Introduction
מאז התיאור הראשון בשנת 2001 על ידי שלוש קבוצות עצמאיות 1-3 אני n electroporation ברחם הפך לכלי סטנדרטי בשימוש נרחב לניתוח ביטוי גנים במערכת העצבים המרכזית של המכרסמים. בהשוואה לדור של עכברי נוקאאוט, שהוא, למרות טכניקות שיפור ברציפות, עדיין זמן וכסף רב, ברחם הערעורים electroporation בשל הפשטות שלה. אז, ברחם electroporation מאפשר gain- מהיר ויעיל ומחקרי הפסד של פונקציה 4.
לtransfect האזורים במוח, התמיסה המכילה את הפלסמיד הטעון השלילי מוזרקת לתוך חדר. במהלך הדופק החשמלי, ה- DNA הטעון השלילי נודד לכיוון הקוטב החיובי ולכן אזור transfected ניתן לבחור פשוט על ידי שינוי המיקום של הקוטב החיובי. זה לעתים קרובות הוכח כי אזורים רבים של מערכת העצבים המרכזית יכולים להיות ת"אrgeted 3,5-8. לדוגמא, המחקרים האחרונים מראים transfections הספציפי של ההיפוקמפוס, קליפת אגסי או סטריאטום 9-11. עם זאת, המידע על העמדות המתאימות הם לעתים קרובות טופל רק בקושי והם לא תמיד קלים להעביר לזנים שונים עכבר.
Transfection של שלבים עובריים מסוימים הוא רחוק מכך. גורמים המשפיעים על רבים חייבים להילקח בחשבון בעת בחירת ההגדרה לספציפי electroporation ברחם. ראשית, כדי transfect אופטימלי השלבים עובריים המתאימים, יש צורך בידע על המתח המתאים. מתח גבוה להקטין את שיעור ההישרדות, ואילו מתח נמוך להפחית את יעילות transfection 2,3,12. גם הגודל של ההנעה אלקטרודה ממלא תפקיד מכריע, משום שהשימוש במשוטי אלקטרודה שתוצאות גדולות מדי בסגוליות מופחתות או יכול לגרום למוות בשל חיבה של קצב הלב 4,12,13. מיושםמתח ואת הגודל והמיקום של ההנעה אלקטרודה הם התכונות החשובות ביותר שיש לשקול, אבל יש גם גורמים נוספים המשפיעים על התוצאה של electroporation, כמו הכמות השימושית של ה- DNA-פתרון.
פיתחנו פרוטוקול מפורט המאפשר transfection המהיר והיעיל של אזורי מוח השונים של עכבר C57BL / 6 12. בפרוטוקול זה מידע מפורט על המתח כדי לשמש ואת הגודל של ההנעה אלקטרודה לסגולית משופרים מסופק. יתר על כן, מידע על החדר להיות מלא יחד עם המלצות לסכום של פתרון פלסמיד ואת המיקום של האלקטרודה מסופקת. אינדיקציה למידע מיקום מפורט במפה והדמיה נוספת של עמדות אלה מאפשרת ספציפיים פשוטים ויעילים ברחם electroporation של קליפת retrosplenial, הקורטקס המוטורי, הקליפה החושית, קליפת אגסי לא,הוא קורנו ammonis 1-3, gyrus המשונן, סטריאטום, הגרעין במחיצה לרוחב, התלמוס וההיפותלמוס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הצהרת אתיקה: הטיפול בעכברים והפרוצדורות בוצעו בהתאם להנחיות אירופאיות, לאומיות ומוסדיות לטיפול בבעלי חיים.
1. ברחם Electroporation
הערה: ברחם electroporation בוצע כפי שפורסם בעבר 12,14. לכן, השיטה היא רק תיארה בקצרה בבאה (איור 1).
- הכנות
- הכן פתרון מהיר ירוק צבעוני ללא רעלן פנימי מתקדם פלסמיד הכיתה transfection (המכיל 1,5 pCAGGS) כפי שתואר קודם לכן 12.
- משוך ולטחון (35 זווית מעלות) נימי זכוכית בורוסיליקט (0.8-.9 קוטר) לזריקות.
- לעקר מכשירים.
- כִּירוּרגִיָה
- לנהל משככי כאבים (carprofen, 4 מ"ג / קילוגרם משקל גוף, SC, 24 דיפו שעות) לפחות 30 דקות לפני תחילת הניתוח.
- שמור את האורך שלההרדמה למקסימום של 35-45 דקות (שלב III - שלב של הרדמה כירורגית פי 15 guedel - דקות 25-30 מקסימליים).
- הרדימי עכברי מתוזמן בהריון עם isoflurane (אינדוקציה בתא: 2.8%, ניתוח באמצעות מסכה: 2.5%). לאשר הרדמה על ידי חוסר תגובה לבוהן קמצוץ.
- החל משחה העין כדי למנוע עין-יובש במהלך הרדמה.
- לחטא את אזור הניתוח עם 7.5% פתרון Providone-יוד ולכסות את העכבר עם גזה סטרילית (לחה עם פתרון 0.9% מלוחים נזיל אלכוהול) עם רק את אזור הניתוח החשוף.
- גזור לפתוח את חלל הבטן עם אזמל (חתך בעור: 1.5-2 סנטימטר, חתך שריר: 1-1.5 סנטימטר).
- לשמר את חלל הבטן נפתח מהתייבשות על ידי הרטבה עם 0.9% תמיסת מלח נזיל אלכוהול חיממה או תמיסה איזוטונית סטרילית אחרת כמו בבימויו של צוות או ועדה וטרינרים.
- לחלץ בזהירות קרנות רחם (באמצעות מלקחיים טבעת, לא לגעת ברחם עם אצבעים).
- הזרקה של ה- DNA וelectroporation. הערה: הפרטים המדויקים למיקוד אזורים ספציפיים מצוינים בסעיף 2.
- לאט לאט להזריק את פתרון ה- DNA בצבע לתוך החדר כפי שצוין באיור 1 וסעיף 2 דרך נימי ורוסיליקט מוכנות.
- החל המתח המתאים לשלב העוברי המתאים (למשל., 36-38 V עבור E14) באמצעות אלקטרודות מיוחדות מלקחיים מסוג פלטינה (אלפיות שני אורך 50 מחזור המרווח, msec הפסקה 950 מרווח). Pulse משוטי electroporation במהלך היישום של המתח כדי למזער את הנזק של קיר הרחם.
- / טיפול שלאחר ניתוח electroporation ההודעה
- להחליף את קרן הרחם בזהירות בחלל הבטן.
- לתפור את השרירים וחתך בעור בנפרד.
- תן את שאר עכבר על מכשיר תמיכה תרמי להתאוששות.
- לפקח על העכבר במהלך התאוששות (התנהגות, הזנה וצריכת מים), 4 שעות, 24 שעות ו -48 שעות לאחר ניתוח. במידת צורך, יחול משככי כאבים נוספים (carprofen, 4 מ"ג / קילוגרם משקל גוף, 24 דיפו שעות) עבור 2 ימים נוספים.
2. Transfection של תחומי מוחין ספציפיים
הערה: המיקום של הקוטב החיובי מוצג כזווית בין הציר האנכי דרך החדר מלא בפתרון ה- DNA (החדר ממני או השלישי) ואת המיקום של הקוטב החיובי. כאשר ממלאים את החדר השמאלי העמדות-הפוך מראה. באיור 4 העמדות של קדמוני האוזן מוצגות, המספקות נקודות התייחסות חשובות.
- Transfection של אזורים בקליפת המוח (איור 2 א, לוח 1).
- לבצע ניתוח כפי שתואר בסעיף 1.2. לelectroporation ברחם של אזורים בקליפת המוח להשתמש בעוברי E14.
- הזרק 1.5-2 μl DNA-פתרון המכיל DNA 4 מיקרוגרם בחדר לרוחב תקיןבאמצעות נימי ורוסיליקט מוכנות.
- מקם בזהירות את העובר באמצעות מלקחיים טבעת כך שאין כלי נראים מעל האתר לנקב.
- לאט לאט להזריק את ה- DNA-הפתרון כ 0.75 מ"מ העטרה מתפר lambdoidal ו 0.5 מ"מ לרוחב מתפר sagittal (איור 3). ודא שעומק ההחדרה הוא 1.2 מ"מ (E14, נמדד מדופן הרחם). בדקו צביעה כחולה-ירוקה עם תיחום חד.
- החל מתח באמצעות אלקטרודות פלטינה מלקחיים מהסוג המיוחדות (אלפית שני אורך 50 מחזור המרווח, msec הפסקה 950 מרווח).
- השתמש בהנעת אלקטרודה 3 או 5 מ"מ.
- השתמש במתח הנע 36-38 V.
- מניחים במרכז אלקטרודות רק הקדמי של primordia האוזן.
- לtransfect זוויות שימוש קליפת retrosplenial 330-0 מעלות, לtransfect הקורטקס המוטורי 0-40 °, לtransfect הקליפה החושית 40-95 °, לtransfectקליפת אגסי 95-110 מעלות (איור 2 א).
- בצע / טיפול שלאחר ניתוח electroporation הודעה כאמור בסעיף 1.4. להקריב את העכברים ולנתח את העוברים 4 ימים לאחר electroporation (E18) כמפורט בסעיף 3.
- Transfection של ההיפוקמפוס (איור 2, לוח 1).
- לבצע ניתוח כפי שתואר בסעיף 1.2. לelectroporation ברחם של היווצרות בהיפוקמפוס להשתמש עוברי E15.
- להזריק 2 μl DNA-תמיסה המכילה 4 מיקרוגרם DNA בחדר לרוחב תקין באמצעות נימי ורוסיליקט מוכנות.
- החל מתח באמצעות אלקטרודות פלטינה מלקחיים מהסוג המיוחדות (אלפית שני אורך 50 מחזור המרווח, msec הפסקה 950 מרווח).
- השתמש בהנעת אלקטרודה 3 או 5 מ"מ.
- השתמש במתח הנע 38-40.
- מניחים במרכז הקוטב השלילי רק הקדמית של primordium האוזן והמרכז oו הקוטב החיובי באמצע primordium האוזן.
- לtransfect gyrus המשונן להשתמש זוויות 190-210 מעלות, לtransfect ammonis קורנו (CA) 3 210-230 מעלות, לtransfect Ca 2 230-250 מעלות, לtransfect ° CA1 250-275 (איור 2).
- בצע / טיפול שלאחר ניתוח electroporation הודעה כאמור בסעיף 1.4. לבצע ניתוח לאחר היווצרות בהיפוקמפוס מלאה (לאחר הלידה, p21) כמפורט בסעיף 3.
- Transfection של גרעין במחיצה לרוחב וסטריאטום (איור 2 ג, טבלת 1)
הערה: הזוויות חופפות עם אלה לtransfecting היפוקמפוס. לtransfect גרעין רוחב המחיצה וסטריאטום ללא שלבים עובריים מוקדם transfection ההיפוקמפוס לא רצוי (E12) ביעילות צריך להיות בשימוש.- לבצע ניתוח כפי שתואר בסעיף 1.2. לelectroporation ברחם של הגרעין במחיצה לרוחב וstriatאממ להשתמש עוברי E12.
- הזרק 1 μl DNA-תמיסה המכילה 4 מיקרוגרם DNA בחדר לרוחב תקין באמצעות נימי ורוסיליקט מוכנות.
- החל מתח באמצעות אלקטרודות פלטינה מלקחיים מהסוג המיוחדות (אלפית שני אורך 50 מחזור המרווח, msec הפסקה 950 מרווח).
- השתמש באלקטרודה 0.5 מ"מ.
- השתמש 33 V.
- מניחים במרכז את האלקטרודות ברמה של primordia האוזן.
- לtransfect זוויות שימוש גרעין במחיצה לרוחב 100-170 מעלות, לtransfect ° סטריאטום 170-240 (איור 2 ג).
- בצע / טיפול שלאחר ניתוח electroporation הודעה כאמור בסעיף 1.4. להקריב את העכברים ולנתח את העוברים 6 ימים לאחר electroporation (E18) כמפורט בסעיף 3.
- Transfection של התלמוס וההיפותלמוס (איור 2 ד, טבלת 1)
- לבצע ניתוח כפי שתואר בסעיף 1.2. בuelectroporation טרו של עוברי E12-E13 שימוש התלמוס וההיפותלמוס.
- הזרק 1-1.5 DNA-פתרון μl המכיל 4 מיקרוגרם DNA בחדר לרוחב (משמאל או מימין) דרך נימי ורוסיליקט מוכנות. חכה במשך 2-3 דקות, עד שהפתרון הוא מתפזר לחדר השלישי. לחלופין ישירות להזריק לתוך החדר השלישי.
הערה: זה משפר ספציפי אבל עלול לגרום לירידה בשיעור הישרדות (סיכון גבוה לניזק). - החל מתח באמצעות אלקטרודות פלטינה מלקחיים מהסוג המיוחדות (אלפית שני אורך 50 מחזור המרווח, msec הפסקה 950 מרווח).
- השתמש באלקטרודה 0.5 או 3 מ"מ.
- השתמש במתח הנע 33-35 V.
- מניחים במרכז אלקטרודות רק אחורי primordia האוזן.
- לtransfect זוויות שימוש התלמוס 25-40 מעלות, לtransfect ° ההיפותלמוס 90-180 (איור 2 ד).
- בצע / טיפול שלאחר ניתוח electroporation הודעה כdescribed בסעיף 1.4. להקריב את העכברים ולנתח את העוברים 6 ימים לאחר electroporation (E18) כמפורט בסעיף 3.
3. זלוף קיבוע
- הכנות
- paraformaldehyde החם 4% (PFA) עד 37 מעלות צלזיוס.
- ממלאי מזרק 50 מיליליטר עם PBS (4 ° C) ומזרק שני עם PFA חימם. למנוע בועות.
- חבר את המזרקים לברזלי שלוש-דרך. חבר את הקצה השלישי לסט עירוי מכונף (פרפר).
- לשטוף את סט העירוי המכונף עם PBS.
- זִלוּף
- עמוק להרדים את העכברים (בהריון או לאחר לידה transfected) עם יישום תת עורית של קטמין הידרוכלוריד (60 מ"ג / קילוגרם) ו xylazine (7.5 מ"ג / קילוגרם).
- לאשר את שלב הסובלנות כירורגית על ידי חוסר תגובה לבוהן קמצוץ.
- פתח את חלל הבטן מתחת רק כלוב הצלעות.
- בזהירות לחתוך את הסרעפת.
- לפתוח בזהירות את כלוב הצלעות באמצעות חתך בדואראתר אח עד עצם הבריח.
- הכנס את הקצה של הפרפר לתוך החדר השמאלי בלב (החל מהשיא של הלב).
- חותך את תוספת פרוזדורי שמאל.
- לאט perfuse העכבר עם PBS (כ -10 מיליליטר).
- לעבור הסתום המשולש.
- Perfuse העכבר עם 5-10 מיליליטר PFA 4%.
- לערוף את העכבר באמצעות מספריים ולנתח את המוח מתחיל בנקב הגדול. לבצע הנתיחה כפי שפורסם בעבר 16.
- Postfixate המוח במשך 2 ימים בPFA 4%. שמור את המוח על 4 מעלות צלזיוס בחושך.
4. אימונוהיסטוכימיה
- צור 70 מיקרומטר חלקים (לדוגמא, עם vibratome).
- אופציונאלי: שפר את הקרינה עם מכתים נוגדן.
- לחסום את החלקים עבור שעה 1 ב RT (0.1-0.2% Triton X-100, 5% בסרום עז נורמלי)
- דגירה O / N עם הנוגדן המתאים (אנטי-GFP, 1: 1,000)
- לשטוף 3-5 פעמים עם חיץ 0.1 M פוספט.
- דגירה שעה 3-5 עם נוגדן פלואורסצנטי מצומדות- המתאים המשני (אלקסה פלואוריד 488 נגד הארנב-IgG מצומדות, 1: 1,000).
- אופציונאלי: Counterstain עם 4-6-diaminodino-2-phenylindole (DAPI, 0.2 גר '/ מיליליטר במאגר M 0.1 פוספט) 1 דקות.
- ניתוח הקרינה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 2, מציג דוגמאות לספציפיות electroporation ברחם של אזורי פיתוח לקליפת retrosplenial, הקורטקס המוטורי, הקליפה החושית, קליפת אגסי, קורנו ammonis 1-3, gyrus המשונן, סטריאטום, הגרעין במחיצה לרוחב , התלמוס וההיפותלמוס. תוצאות transfections מוצגות ליד הזווית המומלצת (איור 2). להדמיה טובה יותר של הזוויות in vivo העמדה של האלקטרודה (0.5 מ"מ) מוצגת גם על עובר (איור 5, עובר ברחם, עובר בצק מי שפיר, עובר גזור). על מנת לספק טבלת סקירת 1 סיכמה את העובדות הרלוונטיות לtransfection הספציפי.
יתר על כן, זה היה הראה כי הגודל של האלקטרודה ממלא תפקיד מכריע עבור הסגוליות (איור 6). גודל גדול יותר של משוטי אלקטרודה מוביל ללהrger transfected אזורים, כמופת שמוצגת באיור 6. בהמשך, אלקטרודות שכיסוי גדול מדי יותר מדי של העובר, ובכך משפר את הסיכון הלמשפיע על קצב הלב של עובר (איור 7). לדוגמא ההנעה אלקטרודה 10 מ"מ מכסה את כל עובר E12 (איור 7).
איור 1. ברחם electroporation. צעדים בסיסיים של הביצועים של electroporation ברחם מוצגים. () מציג את כל ההתקנה של הניתוח, עם העכבר מונח על פלטה חשמלית כבר הרדים עם isoflurane. (ב) החיטוי של אזור הניתוח הוא צעד חיוני לפני פתיחת חלל הבטן (C) של העכבר. הפתרון המכיל DNA (ד) הוא בצבע עם G המהירבירוק, המאפשר ההדמיה של זריקה מוצלחת (E, F). זריקה מוצלחת לחדר לרוחב תוצאות למקום בצורת חצי סהר. (ז) לאחר הזרקת המתח המתאים מיושם באמצעות אלקטרודות פלטינה סוג מלקחיים. (H) לאחר החלפת זהירות הרחם לתוך חלל בטן פצע הניתוח הוא איחוי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. זווית-המפה לelectroporation של אזורים ספציפיים בקליפת המוח בעכברים, ההיפוקמפוס, גרעין במחיצה לרוחב, סטריאטום, התלמוס וההיפותלמוס. העמדות המתאימות לקוטב החיובי ושלילי, מסומנות בשרטוט. ל( AC ng>) העמדות מצוינות להזרקת DNA-הפתרון לחדר ממני. לזריקות לתוך החדר השמאלי, הזוויות-הפוך מראה. Transfections הספציפי אומתו בהיסטולוגיה. (א) מציג את העמדות של הקוטב החיובי ושלילי לtransfecting אזורים בקליפת המוח (הקורטקס retrosplenial (RSC), הקורטקס המוטורי (MC), הקליפה החושית (SSC) וקליפת אגסי (PC). (ב) מציג את עמדות של הקוטב החיובי ושלילי לtransfecting התצורות בהיפוקמפוס (קורנו ammonis 1-3 (CA1, Ca 2, CA3) והרכס המשונן (DG). (ג) מציג את העמדות של הקוטב החיובי ושלילי לtransfecting סטריאטום (STR) והגרעין במחיצה לרוחב (LS). (ד) מציג את העמדות המתאימות של אלקטרודות לtransfecting התלמוס (TH) וההיפותלמוס (HY). מעובד מתוך אומגרט ג 'ונ' גריב, 2015 12. נ.ב.: //www.jove.com/files/ftp_upload/53303/53303fig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
אתר נקר איור 3.. המיקום האופטימלי להזרקה של פתרון ה- DNA הוא כ 0.75 מ"מ העטרה מתפר lambdoidal ו 0.5 מ"מ לרוחב מתפר sagittal. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
מיקום איור 4. של primordium האוזן. העמדה של primordium האוזן מוגדר בבירור (חץ).nk "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ויזואליזציה איור 5. של הזוויות בעובר. להדמיה טובה יותר את העמדות המתאימות לקוטב החיובי (מסומן בסימן חיובי כחול) והשלילי עבור transfections הספציפי של האזורים בקליפת המוח (הקורטקס retrosplenial, הקורטקס מוטורי, החושית קליפה, אגסי קליפה), האזורים בהיפוקמפוס (קורנו ammonis (CA) 1-3, gyrus המשונן (DG)),גרעין רוחב המחיצה, סטריאטום, התלמוס וההיפותלמוס מוצג על עובר ברחם, עובר בשק השפיר ועל עובר גזור (כל E15,5). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ספציפי איור 6. של transfection תלוי בגודל האלקטרודה. גודל מוגבר של ההנעה האלקטרודה מפחית את הספציפיות של transfection. הדבר בולט במיוחד בשלבים צעירים עובריים (E12, למעלה), אלא גם נראה בשלבים מאוחר עובריים (E17, למטה). מעובד מתוך אומגרט ג 'וגריב נ' 2015 12. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
גודל איור 7. של ההנעה אלקטרודה בהשוואה לגודל של עובר E12. אלקטרודות שכיסוי גדול מדי יותר מדי של העובר ולכן מעלים את הסיכון לחיבה של קצב הלב. לדוגמא, אלקטרודה 10 מ"מ (מימין) מכסה את כל עובר E12 ולכן אינו מומלצת, גם אם סגוליות היא לא המטרה העיקרית. מעובד מתוך אומגרט ג 'וגריב נ' 2015 12. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| אזור מיקוד | זָוִית | מיקום של האלקטרודה | גיל של עובר | amou DNAריכוז NT / | מתח | גודל של האלקטרודה | |
| Cortex Retrosplenial | 330 ° - 0 מעלות | מרכז אלקטרודות רק קדמי של primordia האוזן | E14 (E11-E17) | 1.5- 2 μl / 2.7- 2 מיקרוגרם / μl | 36- 38 | 3 5 מ"מ | |
| מנוע Cortex | 0 ° - 40 ° | מרכז אלקטרודות רק קדמי של primordia האוזן | E14 (E11-E17) | 1.5- 2 μl / 2.7- 2 מיקרוגרם / μl | 36- 38 | 3 5 מ"מ | |
| קליפה החושית | 40 ° - 95 ° | מרכז אלקטרודות רק קדמי של primordia האוזן | E14 (E11-E17) | 1.5- 2 μl / 2.7- 2 מיקרוגרם / μl | 36- 38 | 3 5 מ"מ | |
| PiriforCortex מ ' | 95 ° - 110 מעלות | מרכז אלקטרודות רק קדמי של primordia האוזן | E14 (E11-E17) | 1.5- 2 μl / 2.7- 2 מיקרוגרם / μl | 36-3 8 | 3 5 מ"מ | |
| קורנו Ammonis (CA) 1 | 250 מעלות - 275 מעלות | מרכז של הקוטב החיובי באמצע primordium האוזן | (E14-) E15 | 2 μl / 2 מיקרוגרם / μl | 38- 40 | 3 5 מ"מ | |
| Ca 2 | 230 ° - 250 ° | מרכז של הקוטב החיובי באמצע primordium האוזן | (E14-) E15 | 2 μl / 2 מיקרוגרם / μl | 38- 40 | 3 5 מ"מ | |
| CA3 | 210 ° - 230 ° | מרכז של הקוטב החיובי באמצע primordium האוזן | (E14-) E15 | 2 μl / 2 מיקרוגרם / μl | 38- 40 | 3 5 מ"מ | |
| המשונן gyrus | 190 ° - 210 ° | מרכז של הקוטב החיובי באמצע primordium האוזן | (E14-) E15 | 2 μl / 2 מיקרוגרם / μl | 38- 40 | 3 5 מ"מ | |
| סטריאטום | 170 ° - 240 ° | מרכז של האלקטרודות ברמה של primordia האוזן | E12 | μl 1 / 4 מיקרוגרם / μl | 33 | 0.5 מ"מ | |
| רוחב מחיצת גרעין | 100 ° - 170 ° | מרכז של האלקטרודות ברמה של primordia האוזן | E12 | μl 1 / 4 מיקרוגרם / μl | 33 | 0.5 מ"מ | |
| התלמוס | 25 ° - 40 ° | מרכז electodes רק אחורי פרי האוזןmordia | E12- E13 | 1-1.5 μl / 4-2.7 מיקרוגרם / μl | 33- 35 | 0.5- 3 מ"מ | |
| ההיפותלמוס | 90 ° - 180 ° | מרכז electodes רק אחורי primordia האוזן | E12- E13 | 1-1.5 μl / 4-2.7 מיקרוגרם / μl | 33- 35 | 0.5- 3 מ"מ | |
הטבלה 1:. סיכום של תוצאות כלולות בטבלה זו היא כל המידע הרלוונטי לtransfection הספציפי של האזורים בקליפת המוח שתוארו. הוא מכיל פרטים על האזור הממוקד, הזווית, העמדה של האלקטרודה, השלב העוברי, כמות והריכוז מיושמת של פתרון ה- DNA, המתח ואת הגודל של האלקטרודה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Fast Green | Roth | 0301.1 | |
| pCAGGS | Addgene | ||
| borosilicate glass capillaries (0.8-0.9 mm diameter) | Wold Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| Isoflurane (Forene) | Abbott | PZN 4831850 | |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer GmbH | approval number: 400684.00.00 | |
| eye ointment (Bepanthen Augen und Nasensalbe) | Bayer | PZN 01578681 | |
| 0.9% benzyl alcohol 0.9% saline solution | Pharmacy of the University Medical Center Mainz |
||
| gauze (ES-Kompressen) | Hartmann | 407835 | |
| sterile 5-0 Perma-Hand Silk Suture | Ethicon Johnson & Johnson | K890H | |
| ring forceps 1/ 1.5 mm | Fine Science Tools | 11101-09 | |
| ring forceps 4.8/ 6 mm | Fine Science Tools | 11106-09 | |
| ring forceps 2.2/ 3 mm | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Adson Forceps-Serrated Straight 12 cm | Fine Science Tools | 1106-12 | |
| IrisScissors-Delicate Straight-Sharp/Blunt 10 cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Mayo-Stille Scissors-Straight 15 cm | Fine Science Tools | 14012-15 | |
| Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Castroviejo NeedleHolder-with Lock-Tungsten Carbide 14 cm | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Elektroporator CUY21 SC | Nepa Gene Co. | ||
| FST 250 Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Microgrinder EG-44 | Narishige | ||
| P-97 Micropette Puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Platinum electrodes 650P 0.5 mm | Nepagene | CUY650P0.5 | |
| Platinum electrodes 650P 3 mm | Nepagene | CUY650P3 | |
| Platinum electrodes 650P 5 mm | Nepagene | CUY650P5 | |
| Platinum electrodes 650P 10 mm | Nepagene | CUY650P10 | |
| Anesthesia system | Rothacher-Medical GmbH | CV-30511-3 Vapor 19.3 | |
| Heating plate | Rothacher-Medical GmbH | HP-1M | |
| Temperature Controller 220V AC | Rothacher-Medical GmbH | TCAT-2LV |
References
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19 Suppl 1. (July), i120-i125 (1991).
- Nakahira, E., Yuasa, S. Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation. J Comp Neurol. 483 (3), 329-340 (2005).
- Navarro-Quiroga, I., Chittajallu, R., Gallo, V., Haydar, T. F. Long-term, selective gene expression in developing and adult hippocampal pyramidal neurons using focal in utero electroporation. J Neurosci. 27 (19), 5007-5011 (2007).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. J Neurosci Methods. 143 (2), 151-158 (2005).
- Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. M. Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders. FNMOL. 4 (November), 37 (2011).
- Tomita, K., Kubo, K. I., Ishii, K., Nakajima, K. Disrupted-in-schizophrenia-1 (Disc1) is necessary for migration of the pyramidal neurons during mouse hippocampal development. Hu Mol Gen. 20 (14), 2834-2845 (2011).
- Niwa, M., Kamiya, A., et al. Knockdown of DISC1 by In Utero Gene Transfer Disturbs Postnatal Dopaminergic Maturation in the Frontal Cortex and Leads to Adult Behavioral Deficits. Neuron. 65 (4), 480-489 (2010).
- Nakahira, E., Kagawa, T., Shimizu, T., Goulding, M. D., Ikenaka, K. Direct evidence that ventral forebrain cells migrate to the cortex and contribute to the generation of cortical myelinating oligodendrocytes. Dev Biol. 291 (1), 123-131 (2006).
- Baumgart, J., Grebe, N. C57BL/6-specific conditions for efficient in utero electroporation of the central nervous system. J Neurosci Methods. 240, 116-124 (2015).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. JoVE. (54), (2011).
- Guedel, A. E. Inhalation anesthesia: a fundamental guide. , Macmillan. New York. (1937).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. JoVE. (65), e3564 (2012).
- Mizutani, K., Saito, T. Progenitors resume generating neurons after temporary inhibition of neurogenesis by Notch activation in the mammalian cerebral cortex. Development. 132 (6), 1295-1304 (2005).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev, Growth & Differ. 50 (6), 507-511 (2008).
