Introduction
Siden den første beskrivelsen i 2001 av tre uavhengige grupper 1-3 i n utero elektroporering er blitt en utbredt standard verktøy for å analysere genekspresjon i gnagere sentralnervesystemet. Sammenlignet med den generasjonen av knockout-mus, som er, til tross for kontinuerlig forbedring teknikker, fortsatt tid og penger tidkrevende, de i utero electroporation appeller på grunn av sin enkelhet. Så, i utero elektroporering muliggjør rask og effektiv gevinst-og tap-av-funksjon studier 4.
For å transfektere de cerebrale områder, blir oppløsningen inneholdende det negativt ladede plasmidet injiseres i et hjertekammer. I løpet av den elektriske puls, migrerer negativt ladet DNA mot den positive pol, og derfor den transfekterte region kan velges ganske enkelt ved å endre posisjonen til den positive pol. Det har ofte vist seg at tallrike områder av sentralnervesystemet kan være TArgeted 3,5-8. For eksempel, nyere studier viser spesifikke transfeksjoner av hippocampus, piriform cortex eller striatum 9-11. Men informasjonen om de aktuelle stillingene er ofte bare knapt standardisert og er ikke alltid lett å overføre til forskjellige musestammer.
Transfeksjon av visse embryonale stadier er langt fra trivielt. Mange påvirkende faktorer må tas i betraktning når du velger oppsett for spesifikk i utero elektroporering. Først, for å optimalt transfektere de respektive embryonale stadier, er kunnskap om de aktuelle spenninger nødvendig. Høye spenninger redusere overlevelse, mens lave spenninger redusere transfeksjonseffektiviteten 2,3,12. Også størrelsen av elektroden padle spiller en avgjørende rolle, fordi bruken av elektrode årer som er for store resulterer i redusert spesifisitet, eller kan føre til død på grunn av affeksjon av hjerterytmen 4,12,13. Den påførtespenning og størrelsen og posisjonen av elektroden åren er de viktigste funksjoner for å ta hensyn til, men det finnes også ytterligere faktorer som påvirker utfallet av elektroporering som den anvendte mengde av DNA-løsning.
Vi har utviklet en detaljert protokoll som muliggjør rask og effektiv transfeksjon av forskjellige cerebrale regioner av C57BL / 6 mus 12. I denne protokollen detaljert informasjon om de spenninger som skal benyttes og størrelsen av elektrode åren for forbedret spesifisitet er gitt. Videre informasjon om ventrikkel for å bli fylt med anbefalinger for mengden av plasmid-løsning og stilling av elektroden blir tilført. Indikasjon på detaljert posisjonsinformasjon i et kart og den videre visualisering av disse stillingene kan du direkte konkret og effektiv i utero electroporation av retrosplenial cortex, motor cortex, somatosensoriske cortex, den piriform cortex, tHan CORNU ammonis 1-3, gyrus dentatus, striatum, den laterale septal nucleus, thalamus og hypothalamus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk Statement: The håndtering av mus og de eksperimentelle prosedyrer ble utført i samsvar med europeiske, nasjonale og institusjonelle retningslinjer for dyr omsorg.
1. I Utero Electroporation
Merk: I utero elektroporering ble utført som tidligere utgitt 12,14. Derfor er fremgangsmåten kun kort beskrevet i det følgende (figur 1).
- Forberedelser
- Forbered Fast Grønn farget endotoksin-free avansert transfeksjon-grade plasmid-løsning (som inneholder 1,5 pCAGGS) som tidligere beskrevet 12.
- Trekk og male (35 ° vinkel) borsilikatglass kapillærer (0,8-0,9 diameter) for injeksjoner.
- Sterilisere instrumenter.
- Kirurgi
- Administrere analgetika (carprofen, 4 mg / kg kroppsvekt, sc, 24 hr depot) i minst 30 minutter før operasjonen.
- Holde lengden avanestesien til et maksimum på 35-45 min (Trinn III - fasen av kirurgisk anestesi i henhold til Guedel 15 - maksimal 25-30 min).
- Bedøve timet gravide mus med isofluran (induksjon i et kammer: 2,8%, kirurgi via maske: 2,5%). Bekreft anestesi ved manglende respons på tå-klemme.
- Påfør øye salve for å hindre øye-tørrhet under anestesi.
- Sterilisere kirurgiske området med 7,5% Providone-Jod-løsning og dekke mus med steril kompress (fuktig med 0,9% benzylalkohol saltvann) med bare den kirurgiske området utsatt.
- Skjær åpne bukhulen med en skalpell (snitt i huden: 1,5-2 cm, muskel snitt: 1-1,5 cm).
- Bevar åpnet bukhulen tørker ut ved å fukte med varmet 0,9% benzylalkohol saltvannsoppløsning eller annen steril isotonisk løsning som anvist av veterinær ansatte eller komiteen.
- Nøye trekke ut livmor horn (med ring tang, ikke rør livmoren med fingerens).
- Injeksjon av DNA og elektroporering. Merk: De nøyaktige detaljene for målretting spesifikke regioner er angitt i § 2.
- Injiser langsomt farget DNA-løsningen inn i ventrikkelen som vist i figur 1 og del 2 via de preparerte borsilikat kapillærer.
- Påfør riktig spenning for den tilsvarende fosterstadiet (, 36-38 V for E14 f.eks.) Via spesialiserte tang-type platina elektroder (intervall sykluslengden 50 msek, intervall pause 950 ms). Puls electroporation årer under påføringen av spenningen for å minimere skade på livmorveggen.
- Post elektroporering / postoperativ omsorg
- Erstatte livmor horn nøye i bukhulen.
- Sutur muskel og hud innsnitt separat.
- La musen hvile på en støtteanordning for termisk gjenvinning.
- Overvåke mus under utvinning (atferd, fôr ogvannforbruk), 4 timer, 24 timer og 48 timer etter operasjonen. Om nødvendig, bruk ekstra analgetika (carprofen, 4 mg / kg kroppsvekt, 24 timers depot) for ytterligere 2 dager.
2. Transfeksjon av spesifikke Cerebral Areas
Merk: Posisjonen til den positive polen er vist som vinkelen mellom den vertikale senterlinje gjennom ventrikkelen fylt med DNA-løsning (høyre eller tredje ventrikkel) og posisjonen til den positive pol. Når du fyller venstre hjertekammer stillingene er speilvendt. På figur 4 er posisjonene til øret opprinnelige er vist, som tilveiebringer viktige referansepunkter.
- Transfeksjon av kortikale områder (figur 2A, tabell 1).
- Utføre kirurgi som beskrevet i kapittel 1.2. For i utero electroporation av kortikale områder bruker E14 embryoer.
- Injiser 1,5 til 2 pl DNA-oppløsning inneholdende 4 mikrogram DNA i den høyre lateral ventrikkelvia de preparerte borosilicate kapillærer.
- Plassere embryo nøye ved hjelp av ring tang slik at det er ingen synlige fartøy over stikkstedet.
- Sakte injisere DNA-løsningen omtrent 0,75 mm koronale fra lambdoidal sutur og 0,5 mm lateral fra sagittal sutur (figur 3). Sørg for at innsettingsdybden er 1,2 mm (E14, målt fra livmorveggen). Se etter en blå-grønn farge med en skarp avgrensning.
- Påfør spenning via spesialiserte tang-type platina elektroder (intervall sykluslengden 50 msek, intervall pause 950 msek).
- Bruk en 3 eller 5 mm elektrode padle.
- Bruk en spennings spenner 36-38 V.
- Plasser sentrum av elektrodene bare anterior av øret primordia.
- Å transfektere de retrosplenial cortex bruke vinkler 330-0 °, til transfektere motor cortex 0-40 °, til transfektere somatosensoriske cortex 40-95 °, til transfekterepiriform cortex 95-110 ° (Figur 2A).
- Utfør post elektroporering / postoperativ behandling som beskrevet i kapittel 1.4. Ofre mus og analysere embryoene 4 dager etter elektroporering (E18) som beskrevet i kapittel 3.
- Transfeksjon av hippocampus (figur 2B, tabell 1).
- Utføre kirurgi som beskrevet i kapittel 1.2. For i utero electroporation av hippokampalformasjonen bruke E15 embryoer.
- Injiser 2 pl DNA-oppløsning inneholdende 4 mikrogram DNA i den høyre lateral ventrikkel via de preparerte borsilikat kapillærer.
- Påfør spenning via spesialiserte tang-type platina elektroder (intervall sykluslengden 50 msek, intervall pause 950 msek).
- Bruk en 3 eller 5 mm elektrode padle.
- Bruk en spennings varierer 38-40.
- Plassere sentrum av den negative pol bare anterior av øret primordium og sentrum of den positive pol på midten av øret primordium.
- Å transfektere gyrus dentatus bruke vinkler fra 190-210 °, for å transfektere den ove ammonis (CA) 3 210-230 °, for å transfektere den CA2 230-250 °, for å transfektere CA1 250-275 ° (figur 2B).
- Utfør post elektroporering / postoperativ behandling som beskrevet i kapittel 1.4. Utføre analyser etter fullstendig hippokampalformasjonen (etter fødselen, p21) som beskrevet i kapittel 3.
- Transfeksjon av side septal nucleus og striatum (figur 2C, tabell 1)
Merk: Vinklene overlapper med de for trans hippocampus. For effektivt å transfektere den laterale septal nucleus og striatum uten uønskede hippocampus transfeksjon tidligere embryonale trinn (E12) må benyttes.- Utføre kirurgi som beskrevet i kapittel 1.2. For i utero electroporation av den laterale septal nucleus og striatum bruke E12 embryoer.
- Injiser 1 pl DNA-oppløsning inneholdende 4 mikrogram DNA i den høyre lateral ventrikkel via de preparerte borsilikat kapillærer.
- Påfør spenning via spesialiserte tang-type platina elektroder (intervall sykluslengden 50 msek, intervall pause 950 msek).
- Bruk en 0,5 mm elektrode.
- Bruk 33 V.
- Plasser midten av elektrodene på nivået av øret primordia.
- Å transfektere laterale septal nucleus bruke vinkler 100-170 °, til transfektere striatum 170-240 ° (figur 2C).
- Utfør post elektroporering / postoperativ behandling som beskrevet i kapittel 1.4. Ofre mus og analysere embryoene 6 dager etter elektroporering (E18) som beskrevet i kapittel 3.
- Transfeksjon av thalamus og hypothalamus (figur 2D, tabell 1)
- Utføre kirurgi som beskrevet i kapittel 1.2. For i uTero elektroporering av thalamus og hypothalamus bruke E12-E13 embryoer.
- Injiser 1-1,5 pl DNA-oppløsning inneholdende 4 mikrogram DNA i den laterale ventrikkel (venstre eller høyre) via de preparerte borsilikat kapillærer. Vent i 2-3 min, inntil oppløsningen diffunderer inn i den tredje ventrikkel. Alternativt kan direkte injisere inn i den tredje ventrikkel.
Merk: Dette forbedrer spesifisitet, men kan føre til en redusert overlevelse (høy risiko for skade). - Påfør spenning via spesialiserte tang-type platina elektroder (intervall sykluslengden 50 msek, intervall pause 950 msek).
- Bruk en 0,5 eller 3 mm elektrode.
- Bruk en spennings spenner 33-35 V.
- Plasser sentrum av elektrodene bare posterior øret primordia.
- Å transfektere thalamus bruk vinkler 25-40 °, for å transfektere hypothalamus 90-180 ° (figur 2D).
- Utfør post elektroporering / postoperativ omsorg som desbert i avsnitt 1.4. Ofre mus og analysere embryoene 6 dager etter elektroporering (E18) som beskrevet i kapittel 3.
3. Perfusjons Fixation
- Forberedelser
- Varm 4% paraformaldehyde (PFA) til 37 ° C.
- Fyll en 50 ml sprøyte med PBS (4 ° C), og en andre sprøyte med oppvarmet PFA. Unngå bobler.
- Koble sprøytene til en treveis stoppekran. Koble den tredje slutt på en bevinget slangesett (butterfly).
- Skyll den bevingede infusjonssettet med PBS.
- Perfusjon
- Dypt bedøve mus (gravid eller postnatal transfektert) med subkutan anvendelse av ketamin-hydroklorid (60 mg / kg) og xylazin (7,5 mg / kg).
- Bekreft kirurgisk toleranse scenen ved manglende respons på tå-klemme.
- Åpne bukhulen like under brystkassen.
- Skjær forsiktig mellomgulvet.
- Åpne forsiktig brystkassen via et kutt på each området opp til kragebeinet.
- Sett spissen av sommerfugl inn i venstre hjertekammer (som starter fra spissen av hjertet).
- Kutt venstre atrial vedheng.
- Sakte perfuse mus med PBS (ca. 10 ml).
- Slå treveis stoppekran.
- Perfuse musen med 5-10 ml 4% PFA.
- Halshogge musen med saks og dissekere hjernen begynner ved foramen magnum. Utfør disseksjon som tidligere publisert 16.
- Postfixate hjernen i 2 dager i 4% PFA. Hold hjernen ved 4 ° C i mørket.
4. Immunohistokjemi
- Generere 70 mikrometer seksjoner (f.eks med et vibratome).
- Valgfritt: Forbedre fluorescens med antistoffarging.
- Sperre delene i 1 time ved romtemperatur (0,1 til 0,2% Triton X-100, 5% normalt geiteserum)
- Inkuber O / N med det passende antistoff (anti-GFP, 1: 1000)
- Vask tre-5 Ganger med 0,1 M fosfatbuffer.
- Inkuber 3 til 5 timer med det passende fluorescens-konjugert sekundært antistoff (Alexa Fluor 488-konjugert anti-kanin-IgG, 1: 1000).
- Valgfritt: Counterstain med 4-6-diaminodino-2-fenylindol (DAPI, 0,2 g / ml i 0,1 M fosfatbuffer) i 1 min.
- Analyser fluorescens med et passende fluorescens mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 viser eksempler på den spesifikke i utero electroporation av regionene utvikler seg til den retrosplenial cortex, motor cortex, somatosensoriske cortex, piriform cortex, cornu ammonis 1-3, gyrus dentatus, striatum, den laterale septal nucleus , thalamus og hypothalamus. Resultatene av transfeksjonene er vist ved siden av den anbefalte vinkel (figur 2). For bedre visualisering av vinklene in vivo posisjonen til elektroden (0,5 mm) er også vist på et embryo (figur 5, embryo in utero, embryo i fostervann sac, dissekert embryo). For å gi en oversikt tabell 1 oppsummeres de relevante fakta for spesifikke transfeksjon.
Videre ble det vist at størrelsen på elektroden spiller en avgjørende rolle for spesifisitet (figur 6). Større størrelse av elektrode elektrodene fører til larger transfektert områder, som eksempelvis vist i figur 6. Videre er elektroder som er for store deksel for mye av embryoet, og dermed øke risikoen for å påvirke embryoer hjerterytme (figur 7). For eksempel kan en 10 mm elektrode padle dekker hele E12 embryoet (figur 7).
Figur 1. I utero elektroporering. Grunnleggende trinn av resultatene av in utero electroporation vises. (A) Viser hele oppsettet av kirurgi, med musen plasseres på en kokeplate allerede bedøvet med isofluran. (B) Den desinfeksjon av kirurgiske området er et viktig skritt før åpning av bukhulen (C) av musen. (D) Den DNA-holdige oppløsning farges med Fast Grønn, som muliggjør visualisering av vellykket injeksjon (E, F). Vellykket injeksjon i en lateral ventrikkel resulterer i halvmåneformet flekk. (G) Etter injeksjonen riktig spenning tilføres via tang typen platinaelektroder. (H) Etter nøye erstatte livmoren i bukhulen operasjonssåret sys. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Vinkel-kart for elektroporering av spesifikke områder i den murine cortex, hippocampus, lateral septal nucleus, striatum, thalamus og hypothalamus. De aktuelle posisjoner for den positive og negative pol, er angitt i den skjematiske tegningen. For (AC ng>) er posisjonene indikert for injisering av DNA-løsningen inn i høyre ventrikkel. For injeksjoner i venstre hjertekammer, vinklene er speilvendt. De spesifikke transfections ble histologisk verifisert. (A) viser posisjonene til de positive og negative pol for transfeksjon av kortikale områder (det retrosplenial cortex (RSC), motor cortex (MC), somatosensoriske cortex (SSC) og piriform cortex (PC). (B) Viser posisjoner av den positive og negative pol for transfektering av hippocampus formasjonene (den ove ammonis 1-3 (CA1, CA2, CA3) og dentate gyrus (DG). (C) viser posisjonene til de positive og negative pol for transfeksjon av striatum (STR) og den laterale septal nucleus (LS). (D) viser riktige posisjoner av elektroder for trans thalamus (TH) og hypothalamus (HY). Tilpasset fra Baumgart J. & Grebe N., 2015 12. ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/53303/53303fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. stukket inn. Den optimale posisjon for injeksjon av den DNA-oppløsningen er ca 0,75 mm koronale fra lambdoidal sutur og 0,5 mm lateral fra sagittal sutur. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Plassering av øret primordium. Posisjonen av øret primordium er klart definert (pil).nk "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Visualisering av vinklene på et embryo. For bedre visualisering de riktige posisjoner for den positive (angitt med et blått plusstegn) og den negative polen for spesifikke trans av kortikale områder (retrosplenial cortex, motor cortex, somatosensoriske cortex, Piriform cortex), hippocampus områder (ove ammonis (CA) 1-3, dentate gyrus (DG)),den laterale septal nucleus, striatum, thalamus og hypothalamus vises på et embryo i livmoren, et foster i fostersekken og på en dissekert embryo (alle E15,5). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Spesifisitet av transfeksjon avhengig av elektrodestørrelsen. Økte størrelsen på elektroden padle reduserer spesifisiteten av transfeksjon. Dette er spesielt tydelig i yngre embryonale trinn (E12, øverst), men også synlig i sene stadier embryonale (E17, nederst). Tilpasset fra Baumgart J. & Grebe N., 2015 12. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Størrelsen på elektroden padle i forhold til størrelsen av en E12 embryoet. Elektroder som er for store deksel for mye av embryoet, og dermed øker risikoen for affeksjon av hjerterytmen. For eksempel, en 10 mm elektrode (til høyre) dekker hele E12 embryo, og derfor anbefales ikke, selv om spesifisitet er ikke det primære målet. Tilpasset fra Baumgart J. & Grebe N., 2015 12. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Målrettet region | Angle | Plassering av elektroden | Age of embryo | DNA amount / konsentrasjon | Spenning | Størrelse på elektrode | |
| Retrosplenial Cortex | 330 ° - 0 ° | Midten av elektrodene bare anterior av øret primordia | E14 (E11-E17) | 1,5- 2 pl / 2.7- 2 ug / ul | 36- 38 | 3- 5 mm | |
| Motor Cortex | 0 ° - 40 ° | Midten av elektrodene bare anterior av øret primordia | E14 (E11-E17) | 1,5- 2 pl / 2.7- 2 ug / ul | 36- 38 | 3- 5 mm | |
| Somatosensoriske Cortex | 40 ° - 95 ° | Midten av elektrodene bare anterior av øret primordia | E14 (E11-E17) | 1,5- 2 pl / 2.7- 2 ug / ul | 36- 38 | 3- 5 mm | |
| Piriform Cortex | 95 ° - 110 ° | Midten av elektrodene bare anterior av øret primordia | E14 (E11-E17) | 1,5- 2 pl / 2.7- 2 ug / ul | 36-3 8 | 3- 5 mm | |
| Cornu Ammonis (CA) 1 | 250 ° - 275 ° | Midten av den positive polen på midten av øret primordium | (E14-) E15 | 2 ul / 2 ug / ul | 38- 40 | 3- 5 mm | |
| CA2 | 230 ° - 250 ° | Midten av den positive polen på midten av øret primordium | (E14-) E15 | 2 ul / 2 ug / ul | 38- 40 | 3- 5 mm | |
| CA3 | 210 ° - 230 ° | Midten av den positive polen på midten av øret primordium | (E14-) E15 | 2 ul / 2 ug / ul | 38- 40 | 3- 5 mm | |
| Dentate Gyrus | 190 ° - 210 ° | Midten av den positive polen på midten av øret primordium | (E14-) E15 | 2 ul / 2 ug / ul | 38- 40 | 3- 5 mm | |
| Striatum | 170 ° - 240 ° | Sentrum av elektrodene i høyde med øret primordia | E12 | 1 mL / 4 ug / ul | 33 | 0,5 mm | |
| Lateral Septal Nucleus | 100 ° - 170 ° | Sentrum av elektrodene i høyde med øret primordia | E12 | 1 mL / 4 ug / ul | 33 | 0,5 mm | |
| Thalamus | 25 ° - 40 ° | Center of the electodes bare posterior øret primordia | E12- E13 | 1-1,5 ul / 4 til 2,7 ug / ul | 33- 35 | 0,5- 3 mm | |
| Hypothalamus | 90 ° - 180 ° | Center of the electodes bare posterior øret primordia | E12- E13 | 1-1,5 ul / 4 til 2,7 ug / ul | 33- 35 | 0,5- 3 mm | |
Tabell 1:. Oppsummering av resultater Inkludert i denne tabellen er alle relevante opplysninger om spesifikke transfeksjon av de beskrevne kortikale områder. Den inneholder informasjon om målregionen, vinkel, posisjon av elektroden, fosterstadiet, den påførte mengden og konsentrasjonen av DNA-oppløsningen, spenningen og størrelsen av elektroden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Fast Green | Roth | 0301.1 | |
| pCAGGS | Addgene | ||
| borosilicate glass capillaries (0.8-0.9 mm diameter) | Wold Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| Isoflurane (Forene) | Abbott | PZN 4831850 | |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer GmbH | approval number: 400684.00.00 | |
| eye ointment (Bepanthen Augen und Nasensalbe) | Bayer | PZN 01578681 | |
| 0.9% benzyl alcohol 0.9% saline solution | Pharmacy of the University Medical Center Mainz |
||
| gauze (ES-Kompressen) | Hartmann | 407835 | |
| sterile 5-0 Perma-Hand Silk Suture | Ethicon Johnson & Johnson | K890H | |
| ring forceps 1/ 1.5 mm | Fine Science Tools | 11101-09 | |
| ring forceps 4.8/ 6 mm | Fine Science Tools | 11106-09 | |
| ring forceps 2.2/ 3 mm | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Adson Forceps-Serrated Straight 12 cm | Fine Science Tools | 1106-12 | |
| IrisScissors-Delicate Straight-Sharp/Blunt 10 cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Mayo-Stille Scissors-Straight 15 cm | Fine Science Tools | 14012-15 | |
| Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Castroviejo NeedleHolder-with Lock-Tungsten Carbide 14 cm | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Elektroporator CUY21 SC | Nepa Gene Co. | ||
| FST 250 Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Microgrinder EG-44 | Narishige | ||
| P-97 Micropette Puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Platinum electrodes 650P 0.5 mm | Nepagene | CUY650P0.5 | |
| Platinum electrodes 650P 3 mm | Nepagene | CUY650P3 | |
| Platinum electrodes 650P 5 mm | Nepagene | CUY650P5 | |
| Platinum electrodes 650P 10 mm | Nepagene | CUY650P10 | |
| Anesthesia system | Rothacher-Medical GmbH | CV-30511-3 Vapor 19.3 | |
| Heating plate | Rothacher-Medical GmbH | HP-1M | |
| Temperature Controller 220V AC | Rothacher-Medical GmbH | TCAT-2LV |
References
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19 Suppl 1. (July), i120-i125 (1991).
- Nakahira, E., Yuasa, S. Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation. J Comp Neurol. 483 (3), 329-340 (2005).
- Navarro-Quiroga, I., Chittajallu, R., Gallo, V., Haydar, T. F. Long-term, selective gene expression in developing and adult hippocampal pyramidal neurons using focal in utero electroporation. J Neurosci. 27 (19), 5007-5011 (2007).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. J Neurosci Methods. 143 (2), 151-158 (2005).
- Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. M. Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders. FNMOL. 4 (November), 37 (2011).
- Tomita, K., Kubo, K. I., Ishii, K., Nakajima, K. Disrupted-in-schizophrenia-1 (Disc1) is necessary for migration of the pyramidal neurons during mouse hippocampal development. Hu Mol Gen. 20 (14), 2834-2845 (2011).
- Niwa, M., Kamiya, A., et al. Knockdown of DISC1 by In Utero Gene Transfer Disturbs Postnatal Dopaminergic Maturation in the Frontal Cortex and Leads to Adult Behavioral Deficits. Neuron. 65 (4), 480-489 (2010).
- Nakahira, E., Kagawa, T., Shimizu, T., Goulding, M. D., Ikenaka, K. Direct evidence that ventral forebrain cells migrate to the cortex and contribute to the generation of cortical myelinating oligodendrocytes. Dev Biol. 291 (1), 123-131 (2006).
- Baumgart, J., Grebe, N. C57BL/6-specific conditions for efficient in utero electroporation of the central nervous system. J Neurosci Methods. 240, 116-124 (2015).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. JoVE. (54), (2011).
- Guedel, A. E. Inhalation anesthesia: a fundamental guide. , Macmillan. New York. (1937).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. JoVE. (65), e3564 (2012).
- Mizutani, K., Saito, T. Progenitors resume generating neurons after temporary inhibition of neurogenesis by Notch activation in the mammalian cerebral cortex. Development. 132 (6), 1295-1304 (2005).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev, Growth & Differ. 50 (6), 507-511 (2008).
