Perma-Hand Silk Suture | Ethicon Johnson & Johnson | K890H | |
| ring forceps 1/ 1.5 mm | Fine Science Tools | 11101-09 | |
| ring forceps 4.8/ 6 mm | Fine Science Tools | 11106-09 | |
| ring forceps 2.2/ 3 mm | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Adson Forceps-Serrated Straight 12 cm | Fine Science Tools | 1106-12 | |
| IrisScissors-Delicate Straight-Sharp/Blunt 10 cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Mayo-Stille Scissors-Straight 15 cm | Fine Science Tools | 14012-15 | |
| Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Castroviejo NeedleHolder-with Lock-Tungsten Carbide 14 cm | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Elektroporator CUY21 SC | Nepa Gene Co. | ||
| FST 250 Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Microgrinder EG-44 | Narishige | ||
| P-97 Micropette Puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Platinum electrodes 650P 0.5 mm | Nepagene | CUY650P0.5 | |
| Platinum electrodes 650P 3 mm | Nepagene | CUY650P3 | |
| Platinum electrodes 650P 5 mm | Nepagene | CUY650P5 | |
| Platinum electrodes 650P 10 mm | Nepagene | CUY650P10 | |
| Anesthesia system | Rothacher-Medical GmbH | CV-30511-3 Vapor 19.3 | |
| Heating plate | Rothacher-Medical GmbH | HP-1M | |
| Temperature Controller 220V AC | Rothacher-Medical GmbH | TCAT-2LV |
References
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