Abstract
Till skillnad från däggdjur, insekter såsom Drosophila har flera smak organ. De chemosensory neuroner på benen, snabel, vingar och gadd Drosophila uttrycka smakreceptorer 1,2, jonkanaler 3-6, och jonotropa receptorer 7 som är inblandade i upptäckten av flyktiga och icke-flyktiga sensoriska signaler. Dessa nervceller kontakta tastants såsom mat, skadliga ämnen och feromoner och därför påverka många komplexa beteenden såsom utfodring, äggläggning och parning. Elektrod inspelningar och kalcium avbildning har använts i stor utsträckning i insekter att kvantifiera de neuronala svaren framkallade av dessa tastants. Kräver emellertid elektrospecialutrustning och att utföra mätningar från en enda smak sensillum kan vara tekniskt utmanande beroende på celltyp, storlek och position. Dessutom kan enstaka neuron upplösning i Drosophila vara svårt att uppnå eftersom smak sensilla house mer än en typ av Chemosensory neuron. Den levande kalciumavbildningsmetod som beskrivs här tillåter svar enskilda smak nervceller i levande flugor som skall mätas. Denna metod är särskilt lämplig för avbildning av neuronala svar på lipid feromoner och andra ligand typer som har låg löslighet i vattenbaserade lösningsmedel.
Introduction
Djur är beroende av lukt och luktintrycket uppgifter att förmedla beslut som är nödvändiga för överlevnad och fortplantning. Att förstå hur Chemosensory signaler upptäcks och behandlas av nervsystemet kräver identifiering av sensorisk receptor (er) och motsvarande kemiska ligander. Drosophila upptäcka en häpnadsväckande mängd flyktiga och icke-flyktiga föreningar och är en utmärkt modell för att studera fysiologiska mekanismer som ligger till grund chemosensation. Medan luktorganen uppfattar flyktiga molekyler, de smak organ specialiserade för att detektera låga volatilitet föreningar. Här presenterar vi en metod för att direkt mäta neuronala svar från smak organ Drosophila melanogaster till låg volatilitet, lipofila ligander.
Smak organ flugan inkluderar frambenen, snabel, och vingar. Fördelad på ytan av smak organ är hårliknande strukturer kända som sensilla som svarar på sugars, bitter, salter, vatten och feromoner 8. Den sensilla har klassificerats morfologiskt i smak borst och smak pinnar 9. Det finns ungefär 31 smak borst på labellum som klassificeras i den långa (L-typ), kort (S-typ) och mellanliggande (I-typ) morfologier. "L" och "S" sensilla hus 4 sensoriska neuroner som svarar fysiologiskt socker (S cell), låg salt (L1 cell), hög salt och bittra föreningar (L2 cell) och vatten (W cell) 10 , 11. 'I' sensilla hus 2 sensoriska neuroner, av vilka den ena svarar både låg salt och socker, medan den andra svarar på hög salt 12. Det finns cirka 41 smak sensilla hos män och 26 sensilla hos kvinnor fördelat på vart och ett av frambenen. För både män och kvinnor, det finns 21 sensilla på midleg, och cirka 22 sensilla på bakben 13. De smak nervceller omges av smaken sensilla på benen är också classified i L1, L2, W och S typer.
En standardmetod för mätning av elektrisk aktivitet från enstaka nervceller använder extracellulära eller intracellulära elektroder för att spela jonflöde. Elektrod mätningar tillåter neuronal funktion som skall studeras i icke-modellorganismer såsom Drosophila arter, nattfjärilar och bin som saknar omfattande genetiska verktyg för neurala märkning. Men medan elektrofysiologiska metoder har rutinmässigt används för att mäta aktiviteten från Drosophila smak sensilla 4,13,14, tillämpa denna metod uppvisar flera tekniska utmaningar. Först smak borst måste identifieras baserat på morfologi och rumslig plats. Vid identifiering, kan elektrofysiologiska mätningar hindras av den lilla storleken på sensilla, begränsad tillgänglighet på grund av läget och svårigheter att tillämpa kontrollerade volymer av en kemisk stimulans till en smak borst. Dessutom kan stimulering av sensilla generera signaler från fler än enneuronal typ 15. För det andra, kan detektering av elektriska signaler förväxlas med bakgrundsbrus till följd av mekaniska vibrationer och buller från elektronisk utrustning. För det tredje, kan användningen av en vass elektrod skada flugan preparatet, om de används på fel sätt 14. Slutligen, montering en elektro riggen kräver specialiserade elektroniska komponenter för stimulans leverans, signal inspelning, och dataanalys och kan bli kostsamt.
I D. melanogaster, har tillgången på genetiskt kodade verktyg underlättat utvecklingen av avbildningstekniker som gör att svaren från små populationer av nervceller som ska studeras. Ett sådant tillvägagångssätt är användningen av den CaLexA reporter 16. I denna metod, är gensekvenser som kodar för LexA-VP16-transkriptionsfaktorn och ett kalciumkänsligt protein NFAT sammansvetsade. Kalcium aktivering av protein fosfatas kalcineurin katalyserar de-fosforylering av NFAT och, i sin tur, facilitates sin import till kärnan. Inuti kärnan, binder LexA-domänen till en LexAOp-DNA-bindande motivet som styr uttrycket av ett grönt fluorescerande protein (GFP) reporter, vilket möjliggör fördröjd identifiering av funktionellt aktiverade neuroner. Tillvägagångssättet har använts framgångsrikt för att mäta hur specifika lukt glomeruli i antenn loben efter exponering av levande flugor till ett luktämne 16. Nyligen har fysiologiska reaktioner av IR52c smakreceptor nervceller mätt från levande flugor använder CaLexA 7. Men för denna studie, var det nödvändigt att ålders flugor i upp till sex veckor för att förbättra GFP transkription. Medan immunfärgning med en anti-GFP-antikropp kan användas för att öka CaLexA signalen skulle denna metod kräver vävnadsfixering, vilket således innebär att möjligheten för levande cell imaging.
Den genetiskt kodade kalciumindikatorprotein GCaMP har också i stor utsträckning använts för att studera neuronala responser i ett antalarter 17. Proteinet GCaMP fluorescerar med låg intensitet före neuronal stimulering. Tillämpning av en stimulans utlöser en aktionspotential i neuron, vilket resulterar i tillströmningen av Ca2 +. GCaMP skyldig att Ca2 +, genomgår en strukturförändring, vilket gör att fluorescera med ljusare intensitet (Figur 1). Ett nyligen utvecklat enkel neuron kalciumavbildningsteknik användes för att identifiera glukos som ligand för frambenet specifika Gr61a smak neuroner 18. I denna studie, dissekerades framben från transgena Drosophila som uttrycker GCaMP i Gr61a smak nervceller täckt med ett lager av agaros före avbildning. Emellertid kan användningen av dissekerade vävnaden orsaka eventuell genomgång av GCaMP uttryck, vilket begränsar mättid och detektionskänslighet. Dessutom, agaros kan begränsa känsligheten på grund av höga bakgrundsnivåer av fluorescens och dess ljusspridande egenskaper.
To ta itu med några av dessa nackdelar beskriver vi användningen av GCaMP-medierad kalcium avbildning för att spela in fysiologiska reaktioner från framben och snabel smak neuroner i intakta djur. Vi visar de fysiologiska svaren från Gr68a och ppk23 neuroner som uttrycker genetiskt kodad GCaMP5G 19 till en Drosophila lipid feromon, (3 R, 11 Z, 19 Z) -3-acetoxi-11,19-octacosadien-1-ol (CH503) 20, 21. Neuronala responser mäts genom att kvantifiera ökningen i fluorescens av GCaMP5G signalen under feromon stimulering. I detta protokoll, är nervceller avbildas för sammanlagt minst 120 sek, vilket är tillräckligt för att särskilja mönster av neuronal aktivering i enskilda celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Provframställning
- Korsa Gal4 3,22 föraruppställning till UAS-GCaMP5G 19 flugor (w 1118; P {20XUAS-IVS-GCaMP5G} attP40). Låt korset för att växa vid 25 ° C.
Anmärkning: Generera flyger med multipla kopior av GAL4 eller UAS-GCaMP transgener kan bidra till att öka den fluorescerande signalintensitet. En tidigare version av UAS-GCaMP transgen (UAS-GCaMP3) visade mycket svag fluorescensintensitet när den uttrycks under kontroll av Gr68a-Gal4 förare.- Samla och separat av sex nya eclosed vuxna flugor och höja vid 25 ° C.
Obs: grundnivån för GCaMP5G blomningstid är optimal i flugor i åldern mellan 14-28 dagar. Isolera flugor efter kön utesluter sociala interaktioner som kan påverka nerv svar.
- Samla och separat av sex nya eclosed vuxna flugor och höja vid 25 ° C.
- Söva en fluga under en mild ström av CO2.
- Fäst fly till ett täckglas genom att först placera en liten droppe nagellack i mitten av en 0,17 mm täckglas. Placera försiktigt en fluga på sin sida på droppe klar nagellack och se till att hela droppen omfattas av flugan.
- Utför steg 1,5 och 1,6 under dissekera stereo, användes vid 8X förstoring.
- Använd en våt pensel för att förlänga ett framben av flugan. Säkra benet på plats genom att placera två tunna remsor av tejp under de första och femte böjd segment (Figur 2A). Detta kommer att utsätta böjd segment T2-T4 för avbildning (Figur 2B).
- Till bild neuroner på snabel, placera en tunn remsa av tejp över podiet av snabel att utsätta labellum (Figur 2C, D).
- Rita en hydrofob barriär runt farten med en PAP penna för att förhindra lösningen från strömmar över täckytan. Göra mätningar inom 30 minuter att montera.
2. Framställning av StimulusLösning
- Späd lipofila ligander (såsom CH503, användes i denna studie) i en PBST-lösning: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4, 0,1% Triton X-100 (volym / volym ); pH 7,4.
- Gör en 1 mg / ml förrådslösning av liganden med hjälp av PBST. Förbereda alla efterföljande utspädningar av stamlösningen med användning av PBST.
Anm: Beroende på lösligheten för liganden av intresse, kan olika lösningsmedel behövas för att lösa upp liganden. Lösligheten av CH503 i olika lösningsmedel beskrivs i tabell 1. Till skillnad från andra lösningsmedel, gjorde PBST producerar inte en ökning av fluorescens.
- Gör en 1 mg / ml förrådslösning av liganden med hjälp av PBST. Förbereda alla efterföljande utspädningar av stamlösningen med användning av PBST.
3. Stimulering av Smaklig nervceller och Image Acquisition
- Med hjälp av en 10 l pipett, placera 10 pl PBST på vrist segment.
Obs: Detta steg fuktar benet och förhindrar att vrist segment från drivande. - Använd ett optiskt system som har en kamera på SUfficient hastighet och känslighet för att uppnå god fluorescenssignal med hög tidsupplösning.
Obs: För denna studie använde vi en roterande skiva konfokalmikroskop och en sCMOS kameran (se Materials List). - Välj den specifika böjd segmentet och nervceller som ska avbildas. Förvärva tre pre-stimulering konfokala Z-stackar.
- Helst inställningar användning förvärv som är tillräckligt snabb för att tillåta maximal tidsupplösning samtidigt fånga hela cellvolymen. Exempel förvärvs inställningar är: 200 ms exponering, binning 2 x 2 och 6 x 0,5 pm 2 optiska sektioner, tagna var 2 sek.
Obs: Immobiliserade ben har avbildats med framgång för upp till 10 minuter, vid 30 sek intervall, utan någon märkbar blekning av GCaMP signalen. För längre inspelningstider, se till att benen hålls mycket stadigt på plats på täckglas. - Optimera lasereffekten för högsta signal-till-brus kan uppnås med minimal fotoblekning under hela imaging regim. För de experiment som beskrivs här använder en 491 nm diodlaser (100 mW) vid 30% transmission för avbildning både Gr68a och ppk23 smak nervceller på benen och snabel. Använd 2 x 2 binning för att möjliggöra kortare exponeringstider samtidigt uppnå tillräcklig rumslig upplösning.
Obs: Lasereffektlägen har optimerats för att möjliggöra detektion av fluorescerande förändring som sträcker sig från en 1,2- till 4,5-faldig ökning.
- Helst inställningar användning förvärv som är tillräckligt snabb för att tillåta maximal tidsupplösning samtidigt fånga hela cellvolymen. Exempel förvärvs inställningar är: 200 ms exponering, binning 2 x 2 och 6 x 0,5 pm 2 optiska sektioner, tagna var 2 sek.
- Pipett 10 ul av stimulans lösningen på vrist segment. För kontrollexperiment, lägga till ytterligare 10 pl PBST. Omedelbart förvärva 117 poststimulerings bilder.
Obs! Antalet av post-stimulerings bilder förvärvade är baserat på den tid vid vilken maximal förändring i fluorescens uppnåddes (ca 2 min).- Kritiskt steg: Även pipet lösningen på preparatet, inte röra flyga med pipettspetsen eftersom detta kommer att leda till att benet att flytta ut ur position.
Obs: Du kan även användaen mikromanipulator för att noggrant positionera en glaskapillär innehållande stimulans nära den tarsala segmentet som skall avbildas. Leverera kontrollerade volymer av stimulus genom att använda en intracellulär mikroinjektion dispenser enligt tillverkarens instruktioner.
- Kritiskt steg: Även pipet lösningen på preparatet, inte röra flyga med pipettspetsen eftersom detta kommer att leda till att benet att flytta ut ur position.
4. Bildbehandling och analys: Kvantifiering av svar
- Öppna en serie konfokala Z-stackar med hjälp av Fiji ( http://fiji.sc/Fiji ) 23 eller ImageJ ( http://imagej.nih.gov/ij/ ) 24 bildanalys och bearbetning programvara.
- Göra en summa-intensitet projektion av alla sex Z skivor för var och en av de 120 tidpunkter.
- Välj "Stack" alternativ under "Bild". Vidare, välj "Z projektion" och ange "1" som startskiva och "4" som stoppskiva. För projektion typ, välja R20, sum skivor "från rullgardinsmenyn och välj" Alla tidsramar ".
- Definiera regionen av intresse (ROI) med hjälp av frihand markeringsverktyget för att dra en gräns runt en cellkroppen eller neuronal projektion. Klicka på etiketten "Analysera" och välj "ROI manager" under "Verktyg".
- Kvantifiera fluorescens ROI genom att välja "Set mätningar" alternativet, under menyn "Analysera" och markera rutorna för integrerad densitet, område, menar och maximal grå värde och etikett. Välj sedan "More" alternativet under ROI manager menyn och välj "Multi åtgärden" alternativet vidare.
Obs: Detta kommer att generera en popup-ruta med värden för var och en av de valda parametrarna. - Kontrollera den maximala grå värden för att säkerställa att ingen av bildpunkterna har nått mättnad (t.ex. 65.535 för en 16-bitars kamera).
OBS: För experimenten som visas i thans papper, svar mättes antingen från cellkroppar eller neuronala projektioner, beroende på var den maximala ökningen av AF / F observerades. - Beräkna den högsta relativa förändringen i fluorescens (AF / F) vid tidpunkten t är som följer:
- Subtrahera bakgrundsfluorescens från varje F (cell) värde. För att kvantifiera bakgrundsfluorescens, mäta den integrerade densiteten hos en ROI av motsvarande storlek och form från ett område av frambenet (eller snabel) saknar detekterbara neuroner.
- För att kvantifiera den post-stimulerings fluorescens, F (cell) t, mäta den integrerade densiteten hos ROI för cellkroppen eller processen vid tidpunkt "t" efter stimulering.
- Att kvantifiera förstimulering fluorescens, F (cell) t = 0, analysera pre-stimulus bilder av cellkroppen eller processen på samma sätt somefterstimuleringssignalen. Använd den genomsnittliga integrerade densitet 3 bilder för att fastställa F (cell) t = 0.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kalcium indikator GCaMP var genetisk användning av Gr68a-Gal4 eller ppk23-Gal4 förare. Distinkta populationer av frambenets neuroner och icke-neurala stödceller är märkta av varje förare (Figur 3A-C). Ligand-specifika svar på lipofila feromon CH503 observerades i Gr68a-Gal4 och ppk23-Gal4-celler som uttrycker GCaMP (Figur 3D). Den relativa förändringen av fluorescensintensiteten hos GCaMP5G signalen (AF / F) och ökade med högre koncentrationer av CH503 (figur 3E). Intressant nog kan det 5 ng dos av CH503 trycka den neurala svar.
Gr68a och ppk23 nervceller uppvisade olika svarsmönster. Gr68a neuroner visade en tonic mönster av neuronal svar (Figur 3F), medan ppk23 neuroner visade en phasic, oscillerande svar (figur 3G). Svar från ppk23 neuroner i snabel var enLSO mäts med hjälp av detta preparat och uppvisade en kombination av phasic och oscillerande svar (figur 3H).
Figur 1:. Grundprincipen för GCaMP kalcium avbildningsteknik GCaMP5G är genetisk i Gal4 -märkt celler och fluorescerar med låg intensitet före neuronal stimulering. Tillämpning av en stimulans utlöser en aktionspotential i neuron och orsakar Ca2 + inflöde. GCaMP5G, en gång bundna till Ca2 +, undergår en konformationsförändring, vilket resulterar i ökad fluorescens (AF), som förändras över tiden. Baslinje fluorescens (F) avser fluorescerande signal intensitet före stimulering.
Figur 2: Montering av levande fluga för avbildning av framben eller snabel nervceller.(A) Montering av framben: en 3.2x bild av en levande manlig fluga, visar frambenen fästa täck med tejp. (B) En 40X bild av flugan, som visar var och en av de vrist segmenten (T1-5) och placering av bandet ovanför den första böjd segmentet och om den femte vrist segmenten. (C) Montering av snabel: en bit tejp placeras över talarstolen för att exponera toppen av snabel. (D) Den pipettspets för stimulans Dessutom hålls något över farten och inte komma i direkt kontakt med preparatet.
Figur 3:. Feromon-inducerad neurala svar i GCaMP-uttryckande neuroner (A) Schematisk bild av den manliga framben Drosophila visar de rumsliga positionerna för Gr68a-Gal4 märkta celler på vrist segment T2-4. Icke-neurala celler (identifierade baserat på storlek och form) är colored gult. (B) Rå fluorescerande bild av den manliga benet visar neurala och stödceller märkta med Gr68a-Gal4 förare. Skalstreck = 50 | im. (C) Schematisk bild av den manliga framben Drosophila visar de rumsliga positionerna för ppk23-Gal4 märkta celler på vrist segment T2-4. (D) Reaktion hos Gr68a- och ppk23-uttryckande T4 neuroner till CH503 (kemiska struktur visas ovan). Den genomsnittliga AF / F som svar på CH503 jämfördes med den genomsnittliga AF / F efter applicering av PBST lösningsmedel ensam; Students t-test med olika varians (för Gr68a) eller Mann-Whitney-testet (för ppk23): * p <0,05, *** p <0,001. Felstaplar visar sem Statistisk effekt = 0,93. (E) En dosberoende förändring i Δ F / F har observerats i Gr68a nervceller i T4. Students t-test med olika varians: ** p <0,01, *** p <0,001. Statistisk effekt = 0,86-0,96. (F (G) En färgkodade tidsförloppet visar en oscillerande, phasic svar i GCaMP fluorescens efter CH503 stimulering (500 ng) av ppk23-uttryckande neuroner. Positionerna för de neuroner på frambenet visas i den råa fluorescerande bild (vänster). Skala bar: 10 pm; tidsskala: 0-96 sek. Den medföljande Linjediagrammet visar ett spräng svar från en ppk23 neuron på stimulering med 500 ng CH503. Röd pil anger den tid vid vilken den stimulans tillsattes. Topp RespoNSE sker vid 76 sek. (H) En färgkodad tidsförloppet för ppk23-uttryckande neuroner på snabel visar en sen debut tonic svar från cellkroppen och en oscillerande svar från en axonal projektion efter CH503 stimulering (500 ng). Positionerna för de celler visas i den råa fluorescerande bild (vänster). Skalstreck = 10 | im; tidsskala: 0-96 sek. Reproducerad med tillstånd från Shankar, S., et al. Neuropeptid takykinin är viktigt för feromon upptäckt i en smak neural krets. doi:. 10,7554 / eLife.06914 (2015) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| lösningsmedel 1,2 | Lösligheten för CH 5 0 3 3 | Har lösningsmedel ensam utlösa nervaktivitet? 4 |
| 0,1% PBST | JA | NEJ |
| 100% etanol | JA | JA |
| 100% Hexan | JA | JA |
| 10% Etanol | NEJ | (Ej testad) |
| 10% hexan | NEJ | (Ej testad) |
| 100% DMSO | JA | JA |
| 10% DMSO | JA | JA |
| 0,4% DMSO | JA | JA |
| 0,2% DMSO | JA | JA |
Tabell 1:. 1 Löslighet av CH 5 0 3 i olika lösningsmedel DMSO:. Dimetylsulfoxid 2 etanol, hexan, och DMSO-lösningarna i utspädd med dH 2 O (v / v) 3 Löslighet av CH503 i 0,2% DMSO var begränsad. endast till 250 ng / ml. 4 Ökning av AF / F med enbart lösningsmedel var likvärdig med den som observed vid stimulering med feromon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver här en metod för att spela live kalcium avbildning av Drosophila perifera neuroner i 2 olika sinnesorgan. Ca2 + -evoked GCaMP fluorescerande svar i Gr68a-neuroner inducerade av feromonet liganden CH503 var dosberoende och kvantitativ. Det var också möjligt att urskilja olika neurala svarsmönster som phasic och tonic svar.
Neuroner visar phasic svar tros möjliggöra en snabb anpassning till kontinuerliga stimuli. Denna typ av svar har satts i samband med lukt upptäckt 25 och generering av rytmiska motoraktivitetsmönster 26. Däremot neurala svängningar, som har beskrivits i många sensoriska system är tänkt att synkronisera flera ingångar till en enda postsynaptisk plats och att förmedla specifika egenskaper om den stimulans 27. Den molekylära grunden för oscillationer associerade med ppk23 neuroner ännu inte har rapporterats, till vår knowledge. I andra typer av exciterbara celler som visar oscillerande svar, har frekvensen av oscillationerna visats regleras genom en process som kallas kalcium-inducerad kalciumfrisättning 28. I denna process, är kalcium frisatt från inre förråd under kontroll av den sekundära budbäraren inositoltrifosfat, och frekvensen av dess frisättning är beroende på styrkan av den yttre stimulans. Insikter i den molekylära grunden för tonic neuronala svar har fått från studier på syre kännande receptorer C. elegans 29. En långvarig ökning av kalciumnivåer i neuroner befanns vara medierad av L-typ spänningsstyrda kalciumkanaler, ryanodin och inositoltrifosfat signalvägar 29. Det är viktigt att ta reda på om liknande mekanismer spelar en roll i svaren från ppk23 nervceller.
Live kalcium avbildning kan anpassas på flera sätt för att studera andra populationer av
Flera tekniska consideransoner är absolut nödvändigt att få stabila bilder och att noggrant mäta tidsförloppet av fysiologiska reaktioner. Först måste frambenet vara säkert placerad eftersom farten uppvisar kraftig rörelse vid tillsats av lösningen, som kan vara en källa till variation mellan förberedelserna. Även om bad applicering av feromon lösning tillåter liganden att nå alla av luktintrycket sensilla på de exponerade vrist segmenten, kan en del av lösningen strömma mot andra delar av den monterade preparatet. Också kunde frambenet potentiellt glida bort när lösningen sättes. För det andra, exakt bild nära-momentana ökningar i fluorescens, är det att viktigt att återuppta avbildning omedelbart efter tillsats av stimulus eftersom vissa neuroner visar en snabb och maximal respons inom 4 sekunder av stimulering. Alternativt kan en kontinuerlig tidsserie initieras före tillsats av stimulus-lösning, och den exakta tidpunkt vid vilken den stimulans administreras kan markeras.
lass = "jove_content"> Två källor till falska positiva svar observerades. För det första kan själva lösningsmedlet inducerar fluorescerande svar även i frånvaro av en ligand. Den PBST lösningsmedel orsakat en sådan reaktion i vissa ppk23-Gal4 märkta celler. Dessutom, DMSO, ett ofta använt lösningsmedel för polära och opolära molekyler, även inducerade ett svar i vissa Gr68a-Gal4 märkta nervceller. Det är därför viktigt att avgöra huruvida lösningsmedlet självt inducerar en fluorescerande signal och för att välja ett lösningsmedelssystem med låg bakgrundsaktivitet. För det andra, var en stark phasic-typ svar i icke-neurala stödceller observerlösningsmedels PBST ensam. Den Gr68a-Gal4 föraren uttrycks i både nervceller och stödceller som verkar för att omge en del av de neuroner och i allmänhet, är större, amorft formad, och saknar synliga utsprång. Det är därför viktigt att skilja neurala från icke-neuronala svar för varje Gal4 linje när man väljer ROI.
_content "> En viktig begränsning med denna metod är att samma flugan preparatet inte kan användas för successiva experiment för att testa olika koncentrationer eller typer av ligander, såvida inte den pålagda stimulus först grundligt avlägsnas från ytan av täck. Dessutom har denna metod kan inte användas för hög genomströmning avbildning av flera flugor på en gång, på grund av den hög förstoring behövs för visualisering av Drosophila-neuroner, och behovet av snabb förvärv och hög tidsupplösning. Slutligen kräver denna metod att det finns genetiska verktyg för transgen genuttryck , vilket begränsar ansökan i första hand till större modellorganismer.Sammantaget är denna metod ett enklare alternativ till cellulära inspelningar med elektroderna och inte kräver specialiserad instrumentering. Dessutom, till skillnad från andra genetiskt kodade reportrar såsom CaLexA, är djuret hålls vid liv genom hela avbildnings tillåta fysiologiska reaktioner som skall mätas i real-tid med hög känslighet i flugor i alla åldrar. Denna funktion skulle kunna göra det möjligt för screening av åldersberoende svar på ligander eller jämförelse av neurala svar följande ändringar i sociala förhållanden eller reproduktions tillstånd. Vidare kan ihållande inspelningar utföras under minst 10 min utan uppenbar fotoblekning eller genomgång av GCaMP signal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gr68a-Gal4 | Gift from H. Amrein (Texas A&M Health Science Center, TX, USA) and J. Carlson (Yale University, CT, USA) | ||
| ppk23-Gal4 | Gift from K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA) | ||
| UAS-GCaMP5 | 42037 | Bloomington Drosophila Stock Center | |
| 0.17 mm coverslip (Gold-Seal coverslip) | Electron Microscopy Services | 63790-10 | |
| Nail polish, "Hard as Nails Clear" | Sally Hansen | ||
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Paint brush | fine-tipped brush | ||
| Tape | Scotch brand | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 13021 | |
| Ethanol, lab grade | Merck | 10094 | |
| Hexane, HPLC grade | Sigma-Aldrich | H303SK-4 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| PBST | Recipe described in the protocol section | ||
| CH503 | Synthesis described in Mori et al., 2010 | ||
| sCMOS Camera (ORCA Flash4.0) | Hamamatsu | C11578-22U | |
| Microscope (Ti-Eclipse) | Nikon | Ni-E | |
| Spinning Disk Scan head | Yokogawa | CSU-X1-A1 | |
| Aquistion Software (MetaMorph Premier) | Molecular Devices | 40002 | |
| Fiji software | open source | http://fiji.sc/Fiji |
References
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R.
- Dunipace, L., Meister, S., McNealy, C., Amrein, H. Spatially restricted expression of candidate taste receptors in the Drosophila gustatory system. Curr. Biol. 11, 822-835 (2001).
- Thistle, R., Cameron, P., Ghorayshi, A., Dennison, L., Scott, K. Contact chemoreceptors mediate male-male repulsion and male-female attraction during Drosophila courtship. Cell. 149, 1140-1151 (2012).
- Toda, H., Zhao, X., Dickson, B. J. The Drosophila female aphrodisiac pheromone activates ppk23(+) sensory neurons to elicit male courtship behavior. Cell Rep. 1, 599-607 (2012).
- Vijayan, V., Thistle, R., Liu, T., Starostina, E., Pikielny, C. W. Drosophila pheromone-sensing neurons expressing the ppk25 ion channel subunit stimulate male courtship and female receptivity. PLoS Genet. 10, 1004238 (2014).
- Lu, B., LaMora, A., Sun, Y., Welsh, M. J., Ben-Shahar, Y. ppk23-Dependent chemosensory functions contribute to courtship behavior in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 8, e1002587 (2012).
- Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a Clade of Ionotropic Receptors Are Candidate Taste and Pheromone Receptors. Neuron. 83, 850-865 (2014).
- Montell, C. A taste of the Drosophila gustatory receptors. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 345-353 (2009).
- Shanbhag, S. R., Park, S. K., Pikielny, C. W., Steinbrecht, R. A. Gustatory organs of Drosophila melanogaster: fine structure and expression of the putative odorant-binding protein PBPRP2. Cell Tissue Res. 304, 423-437 (2001).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. J. Neurobiol. 56, 139-152 (2003).
- Rodrigues, V., Siddiqi, O. A gustatory mutant of Drosophila defective in pyranose receptors. Mol. Genet. Genomics. 181, 406-408 (1981).
- Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. J. Neurobiol. 61, 333-342 (2004).
- Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of Drosophila. J. Neurosci. 34, 7148-7164 (2014).
- Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. J. Vis. Exp. , e51355 (2014).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Lansky, P., Rospars, J. P. Estimation of the individual firing frequencies of two neurons recorded with a single electrode. Chem. Senses. 28, 671-679 (2003).
- Masuyama, K., Zhang, Y., Rao, Y., Wang, J. W. Mapping neural circuits with activity-dependent nuclear import of a transcription factor. J. Neurogenet. 26, 89-102 (2012).
- Akerboom, J., et al. Crystal structures of the GCaMP calcium sensor reveal the mechanism of fluorescence signal change and aid rational design. J. Biol. Chem. 284, 6455-6464 (2009).
- Miyamoto, T., Chen, Y., Slone, J., Amrein, H. Identification of a Drosophila glucose receptor using Ca2+ imaging of single chemosensory neurons. PloS One. 8, e56304 (2013).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
- Shikichi, Y., et al. Pheromone synthesis. Part 250: Determination of the stereostructure of CH503 a sex pheromone of male Drosophila melanogaster, as (3R,11Z,19Z)-3-acetoxy-11,19-octacosadien-1-ol by synthesis and chromatographic analysis of its eight isomers. Tetrahedron. 68, 3750-3760 (2012).
- Yew, J. Y., et al. A new male sex pheromone and novel cuticular cues for chemical communication in Drosophila. Curr. Biol. 19, 1245-1254 (2009).
- Bray, S., Amrein, H. A putative Drosophila pheromone receptor expressed in male-specific taste neurons is required for efficient courtship. Neuron. 39, 1019-1029 (2003).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Kaissling, K. E., Zack Strausfeld, C., Rumbo, E. R. Adaptation processes in insect olfactory receptors. Mechanisms and behavioral significance. Ann. N. Y. Acad. Sci. 510, 104-112 (1987).
- Marder, E., Bucher, D. Central pattern generators and the control of rhythmic movements. Curr. Biol. 11, 986-996 (2001).
- Koepsell, K., Wang, X., Hirsch, J. A., Sommer, F. T. Exploring the function of neural oscillations in early sensory systems. Front Neurosci. 4, 53 (2010).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
- Busch, K. E., et al. Tonic signaling from O(2) sensors sets neural circuit activity and behavioral state. Nat Neurosci. 15, 581-591 (2012).
