Injeção intracerebroventricular de peptídeos amilóide-beta em ratos normais para induzir Acutely déficits cognitivos Alzheimer-like

Summary

O amilóide-β (Ap) -injected modelo animal permite a administração de uma quantidade e espécie de fragmentos de Ap definidos e reduz as diferenças individuais dentro de cada grupo de estudo. Este protocolo descreve a injecção intracerebroventricular (ICV) de Ap sem instrumentos estereotáxicas, permitindo a produção de anormalidades comportamentais Alzheimer-like em ratinhos normais.

Abstract

Amyloid-β (Aβ) is a major pathological mediator of both familial and sporadic Alzheimer’s disease (AD). In the brains of AD patients, progressive accumulation of Aβ oligomers and plaques is observed. Such Aβ abnormalities are believed to block long-term potentiation, impair synaptic function, and induce cognitive deficits. Clinical and experimental evidences have revealed that the acute increase of Aβ levels in the brain allows development of Alzheimer-like phenotypes. Hence, a detailed protocol describing how to acutely generate an AD mouse model via the intracerebroventricular (ICV) injection of Aβ is necessary in many cases. In this protocol, the steps of the experiment with an Aβ-injected mouse are included, from the preparation of peptides to the testing of behavioral abnormalities. The process of preparing the tools and animal subjects before the injection, of injecting the Aβ into the mouse brain via ICV injection, and of assessing the degree of cognitive impairment are easily explained throughout the protocol, with an emphasis on tips for effective ICV injection of Aβ. By mimicking certain aspects of AD with a designated injection of Aβ, researchers can bypass the aging process and focus on the downstream pathology of Aβ abnormalities.

Introduction

Dado que amilóide-β (Ap) é uma característica patológica da doença de Alzheimer (AD), o desenvolvimento de modelos animais AD tem incidido sobre a superexpressão neural de Ap. Por causa mutações na proteína precursora de amilóide (APP) ou presenilina (PS) levar a distúrbios de Ap equilíbrio e, finalmente, para a patogênese da familial AD ^1, modelos de ratos que envolvem mutações no gene APP ou PS foram geralmente aceite. Entre o vasto leque de ratinhos transgénicos, modelos de ratinho prototípicas incluem o seguinte: Tg2576, PDAPP, APP / PS1 e APP23. No cérebro, estes ratinhos apresentam geralmente agregação de Ap e, eventualmente, as placas senis; formação de placas é seguido por comprometimento cognitivo significativo de tal forma que eles mostram um fraco desempenho em testes comportamentais de aprendizagem e memória. A geração de usar camundongos transgênicos que, naturalmente, imitar AD patologia humana contribuiu, assim, para a sociedade AD pesquisa, permitindo-nos para monitorar a progressão da diSease. No entanto, utilizando ratinhos transgénicos não é económico e demorado porque leva meses para que os ratos desenvolvem placas de Ap e ainda mais tempo para mostrar sináptica induzida com Ap ou anormalidades comportamentais ^2,3. Originalmente desenvolvido como uma alternativa para ultrapassar as deficiências dos modelos de ratinho transgénicos, modelos não transgénicas são também vulgarmente utilizado devido às suas vantagens distintas. modelos AD induzida pelo agente patogénico pode ser produzida através da injecção directa de Ap no cérebro, ao passo que os défices cognitivos ad como também pode ser desencadeada por outras químicas e físicas meios, tais como a injecção de compostos neurotóxicos como a escopolamina, a indução de lesões em áreas relacionadas com a cognição, como o hipocampo, ou por danos cortical ^4. No entanto, a indução não patogênico de comprometimento cognitivo não reflete com precisão a fisiopatologia fundamental da AD; em vez disso, ele só imita seus resultados sintomáticos. Em contraste, um modelo de AD induzida pelo agente patogénico, o A46; modelo -injected rato, não só pode mostrar anormalidades comportamentais AD-like, mas também podem apresentar patologia Aâ, a característica comum compartilhada por AD familiar e esporádica.

Apesar da dificuldade para visualizar as placas de Ap no tecido cerebral, o maior benefício do modelo com injecção de Ap, que faz com que seja atraente para investigação AD é a sua controlabilidade. Pesquisadores podem eliminar as diferenças individuais em modelos de ratos que podem levar a dados errados nos estudos relacionados com a droga. tratamento medicamentoso oportuna é activado dependendo de o mecanismo da droga candidata; para elaborar, um inibidor de agregação de Ap pode ser aplicada antes da injecção de Ap. Além disso, os investigadores podem assumir que a transformação patogénico que surge após a injecção Ap é derivada da exposição Ap porque os outros factores sejam estritamente controladas, incluindo diferenças individuais.

Neste protocolo, uma vívida descrição de how para induzir um fenótipo AD-como em ratos normais via Ap intracerebroventricular injecção (ICV) sem instrumentos estereotáxica é apresentado. Minimizando os danos provocados-inserção para o tecido cerebral é essencial para evitar a possibilidade de danos estruturais e a inflamação induzida pela lesão. A falta de habilidade no manuseio do mouse leva à lesão neuronal inesperado. Além disso, as técnicas que permitem o ângulo e profundidade adequada para ser alcançado durante a injecção são especialmente importantes para contornar erros frequentes. Em adição a uma explicação detalhada, vivas da injecção ICV, a fiabilidade do modelo produzido pelo seguinte protocolo é também ilustrado nas secções seguintes. O protocolo a seguir poderia ser uma ferramenta confiável e de fácil compreensão que contribua para a investigação AD, proporcionando assim um degrau que poderia levar a uma descoberta significativa para a sociedade AD.

Protocol

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NIH Publicações No. 8023, revisto 1978) e com o Comitê de Cuidado e Uso do animal do Comitê Cuidado e Uso Institucional animal de KIST (Seul, Coréia). 1. Preparação de animais Prepara-se uma grupo de ratinhos ICR machos com 7 semanas de idade (ou C57BL / 6). Deixe os ratos passam por um processo de aclimatação para 3-7 dias após o t…

Representative Results

Esta seção ilustra exemplos dos resultados que podem ser obtidos pela confirmação da agregação de Ap e avaliação Y-labirinto de déficits de memória. Usando o comprimento total de Ap (1-42) péptido de 42 aminoácidos, mistura de monómeros, oligómeros de Ap, e fibrilas (Figura 3) foi produzido. Através do passo monomerization induzida por HFIP, foram obtidos monómeros relativamente homogéneos (pista B). Após a 7 dias de incubação, diversas tamanhos de ag…

Discussion

O passo mais importante neste protocolo é a injeção ICV de Ap. Este protocolo é projetado para injetar Aâ na região do ICV de camundongos sem instrumentos estereotaxia ^11,12. Antes de iniciar uma experiência, um período preliminar de injeções de prática com um corante azul em vez de Ap deve ocorrer para atingir destreza suficiente. Imediatamente após a injecção, é necessário verificar se a injecção de pigmento foi realizada correctamente. Cuidadosamente retire o cérebro e verificar se a reg…

Materials

ICR mouse	Orientbio		male, 6~8 weeks, 27~29 g of body weight
C57BL/6 mouse	Orientbio		male, 6~8 weeks, 21~23 g of body weight
Amyloid-beta1-42	in house synthesis	n.a.	stock concentration: 1 mM/DMSO, injected concentration: 100 μM/10% DMSO and 90% PBS
ICV injection syringe (26s gauge)	Hamilton	80308
Evans blue dye (EBD)	abcamBIochemicals	ab120869	1 % EBD in PBS
DMSO	Sigma	D2650
PBS	gibco	10010-023
Gradi-GelTM II Gradient PAGE Analysis Kit	ELPiS Biotech	EBS-1056	15% Gel
Precision Plus ProteinTM Dual Xtra Standards	Bio-Rad	161-0377
Silver-Staining Kit	GE-Healthcare	17-1150-01