Introduction
Sinds de eerste beschrijving in 2001 door drie onafhankelijke groepen 1-3 i n utero elektroporatie is een veel gebruikte standaard voor de analyse van genexpressie bij knaagdieren centrale zenuwstelsel. Vergeleken met het genereren van knockout muizen, die ondanks continue verbetering van de technieken, nog tijd en geld kost, de in utero elektroporatie beroep vanwege zijn eenvoud. Dus, in de baarmoeder elektroporatie maakt snel en efficiënt gain en verlies-van-functie studies 4.
Om de cerebrale gebieden transfecteren, wordt de oplossing die de negatief geladen plasmide geïnjecteerd in een hartkamer. Tijdens de elektrische puls, de negatief geladen DNA migreert naar de positieve pool en derhalve de getransfecteerde gebied kan eenvoudig worden geselecteerd door het veranderen van de positie van de positieve pool. Het is herhaaldelijk aangetoond dat talrijke gebieden van het centrale zenuwstelsel kan worden targeted 3,5-8. Bijvoorbeeld, recente studies tonen specifieke transfecties van de hippocampus, de piriformis cortex of het striatum 9-11. De informatie over de geschikte posities zijn vaak slechts nauwelijks gestandaardiseerd en zijn niet altijd eenvoudig tussen verschillende muizenstammen.
Transfectie van bepaalde embryonale stadia verre van triviaal. Vele invloedsfactoren moet rekening worden gehouden bij de keuze van de set-up voor de specifieke in de baarmoeder elektroporatie. Eerst optimaal transfecteren de respectievelijke embryonale stadia, is kennis over de juiste voltages vereist. Hoge spanningen verminderen de overlevingskans, terwijl lage spanningen verminderen van de transfectie-efficiëntie 2,3,12. Ook de grootte van de elektrode peddel speelt een cruciale rol, omdat het gebruik van elektrode peddels te grote uitslagen in gereduceerde specificiteit of kan de dood veroorzaken door aantasting van het hartritme 4,12,13. De toegepastespanning en de grootte en de positie van de elektrode schoep zijn de belangrijkste kenmerken te overwegen, maar er zijn ook andere factoren die de uitkomst van de elektroporatie, zoals de toegepaste hoeveelheid DNA-oplossing.
We hebben een gedetailleerd protocol dat snelle en efficiënte transfectie van diverse cerebrale gebieden van de C57BL / 6 muis 12 maakt ontwikkeld. In dit protocol gedetailleerde informatie over de spanningen worden gebruikt en de afmeting van de elektrode peddel voor verbeterde specificiteit verschaft. Verdere informatie over het ventrikel te vullen met aanbevelingen voor de hoeveelheid plasmide-oplossing en de positie van de elektrode wordt geleverd. De aanduiding van de gedetailleerde positie-informatie in de kaart en de verdere visualisatie van deze posities mogelijk maakt eenvoudige specifiek en efficiënt in utero elektroporatie van de retrospleniale cortex, de motorische cortex, de somatosensorische cortex, de piriformis cortex t,Hij cornu ammonis 1-3, de dentate gyrus, de striatum, de laterale septum nucleus, de thalamus en hypothalamus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek Verklaring: De behandeling van de muizen en de experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Europese, nationale en institutionele richtlijnen voor de verzorging van de dieren.
1. In Utero Elektroporatie
Opmerking: In utero elektroporatie werd uitgevoerd zoals eerder gepubliceerd 12,14. Derhalve is de werkwijze slechts kort hieronder beschreven (figuur 1).
- Voorbereidingen
- Bereid snel groen gekleurde endotoxinevrij geavanceerde transfectie-grade plasmide-oplossing (met daarin 1,5 pCAGGS) zoals eerder beschreven 12.
- Trek en grind (35 ° hoek) borosilicaatglas haarvaten (0,8-0,9 diameter) voor injecties.
- Steriliseren instrumenten.
- Chirurgie
- Dien analgetica (carprofen, 4 mg / kg lichaamsgewicht, sc, 24 uur depot) ten minste 30 minuten voordat de operatie.
- Houd de lengte vande anesthesie maximaal 35-45 min (Fase III - fase van chirurgische anesthesie volgens Guedel 15 - maximaal 25-30 min).
- Verdoven getimede zwangere muizen met isofluraan (inductie in een kamer: 2,8%, een operatie via masker: 2,5%). Bevestig verdoving door ongevoeligheid tot teen-snuifje.
- Gelden oogzalf om eye-droogheid tijdens anesthesie te voorkomen.
- Steriliseren van de chirurgische gebied met 7,5% providon-Jodium-oplossing en hebben betrekking op de muis met een steriel gaasje (vochtig met 0,9% benzylalcohol zoutoplossing) met alleen de chirurgische gebied blootgelegd.
- Opengesneden de buikholte met een scalpel (huidincisie: 1,5-2 cm, spier incisie: 1-1,5 cm).
- Het behoud van de open buikholte uitdroogt door het bevochtigen met verwarmde 0,9% benzylalcohol zoutoplossing of andere steriele isotone oplossing zoals voorgeschreven door het veterinaire personeel of commissie.
- Zorgvuldig te extraheren baarmoederhoorns (met ring tang, doen de baarmoeder met de vinger aanrakens).
- Injectie van DNA en elektroporatie. Opmerking: De exacte details voor het richten op specifieke regio's zijn vermeld in paragraaf 2.
- Injecteer langzaam de gekleurde DNA-oplossing in de ventrikel zoals in figuur 1 en punt 2 via de bereide borosilicaat capillairen.
- Breng de juiste spanning voor de overeenkomstige embryonale fase (bijv., 36-38 V voor E14) via gespecialiseerde tang-type platina-elektroden (interval cyclus lengte 50 msec, interval pauze 950 msec). Pulse de elektroporatie peddels tijdens het aanbrengen van de spanning op beschadiging van de baarmoederwand te minimaliseren.
- Bericht elektroporatie / post-operatieve zorg
- Plaats voorzichtig de uterine hoorns in de buikholte.
- Hechtdraad de spieren en de huid incisie afzonderlijk.
- Laat de muis rusten op een thermische ondersteuning apparaat voor het herstel.
- Begeleiden de muis tijdens het herstel (gedrag, voer enwaterverbruik), 4 uur, 24 uur en 48 uur na de operatie. Eventueel toepassen aanvullende analgetica (carprofen, 4 mg / kg lichaamsgewicht, 24 uur depot) voor 2 dagen.
2. Transfectie van specifieke Cerebral Gebieden
Opmerking: De positie van de positieve pool wordt weergegeven als de hoek tussen de verticale middellijn door de ventrikel gevuld met de DNA-oplossing (rechts of derde ventrikel) en de positie van de positieve pool. Bij het vullen van de linker hartkamer posities zijn spiegelbeeld. In figuur 4 de posities van het oor primordiale getoond, die belangrijke referentiepunten verschaffen.
- Transfectie van corticale gebieden (figuur 2A, Tabel 1).
- Voeren chirurgie zoals beschreven in paragraaf 1.2. Voor de in utero elektroporatie van corticale gebieden gebruiken E14 embryo.
- Injecteer 1,5-2 pl DNA-oplossing bevattende 4 ug DNA in de rechter laterale ventrikelvia de bereide borosilicaat capillairen.
- De positie van de embryo zorgvuldig met behulp van een tang de ring, zodat er geen zichtbare schepen boven de prikplaats.
- Injecteer langzaam de DNA-oplossing ongeveer 0,75 mm van de coronale lambdoidal hechtdraad en 0,5 mm lateraal van de pijlnaad (figuur 3). Zorg ervoor dat de insteekdiepte is 1,2 mm (E14, gemeten vanaf de baarmoederwand). Controleer op een blauw-groene kleur met een scherpe afbakening.
- Solliciteer spanning via de gespecialiseerde tang-type platina-elektroden (interval cyclus lengte 50 msec, interval pauze 950 msec).
- Gebruik een 3 of 5 mm elektrode paddle.
- Gebruik een spanning tussen 36-38 V.
- Plaats het midden van de elektroden juist anterior van het oor primordia.
- Om de retrospleniale cortex gebruik hoeken transfecteren 330-0 °, om de motorische cortex 0-40 ° transfecteren, aan de somatosensorische cortex 40-95 ° transfecteren, te transfecterende piriformis cortex 95-110 ° (Figuur 2A).
- Verrichten na elektroporatie / post-operatieve zorg, zoals beschreven in paragraaf 1.4. Offer de muizen en analyseren van de embryo's 4 dagen na elektroporatie (E18), zoals beschreven in paragraaf 3.
- Transfectie van de hippocampus (Figuur 2B, Tabel 1).
- Voeren chirurgie zoals beschreven in paragraaf 1.2. Voor de in utero elektroporatie van hippocampale formatie gebruikt E15 embryo.
- Injecteer 2 pl DNA-oplossing bevattende 4 ug DNA in de rechter laterale ventrikel via de voorbereide borosilicaat capillairen.
- Solliciteer spanning via de gespecialiseerde tang-type platina-elektroden (interval cyclus lengte 50 msec, interval pauze 950 msec).
- Gebruik een 3 of 5 mm elektrode paddle.
- Gebruik een spanning tussen 38-40.
- Plaats het midden van de negatieve pool net anterior van het oor primordium en het centrum of de positieve pool in het midden van het oor primordium.
- Om transfecteren de dentate gyrus gebruiken hoeken 190-210 °, de cornu ammonis (CA) 3 210-230 ° transfecteren om transfecteren de CA2 230-250 °, het CA1 250-275 ° (figuur 2B) te transfecteren.
- Verrichten na elektroporatie / post-operatieve zorg, zoals beschreven in paragraaf 1.4. Voeren analyse na volledige hippocampus formatie (na de geboorte, p21), zoals beschreven in paragraaf 3.
- Transfectie van het laterale septum kern en striatum (Figuur 2C, tabel 1)
Opmerking: De hoeken overlappen met die van transfecteren van de hippocampus. Om effectief transfecteren de laterale septum kern en de striatum zonder ongewenste hippocampus transfectie eerder embryonale stadia (E12) te gebruiken.- Voeren chirurgie zoals beschreven in paragraaf 1.2. Voor de in utero elektroporatie van de laterale septum kern en striatum gebruikt E12 embryo.
- Injecteer 1 pl DNA-oplossing bevattende 4 ug DNA in de rechter laterale ventrikel via de voorbereide borosilicaat capillairen.
- Solliciteer spanning via de gespecialiseerde tang-type platina-elektroden (interval cyclus lengte 50 msec, interval pauze 950 msec).
- Gebruik een 0,5 mm elektrode.
- Gebruik 33 V.
- Plaats het midden van de elektroden ter hoogte van het oor primordia.
- Om de laterale septum nucleus gebruik hoeken transfecteren 100-170 °, het striatum 170-240 ° (figuur 2C) te transfecteren.
- Verrichten na elektroporatie / post-operatieve zorg, zoals beschreven in paragraaf 1.4. Offer de muizen en analyseren van de embryo's 6 dagen na elektroporatie (E18), zoals beschreven in paragraaf 3.
- Transfectie van de thalamus en hypothalamus (figuur 2D, tabel 1)
- Voeren chirurgie zoals beschreven in paragraaf 1.2. Voor de in UTero elektroporatie van de thalamus en de hypothalamus gebruik E12-E13 embryo's.
- Injecteer 1-1,5 pl DNA-oplossing bevattende 4 ug DNA in het laterale ventrikel (links of rechts) via de bereide borosilicaat capillairen. Wacht 2-3 min, totdat de oplossing wordt gediffundeerd in het derde ventrikel. U kunt ook rechtstreeks te injecteren in het derde ventrikel.
Opmerking: Dit verhoogt de specificiteit, maar zou een verminderde overleving (hoog risico op schade) veroorzaken. - Solliciteer spanning via de gespecialiseerde tang-type platina-elektroden (interval cyclus lengte 50 msec, interval pauze 950 msec).
- Gebruik een 0,5 of 3 mm elektrode.
- Gebruik een spanning tussen 33-35 V.
- Plaats het midden van de elektroden juist achter het oor primordia.
- Om de thalamus gebruik hoeken transfecteren 25-40 °, de hypothalamus 90-180 ° (figuur 2D) te transfecteren.
- Verrichten na elektroporatie / post-operatieve zorg als described in paragraaf 1.4. Offer de muizen en analyseren van de embryo's 6 dagen na elektroporatie (E18), zoals beschreven in paragraaf 3.
3. Perfusie Fixatie
- Voorbereidingen
- Warm 4% paraformaldehyde (PFA) tot 37 ° C.
- Vul een 50 ml spuit met PBS (4 ° C) en een tweede spuit met verwarmd PFA. Vermijd bubbels.
- Sluit de spuiten om een drie-weg kraan. Sluit de derde einde aan een gevleugelde infusieset (vlinder).
- Spoel de gevleugelde infusieset met PBS.
- Perfusie
- Diep verdoven de muizen (zwanger of postnatale getransfecteerd) met subcutane toepassing van ketamine hydrochloride (60 mg / kg) en xylazine (7,5 mg / kg).
- Bevestig de chirurgische tolerantie stadium door ongevoeligheid tot teen-snuifje.
- Open de buikholte net onder de ribbenkast.
- Knip voorzichtig het middenrif.
- Open de ribbenkast zorgvuldig via een snee in each website tot het sleutelbeen.
- Steek de punt van de vlinder in de linker hartkamer (vanaf de apex van het hart).
- Snijd de linker hartoor.
- Langzaam perfuseren de muis met PBS (ongeveer 10 ml).
- Zet de drie-weg kraan.
- Perfuseren de muis met 5-10 ml 4% PFA.
- Onthoofden de muis met een schaar en ontleden van de hersenen te beginnen bij het foramen magnum. Voer de dissectie reeds vroeger 16.
- Postfixate de hersenen voor 2 dagen in 4% PFA. Houd de hersenen bij 4 ° C in het donker.
4. Immunohistochemie
- Genereer 70 urn secties (bijvoorbeeld een vibratome).
- Optioneel: Verbeter fluorescentie met antilichaamkleuring.
- Blokkeer de secties 1 uur bij RT (0,1-0,2% Triton X-100, 5% normaal geit serum)
- Incubeer O / N met het geschikte antilichaam (anti-GFP, 1: 1000)
- Was 3-5 Malen met 0,1 M fosfaatbuffer.
- Incubeer 3-5 uur met de geschikte fluorescentie-geconjugeerd secundair antilichaam (Alexa Fluor 488-geconjugeerd anti-konijnen IgG, 1: 1000).
- Optioneel: tegenkleuring met 4-6-diaminodino-2-fenylindol (DAPI, 0,2 g / ml in 0,1 M fosfaatbuffer) gedurende 1 min.
- Analyseer fluorescentie met een passende fluorescentiemicroscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 2 toont voorbeelden van de specifieke in de baarmoeder elektroporatie van de regio te ontwikkelen in de retrospleniale cortex, de motorische cortex, de somatosensorische cortex, de piriformis cortex, de Cornu Ammonis 1-3, de dentate gyrus, het striatum, de laterale septum nucleus , de thalamus en hypothalamus. De resultaten van de transfecties wordt getoond naast de aanbevolen hoek (figuur 2). Voor een betere visualisatie van de hoeken in vivo de positie van de elektroden (0,5 mm) worden ook getoond op embryo (figuur 5, embryo in de baarmoeder, embryo in vliezen, ontleed embryo). Om een overzicht Tabel 1 samengevat de relevante feiten specifieke transfectie.
Verder werd aangetoond dat de grootte van de elektrode speelt een cruciale rol voor de specificiteit (figuur 6). Grotere omvang van de elektrode peddels leidt tot larger getransfecteerd gebieden, zoals illustratieve figuur 6. Verder elektroden die te groot dekking teveel van het embryo, waardoor het risico beïnvloeden het embryo hartritme (figuur 7) verbeteren. Bijvoorbeeld een 10 mm elektrode paddle bestrijkt de gehele E12 embryo (figuur 7).
Figuur 1. In utero elektroporatie. Basisstappen van de uitvoering van de in utero elektroporatie getoond. (A) toont de gehele opzet van de operatie, met de muis geplaatst op een kookplaat al verdoofd met isofluraan. (B) De desinfectie van de chirurgische gebied is een cruciale stap voor het openen van de buikholte (C) van de muis. (D) De DNA-bevattende oplossing wordt gekleurd met Fast Green, waarbij de visualisatie van succesvolle injectie mogelijk maakt (E, F). Succesvolle injectie in een laterale ventrikel resulteert in halvemaanvormige vlek. (G) na het injecteren van de juiste spanning wordt via pincet soort platina-elektroden. (H) Na de baarmoeder zorgvuldig te vervangen in de buikholte van de chirurgische wond is gehecht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Hoek-map elektroporatie van specifieke gebieden in het muizen cortex, hippocampus, septum laterale nucleus, striatum, thalamus en hypothalamus. De juiste positie van de positieve en negatieve pool, zijn in de schematische tekening. Voor (AC ng>) de posities aangegeven voor het injecteren van de DNA-oplossing in de rechter ventrikel. Voor injectie in de linker ventrikel, de hoeken zijn spiegelbeeld. De specifieke transfecties werden histologisch geverifieerd. (A) toont de posities van de positieve en negatieve pool voor transfecteren corticale gebieden (de retrospleniale cortex (RSC), de motorische cortex (MC), de somatosensorische cortex (SSC) en het piriformis cortex (PC). (B) Geeft de posities van de positieve en negatieve pool voor transfecteren de hippocampus formaties (de Cornu Ammonis 1-3 (CA1, CA2, CA3) en de dentate gyrus (DG). (C) Geeft de positie van de positieve en negatieve pool voor transfecteren het striatum (STR) en de laterale septum nucleus (LS). (D) Geeft de juiste posities van de elektroden voor het transfecteren van de thalamus (TH) en de hypothalamus (HY). Aangepast van Baumgart J. & Grebe N., 2015 12. ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/53303/53303fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. prikplaats. De optimale positie voor de injectie van het DNA oplossing ongeveer 0,75 mm coronale van de lambdoidal hechtdraad en 0,5 mm lateraal van de pijlnaad. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Plaats van het oor primordium. De positie van het oor primordium duidelijk omschreven (pijl).nk "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Visualisatie van de hoeken op een embryo. Voor een betere visualisatie van de juiste posities voor de positieve (aangegeven met een blauw plusteken) en de negatieve pool van specifieke transfecties van de corticale gebieden (retrospleniale cortex, motorische cortex, somatosensorische cortex, piriform cortex), de hippocampus gebieden (cornu Ammonis (CA) 1-3, dentate gyrus (DG)),de laterale septum kern, het striatum, de thalamus en de hypothalamus worden getoond op een embryo in de baarmoeder, een embryo in de vruchtzak en op een ontleed embryo (alle E15,5). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. De specificiteit van transfectie afhankelijk van de grootte elektrode. Toegenomen omvang van de elektrode peddel vermindert de specificiteit van de transfectie. Dit is vooral duidelijk bij jongere embryonale stadia (E12, boven), maar ook zichtbaar in de late embryonale stadium (E17, onderaan). Aangepast van Baumgart J. & Grebe N., 2015 12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7. Grootte van de elektrode peddel vergelijking met de grootte van een E12 embryo. Elektroden die te groot dekking teveel van het embryo en daardoor het risico van aantasting van het hartritme. Bijvoorbeeld, een 10 mm elektrode (rechts) bestrijkt de gehele E12 embryo en daarom niet aanbevolen, ook al specificiteit is niet het primaire doel. Aangepast van Baumgart J. & Grebe N., 2015 12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Gerichte regio | Hoek | Positie van de elektrode | Leeftijd van de embryo | DNA amount / concentratie | Spanning | Grootte van de elektrode | |
| Retrospleniale Cortex | 330 ° - 0 ° | Centrum van de elektroden net anterior van het oor primordia | E14 (E11-E17) | 1.5- 2 gl / 2.7- 2 ug / ul | 36- 38 | 3- 5 mm | |
| Motor Cortex | 0 ° - 40 ° | Centrum van de elektroden net anterior van het oor primordia | E14 (E11-E17) | 1.5- 2 gl / 2.7- 2 ug / ul | 36- 38 | 3- 5 mm | |
| Somatosensorische Cortex | 40 ° - 95 ° | Centrum van de elektroden net anterior van het oor primordia | E14 (E11-E17) | 1.5- 2 gl / 2.7- 2 ug / ul | 36- 38 | 3- 5 mm | |
| Piriform Cortex | 95 ° - 110 ° | Centrum van de elektroden net anterior van het oor primordia | E14 (E11-E17) | 1.5- 2 gl / 2.7- 2 ug / ul | 36-3 8 | 3- 5 mm | |
| Cornu Ammonis (CA) 1 | 250 ° - 275 ° | Midden van de positieve pool in het midden van het oor primordium | (E14-) E15 | 2 gl / 2 ug / ul | 38- 40 | 3- 5 mm | |
| CA2 | 230 ° - 250 ° | Midden van de positieve pool in het midden van het oor primordium | (E14-) E15 | 2 gl / 2 ug / ul | 38- 40 | 3- 5 mm | |
| CA3 | 210 ° - 230 ° | Midden van de positieve pool in het midden van het oor primordium | (E14-) E15 | 2 gl / 2 ug / ul | 38- 40 | 3- 5 mm | |
| Gyrus dentatus | 190 ° - 210 ° | Midden van de positieve pool in het midden van het oor primordium | (E14-) E15 | 2 gl / 2 ug / ul | 38- 40 | 3- 5 mm | |
| Striatum | 170 ° - 240 ° | Midden van de elektroden ter hoogte van het oor primordia | E12 | 1 gl / 4 ug / ul | 33 | 0,5 mm | |
| Laterale Septal Nucleus | 100 ° - 170 ° | Midden van de elektroden ter hoogte van het oor primordia | E12 | 1 gl / 4 ug / ul | 33 | 0,5 mm | |
| Thalamus | 25 ° - 40 ° | Centrum van de elektrodeplaatjes juist achter het oor primordia | E12- E13 | 1-1,5 gl / 4-2,7 ug / ul | 33- 35 | 0,5- 3 mm | |
| Hypothalamus | 90 ° - 180 ° | Centrum van de elektrodeplaatjes juist achter het oor primordia | E12- E13 | 1-1,5 gl / 4-2,7 ug / ul | 33- 35 | 0,5- 3 mm | |
Tabel 1:. Samenvatting van de resultaten in deze tabel is alle relevante informatie voor specifieke transfectie van de beschreven corticale gebieden. Het bevat informatie over het doelgebied, de hoek, de positie van de elektrode, de embryonale fase, de toegepaste hoeveelheid en concentratie van de DNA-oplossing, de spanning en de grootte van de elektrode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Fast Green | Roth | 0301.1 | |
| pCAGGS | Addgene | ||
| borosilicate glass capillaries (0.8-0.9 mm diameter) | Wold Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| Isoflurane (Forene) | Abbott | PZN 4831850 | |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer GmbH | approval number: 400684.00.00 | |
| eye ointment (Bepanthen Augen und Nasensalbe) | Bayer | PZN 01578681 | |
| 0.9% benzyl alcohol 0.9% saline solution | Pharmacy of the University Medical Center Mainz |
||
| gauze (ES-Kompressen) | Hartmann | 407835 | |
| sterile 5-0 Perma-Hand Silk Suture | Ethicon Johnson & Johnson | K890H | |
| ring forceps 1/ 1.5 mm | Fine Science Tools | 11101-09 | |
| ring forceps 4.8/ 6 mm | Fine Science Tools | 11106-09 | |
| ring forceps 2.2/ 3 mm | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Adson Forceps-Serrated Straight 12 cm | Fine Science Tools | 1106-12 | |
| IrisScissors-Delicate Straight-Sharp/Blunt 10 cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Mayo-Stille Scissors-Straight 15 cm | Fine Science Tools | 14012-15 | |
| Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Castroviejo NeedleHolder-with Lock-Tungsten Carbide 14 cm | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Elektroporator CUY21 SC | Nepa Gene Co. | ||
| FST 250 Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Microgrinder EG-44 | Narishige | ||
| P-97 Micropette Puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Platinum electrodes 650P 0.5 mm | Nepagene | CUY650P0.5 | |
| Platinum electrodes 650P 3 mm | Nepagene | CUY650P3 | |
| Platinum electrodes 650P 5 mm | Nepagene | CUY650P5 | |
| Platinum electrodes 650P 10 mm | Nepagene | CUY650P10 | |
| Anesthesia system | Rothacher-Medical GmbH | CV-30511-3 Vapor 19.3 | |
| Heating plate | Rothacher-Medical GmbH | HP-1M | |
| Temperature Controller 220V AC | Rothacher-Medical GmbH | TCAT-2LV |
References
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19 Suppl 1. (July), i120-i125 (1991).
- Nakahira, E., Yuasa, S. Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation. J Comp Neurol. 483 (3), 329-340 (2005).
- Navarro-Quiroga, I., Chittajallu, R., Gallo, V., Haydar, T. F. Long-term, selective gene expression in developing and adult hippocampal pyramidal neurons using focal in utero electroporation. J Neurosci. 27 (19), 5007-5011 (2007).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. J Neurosci Methods. 143 (2), 151-158 (2005).
- Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. M. Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders. FNMOL. 4 (November), 37 (2011).
- Tomita, K., Kubo, K. I., Ishii, K., Nakajima, K. Disrupted-in-schizophrenia-1 (Disc1) is necessary for migration of the pyramidal neurons during mouse hippocampal development. Hu Mol Gen. 20 (14), 2834-2845 (2011).
- Niwa, M., Kamiya, A., et al. Knockdown of DISC1 by In Utero Gene Transfer Disturbs Postnatal Dopaminergic Maturation in the Frontal Cortex and Leads to Adult Behavioral Deficits. Neuron. 65 (4), 480-489 (2010).
- Nakahira, E., Kagawa, T., Shimizu, T., Goulding, M. D., Ikenaka, K. Direct evidence that ventral forebrain cells migrate to the cortex and contribute to the generation of cortical myelinating oligodendrocytes. Dev Biol. 291 (1), 123-131 (2006).
- Baumgart, J., Grebe, N. C57BL/6-specific conditions for efficient in utero electroporation of the central nervous system. J Neurosci Methods. 240, 116-124 (2015).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. JoVE. (54), (2011).
- Guedel, A. E. Inhalation anesthesia: a fundamental guide. , Macmillan. New York. (1937).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. JoVE. (65), e3564 (2012).
- Mizutani, K., Saito, T. Progenitors resume generating neurons after temporary inhibition of neurogenesis by Notch activation in the mammalian cerebral cortex. Development. 132 (6), 1295-1304 (2005).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev, Growth & Differ. 50 (6), 507-511 (2008).
