Introduction
Siden den første beskrivelse i 2001 af tre uafhængige grupper 1-3 i n utero elektroporation er blevet en udbredt standard værktøj til analyse af genekspression i gnavere centralnervesystemet. I forhold til generering af knockout-mus, der er, til trods for løbende at forbedre teknikker, stadig tid og penge tidskrævende, de i utero elektroporation appellerer på grund af sin enkelhed. Så i livmoderen elektroporation muliggør hurtig og effektiv GAIN- og tab-af-funktionen undersøgelser 4.
At transficere de cerebrale områder, er opløsningen indeholdende negativt ladet plasmid injiceret i en ventrikel. Under den elektriske impuls, det negativt ladede DNA vandrer mod den positive pol, og derfor den transfekterede region kan vælges blot ved at ændre positionen af den positive pol. Det er ofte blevet påvist, at mange regioner af centralnervesystemet kan være targeted 3,5-8. For eksempel de seneste undersøgelser viser specifikke transfektioner i hippocampus, den piriform cortex eller striatum 9-11. Er dog, at oplysninger om de relevante positioner ofte kun næppe standardiseret og er ikke altid let at overføre til forskellige musestammer.
Transfektion af visse fosterstadier er langt fra trivielt. Mange faktorer skal tages i betragtning, når de vælger opsætningen for specifik in utero elektroporation. Først optimalt at transficere de respektive fosterstadiet, der er behov for viden om de passende spændinger. Højspænding sænke overlevelsesraten, mens lave spændinger reducerer transfektionseffektiviteten 2,3,12. Også størrelsen af elektroden padle spiller en afgørende rolle, fordi brugen af elektrodematerialer paddles, der er for store resultater i reduceret specificitet eller kan forårsage dødsfald som følge af påvirkning af hjerterytmen 4,12,13. Den anvendtespænding og størrelsen og positionen af elektroden paddle er de vigtigste funktioner til at overveje, men der er også andre faktorer, der påvirker resultatet af elektroporation, som den anvendte mængde DNA-opløsning.
Vi har udviklet en detaljeret protokol, som muliggør hurtig og effektiv transfektion af forskellige cerebrale områder i C57BL / 6 mus 12. I denne protokol detaljeret information om spændinger skal anvendes, og størrelsen af elektroden paddle for øget specificitet er tilvejebragt. Endvidere kan information om ventriklen fyldes sammen med anbefalinger til mængden af plasmidopløsning og positionen af elektroden tilføres. Angivelsen af detaljerede position oplysninger i en kort og den videre visualisering af disse positioner muliggør ligetil specifik og effektiv i livmoderen elektroporation af retrospenialis cortex, den motoriske hjernebark, somatosensoriske cortex, den piriform cortex t,han Cornu ammonis 1-3, gyrus dentatus, striatum, den laterale septum nucleus, thalamus og hypothalamus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Statement: Håndteringen af mus og de eksperimentelle procedurer blev gennemført i overensstemmelse med europæiske, nationale og institutionelle retningslinjer for dyr pleje.
1. I Utero Elektroporation
Bemærk: I livmoderen elektroporation blev udført som tidligere offentliggjort 12,14. Derfor er fremgangsmåden kun beskrevet kort i det følgende (figur 1).
- Forberedelser
- Forbered Fast Green farvet endotoxinfrit avancerede transfektion-grade plasmid (indeholdende 1,5 pCAGGS) som tidligere beskrevet 12.
- Træk og male (35 ° vinkel) borosilikatglas kapillærer (0,8-0,9 diameter) til injektion.
- Sterilisere instrumenter.
- Kirurgi
- Administrere analgetika (carprofen, 4 mg / kg legemsvægt, SC, 24 timers depot) mindst 30 minutter, før du starter operationen.
- Holde længden afanæstesi til maksimalt 35-45 min (Trin III - etape af kirurgisk anæstesi ifølge Guedel 15 - maksimal 25-30 min).
- Bedøver tidsindstillede gravide mus med isofluran (induktion i et kammer: 2,8%, kirurgi via maske: 2,5%). Bekræft anæstesi ved passivitet til tå-knivspids.
- Anvend øjet salve for at forhindre øje-tørhed under anæstesi.
- Sterilisere kirurgiske område med 7,5% providon-iodopløsning og dække mus med steril gaze (fugtig med 0,9% benzylalkohol saltopløsning) med kun det kirurgiske område udsættes.
- Skær åbne bughulen med en skalpel (hudincision: 1,5-2 cm, muskel indsnit: 1-1,5 cm).
- Bevar den åbnede bughulen mod udtørring ved fugtning med varmet 0,9% benzylalkohol saltopløsning eller andet sterilt isotonisk opløsning som anvist af veterinære personale eller udvalg.
- Ekstrakt forsigtigt uterine horn (ved hjælp af ring pincet, ikke røre livmoderen med fingerens).
- Injektion af DNA og elektroporation. Bemærk: De præcise oplysninger om rettet mod specifikke områder er angivet i afsnit 2.
- Injicer langsomt den farvede DNA-opløsning i ventriklen som angivet i figur 1, og § 2 via de forberedte borsilicatpartikler kapillærer.
- Påfør en passende spænding for den tilsvarende fosterstadiet (f.eks., 36-38 V for E14) via specialiserede pincet-type platin elektroder (interval cyklus længde 50 msek, interval pause 950 ms). Pulse elektroporation paddles under påføringen af spændingen for at minimere beskadigelse af livmodervæggen.
- Indlæg elektroporation / postoperativ pleje
- Sæt forsigtigt de uterine horn i bughulen.
- Sy musklen og huden indsnit separat.
- Lad musen hvile på et termisk støtte enhed til nyttiggørelse.
- Føre tilsyn musen under restitution (adfærd, foder ogvandforbrug), 4 timer, 24 timer og 48 timer efter operationen. Hvis det er nødvendigt, anvende yderligere analgetika (carprofen, 4 mg / kg legemsvægt, 24 timers depot) for yderligere 2 dage.
2. Transfektion af specifikke Cerebral områder
Bemærk: Positionen af den positive pol er vist som vinklen mellem den lodrette midterlinje gennem ventriklen fyldes med DNA-opløsningen (højre eller tredje ventrikel) og positionen af den positive pol. Ved påfyldning af venstre ventrikel positionerne er spejlvendt. I figur 4 er vist holdninger øret oprindelige, som giver vigtige referencepunkter.
- Transfektion af corticale områder (figur 2A, tabel 1).
- Udføre kirurgi som beskrevet i afsnit 1.2. Til in utero elektroporering af kortikale områder Brug E14 embryoner.
- Injicer 1,5-2 pi DNA-opløsning indeholdende 4 ug DNA i den rigtige laterale ventrikelvia de forberedte borsilicat kapillærer.
- Placer forsigtigt foster ved hjælp af ring pincet, så der ikke er nogen synlige fartøjer over indstiksstedet.
- Injicer langsomt DNA-opløsningen ca. 0,75 mm koronale fra lambdoidal sutur og 0,5 mm lateralt fra sagittale sutur (figur 3). Sørg for, at indsættelsen dybde er 1,2 mm (E14, målt fra livmodervæggen). Check for en blå-grøn farve med en skarp afgrænsning.
- Påfør spænding via de specialiserede pincet-type platinelektroder (interval cykluslængde 50 msek, interval pause 950 ms).
- Brug en 3 eller 5 mm elektrode padle.
- Bruge en spænding i området fra 36-38 V.
- Placer midten af elektroderne lige foran af øre primordier.
- At transficere retrospenialis cortex brug vinkler 330-0 °, til transfektion motoren cortex 0-40 °, til transfektion somatosensoriske cortex på 40-95 °, til transfektionDen piriform cortex 95-110 ° (figur 2A).
- Udfør indlæg elektroporation / postoperativ pleje som beskrevet i afsnit 1.4. Sacrifice musene og analysere embryoner 4 dage efter elektroporation (E18) som beskrevet i afsnit 3.
- Transfektion af hippocampus (figur 2B, tabel 1).
- Udføre kirurgi som beskrevet i afsnit 1.2. Til in utero elektroporering af hippocampaldannelse bruge E15 embryoner.
- Injicer 2 pi DNA-opløsning indeholdende 4 ug DNA i den rigtige laterale ventrikel via de forberedte borsilicat kapillærer.
- Påfør spænding via de specialiserede pincet-type platinelektroder (interval cykluslængde 50 msek, interval pause 950 ms).
- Brug en 3 eller 5 mm elektrode padle.
- Bruge en spænding i området fra 38-40.
- Placer midten af den negative pol lige anterior af øret primordium og centrum of pluspol midt på øret primordium.
- At transficere den tandede gyrus bruge vinkler fra 190-210 °, til transfektion Cornu ammonis (CA) 3 210-230 °, til transfektion af CA2 230-250 °, til transfektion CA1 250-275 ° (figur 2B).
- Udfør indlæg elektroporation / postoperativ pleje som beskrevet i afsnit 1.4. Udfør analyse efter fuldstændig hippocampus dannelse (efter fødslen, p21) som beskrevet i afsnit 3.
- Transfektion af den laterale septal kerne og striatum (figur 2C, tabel 1)
Bemærk: Vinklerne overlapper til transfektion hippocampus. For effektivt at transficere den laterale septal kerne og striatum uden uønsket hippocampus transfektion tidligere fosterstadier (E12) skal anvendes.- Udføre kirurgi som beskrevet i afsnit 1.2. Til in utero elektroporation af den laterale septal kerne og striatum bruge E12 embryoer.
- Der indsprøjtes 1 pi DNA-opløsning indeholdende 4 ug DNA i den rigtige laterale ventrikel via de forberedte borsilicat kapillærer.
- Påfør spænding via de specialiserede pincet-type platinelektroder (interval cykluslængde 50 msek, interval pause 950 ms).
- Brug en 0,5 mm elektrode.
- Brug 33 V.
- Placer midten af elektroderne på niveau med øret primordier.
- At transficere de laterale nucleus septal brug vinkler fra 100-170 °, til transfektion striatum 170-240 ° (figur 2C).
- Udfør indlæg elektroporation / postoperativ pleje som beskrevet i afsnit 1.4. Sacrifice musene og analysere embryoner 6 dage efter elektroporation (E18) som beskrevet i afsnit 3.
- Transfektion af thalamus og hypothalamus (figur 2D, tabel 1)
- Udføre kirurgi som beskrevet i afsnit 1.2. For iuTero elektroporation af thalamus og hypothalamus brug E12-E13 embryoner.
- Injicer 1-1,5 pi DNA-opløsning indeholdende 4 ug DNA i den laterale ventrikel (venstre eller højre) via de forberedte borsilicat kapillærer. Vente 2-3 min, indtil opløsningen er diffunderet ind i den tredje ventrikel. Alternativt direkte injicere ind i den tredje ventrikel.
Bemærk: Dette forbedrer specificitet, men kan forårsage en nedsat overlevelsesrate (høj risiko for skader). - Påfør spænding via de specialiserede pincet-type platinelektroder (interval cykluslængde 50 msek, interval pause 950 ms).
- Brug en 0,5 eller 3 mm elektrode.
- Bruge en spænding i området fra 33-35 V.
- Placer midten af elektroderne bare posterior øret primordier.
- At transficere thalamus brug vinkler fra 25-40 °, til transfektion hypothalamus 90-180 ° (figur 2D).
- Udfør indlæg elektroporation / postoperativ pleje som described i afsnit 1.4. Sacrifice musene og analysere embryoner 6 dage efter elektroporation (E18) som beskrevet i afsnit 3.
3. Perfusion Fiksering
- Forberedelser
- Varm 4% paraformaldehyd (PFA) til 37 ° C.
- Fyld en sprøjte 50 ml med PBS (4 ° C) og en anden sprøjte med opvarmet PFA. Undgå bobler.
- Tilslut sprøjterne til en tre-vejs stophane. Slut den tredje ende til en bevinget infusionssæt (sommerfugl).
- Skyl bevingede infusionssæt med PBS.
- Perfusion
- Dybt bedøver de mus (gravid eller postnatal transficeres) med subkutan anvendelse af ketamin-hydrochlorid (60 mg / kg) og xylazin (7,5 mg / kg).
- Bekræft kirurgiske tolerance scenen ved passivitet til tå-knivspids.
- Åbne bughulen lige under brystkassen.
- Skær forsigtigt mellemgulvet.
- Åbn forsigtigt brystkassen via et snit på eACH hjemmeside op til kravebenet.
- Sæt spidsen af butterfly ind i venstre hjertekammer (startende fra hjertespidsen).
- Skær venstre forkammer vedhæng.
- Langsomt perfusion musen med PBS (ca. 10 ml).
- Skift tre-vejs stophane.
- Perfundere mus med 5-10 ml 4% PFA.
- Halshugge musen med en saks og dissekere hjernen begynder ved foramen magnum. Udfør dissektion som tidligere offentliggjort 16.
- Postfixate hjernen i 2 dage i 4% PFA. Hold hjernerne ved 4 ° C i mørke.
4. Immunohistokemi
- Generere 70 um snit (f.eks, med en vibratome).
- Valgfrit: Forbedre fluorescens med antistof farvning.
- Blokere sektionerne i 1 time ved stuetemperatur (0,1-0,2% Triton X-100, 5% normalt gedeserum)
- Inkuber O / N med passende antistof (anti-GFP, 1: 1,000)
- Wash 3-5 Gange med 0,1 M phosphatpuffer.
- Der inkuberes 3-5 timer med det passende fluorescens-konjugeret sekundært antistof (Alexa Fluor 488-konjugeret anti-kanin-IgG, 1: 1000).
- Valgfrit: kontrastfarve med 4-6-diaminodino-2-phenylindol (DAPI, 0,2 g / ml i 0,1 M phosphatbuffer) i 1 min.
- Analyser fluorescens med en passende fluorescensmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 viser eksempler på specifikke in utero elektroporation af regionerne udvikle sig til retrospenialis cortex, den motoriske hjernebark, somatosensoriske cortex i den piriform cortex, Cornu ammonis 1-3, gyrus dentatus, striatum, den laterale septum nucleus , thalamus og hypothalamus. Resultaterne af transfektioner vises ved siden af den anbefalede vinkel (figur 2). For bedre visualisering af vinklerne in vivo position elektroden (0,5 mm) er også vist på et foster (figur 5, embryo i livmoderen, embryo i fosterhinden, dissekeret embryo). For at give et overblik tabel 1 opsummeres de relevante kendsgerninger til specifik transfektion.
Endvidere blev det påvist, at størrelsen af elektroden spiller en afgørende rolle for specificitet (figur 6). Større størrelse af elektroden padler fører til larger transficeret områder, som eksemplarisk vist i figur 6. Endvidere elektroder, der er for store dækning for meget af embryonet, hvilket vil styrke den risikoen for påvirkning af embryonerne hjerterytmen (figur 7). For eksempel en 10 mm elektrode padle dækker hele E12 embryo (figur 7).
Figur 1. I utero elektroporation. Grundlæggende trin af udførelsen af in utero elektroporation er vist. (A) viser hele opsætningen af kirurgien, med musen placeret på en varmeplade allerede bedøvet med isofluran. (B) Den desinfektion af kirurgiske område er et afgørende skridt, før du åbner bughulen (C) på musen. (D) DNA-holdige opløsning er farvet med Fast GReen, som muliggør visualisering af vellykket injektion (E, F). Vellykket injektion i en laterale ventrikel resulterer i halvmåneformede stedet. (G) Efter injektionen den rette spænding anvendes via pincet typen platinelektroder. (H) Efter omhyggeligt udskiftning af livmoderen i bughulen operationssåret sutureres. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Vinkel-map elektroporation specifikke områder i det murine cortex, hippocampus, lateral septal kerne, striatum, thalamus og hypothalamus. De relevante positioner for den positive og negative pol, er angivet i den skematiske tegning. For (AC ng>) positionerne er angivet til injektion af DNA-opløsningen i den højre ventrikel. For injektioner i venstre ventrikel, vinklerne er spejlvendt. De specifikke transfektioner blev histologisk verificeret. (A) viser positionerne af de positive og negative pol til transfektion corticale områder (det retrospenialis cortex (RSC), den motoriske hjernebark (MC), somatosensoriske cortex (SSC) og piriform cortex (PC). (B) viser positioner af de positive og negative pol til transfektion af hippocampus formationer (Cornu ammonis 1-3 (CA1, CA2, CA3) og tandede gyrus (GD). (C) Viser holdninger positive og negative pol til transfektion striatum (STR) og den laterale septal nucleus (LS). (D) Viser de relevante positioner af elektroder til transfektion thalamus (TH) og hypothalamus (HY). Tilpasset fra Baumgart J. & Grebe N. 2015 12. ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/53303/53303fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. punkturstedet. Den optimale position for injektion af DNA-opløsningen er ca. 0,75 mm koronale fra lambdoidal sutur og 0,5 mm lateralt fra sagittale sutur. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Placering af øret primordium. Positionen af øret primordium er klart defineret (pil).nk "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Visualisering af vinkler på et foster. For bedre visualisering de relevante positioner for den positive (angivet med en blå plustegn) og den negative pol til specifikke transfektioner i de kortikale områder (retrospenialis cortex, motoriske hjernebark, somatosensoriske cortex, piriform cortex), de hippocampus områder (Cornu ammonis (CA) 1-3, tandede gyrus (GD)),den laterale septal kerne, striatum, thalamus og hypothalamus vises på et foster i livmoderen, et foster i fosterhinden og på en dissekeret embryo (alle E15,5). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Specificitet af transfektion, afhængigt af elektroden størrelse. Øgede størrelse af elektroden padle reducerer specificiteten af transfektion. Dette er især tydeligt i yngre embryonale stadier (E12, øverst), men også synlig i sene embryonale stadier (E17, nederst). Tilpasset fra Baumgart J. & Grebe N. 2015 12. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Størrelsen af elektroden padle i forhold til størrelsen af en E12 foster. Elektroder der er for store dækning for meget af embryo og dermed øger risikoen for påvirkning af hjerterytmen. For eksempel, en 10 mm elektrode (til højre) dækker hele E12 embryo, og derfor ikke anbefales, selvom specificitet ikke er det primære mål. Tilpasset fra Baumgart J. & Grebe N. 2015 12. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Målregion | Vinkel | Stilling af elektroden | Alder af embryo | DNA Amount / koncentration | Spænding | Størrelse af elektrode | |
| Retrospenialis Cortex | 330 ° - 0 ° | Centrum af elektroderne lige anterior af øret primordier | E14 (E11-E17) | 1,5- 2 pl / 2.7- 2 pg / pl | 36- 38 | 3- 5 mm | |
| Motor Cortex | 0 ° - 40 ° | Centrum af elektroderne lige anterior af øret primordier | E14 (E11-E17) | 1,5- 2 pl / 2.7- 2 pg / pl | 36- 38 | 3- 5 mm | |
| Somatosensoriske Cortex | 40 ° - 95 ° | Centrum af elektroderne lige anterior af øret primordier | E14 (E11-E17) | 1,5- 2 pl / 2.7- 2 pg / pl | 36- 38 | 3- 5 mm | |
| Piriform Cortex | 95 ° - 110 ° | Centrum af elektroderne lige anterior af øret primordier | E14 (E11-E17) | 1,5- 2 pl / 2.7- 2 pg / pl | 36-3 8 | 3- 5 mm | |
| Cornu Ammonis (CA) 1 | 250 ° - 275 ° | Midten af den positive pol på midten af øret primordium | (E14-) E15 | 2 pl / 2 pg / pl | 38- 40 | 3- 5 mm | |
| CA2 | 230 ° - 250 ° | Midten af den positive pol på midten af øret primordium | (E14-) E15 | 2 pl / 2 pg / pl | 38- 40 | 3- 5 mm | |
| CA3 | 210 ° - 230 ° | Midten af den positive pol på midten af øret primordium | (E14-) E15 | 2 pl / 2 pg / pl | 38- 40 | 3- 5 mm | |
| Gyrus dentatus | 190 ° - 210 ° | Midten af den positive pol på midten af øret primordium | (E14-) E15 | 2 pl / 2 pg / pl | 38- 40 | 3- 5 mm | |
| Striatum | 170 ° - 240 ° | Centrum af elektroderne på niveau med øret primordier | E12 | 1 pl / 4 pg / pl | 33 | 0,5 mm | |
| Lateral septal Nucleus | 100 ° - 170 ° | Centrum af elektroderne på niveau med øret primordier | E12 | 1 pl / 4 pg / pl | 33 | 0,5 mm | |
| Thalamus | 25 ° - 40 ° | Midten af electodes bare posterior øret primordia | E12- E13 | 1-1,5 pl / 4-2,7 pg / pl | 33- 35 | 0,5- 3 mm | |
| Hypothalamus | 90 ° - 180 ° | Midten af electodes bare posterior øret primordier | E12- E13 | 1-1,5 pl / 4-2,7 pg / pl | 33- 35 | 0,5- 3 mm | |
Tabel 1:. Oversigt over resultater Inkluderet i denne tabel er alle relevante oplysninger om specifikke transfektion af de beskrevne kortikale områder. Den indeholder oplysninger om målregionen, vinklen, positionen af elektroden, fosterstadiet, den anvendte mængde og koncentration af DNA-opløsningen, spændingen og størrelsen af elektroden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Fast Green | Roth | 0301.1 | |
| pCAGGS | Addgene | ||
| borosilicate glass capillaries (0.8-0.9 mm diameter) | Wold Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| Isoflurane (Forene) | Abbott | PZN 4831850 | |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer GmbH | approval number: 400684.00.00 | |
| eye ointment (Bepanthen Augen und Nasensalbe) | Bayer | PZN 01578681 | |
| 0.9% benzyl alcohol 0.9% saline solution | Pharmacy of the University Medical Center Mainz |
||
| gauze (ES-Kompressen) | Hartmann | 407835 | |
| sterile 5-0 Perma-Hand Silk Suture | Ethicon Johnson & Johnson | K890H | |
| ring forceps 1/ 1.5 mm | Fine Science Tools | 11101-09 | |
| ring forceps 4.8/ 6 mm | Fine Science Tools | 11106-09 | |
| ring forceps 2.2/ 3 mm | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Adson Forceps-Serrated Straight 12 cm | Fine Science Tools | 1106-12 | |
| IrisScissors-Delicate Straight-Sharp/Blunt 10 cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Mayo-Stille Scissors-Straight 15 cm | Fine Science Tools | 14012-15 | |
| Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Castroviejo NeedleHolder-with Lock-Tungsten Carbide 14 cm | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Elektroporator CUY21 SC | Nepa Gene Co. | ||
| FST 250 Hot Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Microgrinder EG-44 | Narishige | ||
| P-97 Micropette Puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Platinum electrodes 650P 0.5 mm | Nepagene | CUY650P0.5 | |
| Platinum electrodes 650P 3 mm | Nepagene | CUY650P3 | |
| Platinum electrodes 650P 5 mm | Nepagene | CUY650P5 | |
| Platinum electrodes 650P 10 mm | Nepagene | CUY650P10 | |
| Anesthesia system | Rothacher-Medical GmbH | CV-30511-3 Vapor 19.3 | |
| Heating plate | Rothacher-Medical GmbH | HP-1M | |
| Temperature Controller 220V AC | Rothacher-Medical GmbH | TCAT-2LV |
References
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19 Suppl 1. (July), i120-i125 (1991).
- Nakahira, E., Yuasa, S. Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation. J Comp Neurol. 483 (3), 329-340 (2005).
- Navarro-Quiroga, I., Chittajallu, R., Gallo, V., Haydar, T. F. Long-term, selective gene expression in developing and adult hippocampal pyramidal neurons using focal in utero electroporation. J Neurosci. 27 (19), 5007-5011 (2007).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. J Neurosci Methods. 143 (2), 151-158 (2005).
- Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. M. Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders. FNMOL. 4 (November), 37 (2011).
- Tomita, K., Kubo, K. I., Ishii, K., Nakajima, K. Disrupted-in-schizophrenia-1 (Disc1) is necessary for migration of the pyramidal neurons during mouse hippocampal development. Hu Mol Gen. 20 (14), 2834-2845 (2011).
- Niwa, M., Kamiya, A., et al. Knockdown of DISC1 by In Utero Gene Transfer Disturbs Postnatal Dopaminergic Maturation in the Frontal Cortex and Leads to Adult Behavioral Deficits. Neuron. 65 (4), 480-489 (2010).
- Nakahira, E., Kagawa, T., Shimizu, T., Goulding, M. D., Ikenaka, K. Direct evidence that ventral forebrain cells migrate to the cortex and contribute to the generation of cortical myelinating oligodendrocytes. Dev Biol. 291 (1), 123-131 (2006).
- Baumgart, J., Grebe, N. C57BL/6-specific conditions for efficient in utero electroporation of the central nervous system. J Neurosci Methods. 240, 116-124 (2015).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. JoVE. (54), (2011).
- Guedel, A. E. Inhalation anesthesia: a fundamental guide. , Macmillan. New York. (1937).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. JoVE. (65), e3564 (2012).
- Mizutani, K., Saito, T. Progenitors resume generating neurons after temporary inhibition of neurogenesis by Notch activation in the mammalian cerebral cortex. Development. 132 (6), 1295-1304 (2005).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev, Growth & Differ. 50 (6), 507-511 (2008).
