Abstract
哺乳類とは異なり、このようなショウジョウバエなどの昆虫は、複数の味覚器官を持っています。脚、吻、翼とショウジョウバエの産卵管上の化学感覚ニューロンは、味覚受容体1,2、イオンチャンネル3-6、揮発性および不揮発性の感覚手がかりの検出に関与するイオンチャネル型受容体7を発現します 。これらのニューロンは、直接、食品、有害物質やフェロモンのような味物質に接触し、したがって、このような給紙、産卵や交配などの多くの複雑な動作に影響を与えます。電極記録とカルシウムイメージングは、広くこれらの味物質によって誘発される神経細胞の応答を定量するために、昆虫に使用されてきました。しかし、電気は特殊な装置を必要とし、単一の味感覚子からの測定値を得ることは、細胞型、サイズ、および位置に応じて技術的に困難であることができます。また、 ショウジョウバエにおける単一ニューロン分解能は味の感覚器の侯ので、達成することが困難な場合が化学感覚ニューロンの複数のタイプがSE。ここに記載のライブカルシウムイメージング法は、ライブハエにおける単一味覚ニューロンの応答を測定することができます。この方法は、水性溶媒中で低い溶解度を有する脂質フェロモンおよび他のリガンドタイプのニューロンの応答を画像化するために特に適しています。
Introduction
動物は生存と繁殖のための本質的な意思決定を媒介するために、嗅覚や味覚情報に依存しています。検出され、神経系によってどのように処理されるか化学感覚手がかり理解することは、感覚受容体（複数可）および対応する化学リガンドの同定を必要とする。 ショウジョウバエは、揮発性および非揮発性化合物の驚異的な多様性を検出し、生理を研究する中で優れたモデルですchemosensationのメカニズム。嗅覚器官が揮発性分子を認識しながら、味覚器官は低揮発性化合物を検出するために特化されます。ここでは、直接、低揮発性、親油性リガンドにキイロショウジョウバエの味覚器官からの神経細胞応答を測定するための方法を提示します。
ハエの味覚器官は前足、口吻、および翼を含みます。 sに応答する感覚器として知られている毛様構造は、味覚器官の表面に分布していますugars、ビター、塩、水およびフェロモン8。感覚子は味の剛毛と味ペグ9に形態学的に分類されています。ロング（L型）に分類されている唇弁上の約31味覚毛、ショート（Sタイプ）と中間（i型）形態があります。糖に生理的に応答する'L'と's'の感覚器家4感覚ニューロン（S細胞）、低塩（L1細胞）、高塩と苦味化合物（L2細胞）と水（Wセル）10 、11。高塩12に他の応答しながら'i'を、低塩と砂糖の両方に応答するそのうちの一つ感覚子家2感覚ニューロンを、。男性の約41味覚感覚器と前足の各々の上に分布し、女性で26感覚器があります。男性と女性の両方のために、脚の中央部に21感覚器、および後肢13で約22感覚器があります。足の味覚感覚器で囲まれた味覚ニューロンはまた、cはL1、L2、WとSタイプにlassified。
単一ニューロンからの電気的活動を測定するための1つの標準的な方法は、イオンの流れを記録するために、細胞外または細胞内の電極を使用します。電極の測定は、神経機能は、 ショウジョウバエの種、蛾、および神経標識のために大規模な遺伝子ツールを欠いているミツバチなどの非モデル生物で研究することを可能にします。しかし、電気生理学的方法は、日常的に、このアプローチを適用し、 ショウジョウバエの味覚感覚器4,13,14の活性を測定するために使用されてきたが、いくつかの技術的な課題を提示します。まず、味の剛毛は形態および空間的な位置に基づいて特定する必要があります。識別されると、電気生理学的測定は、感覚器の小型化、による位置に制限のアクセシビリティ、および毛の味に化学的刺激の制御されたボリュームを適用することの難しさによって妨げことができます。また、感覚器を刺激は、複数の信号を生成することができますニューロンのタイプ15。第二、電気信号の検出は、機械的振動や電子機器からのノイズに起因するバックグラウンドノイズによって混乱することができます。誤っ14を使用する場合第三に、先鋭化電極の使用は、フライの準備を損傷する可能性があります。最後に、電気生理学リグを組み立てると、刺激送達、信号記録、及びデータ分析のための特殊な電子部品を必要とし、高価であることができます。
D.でショウジョウバエ 、遺伝的にコードされたツールの利用可能性は、ニューロンの小集団の応答を検討することを可能にする画像化技術の開発が容易になりました。このようなアプローチの1つは、CaLexAレポーター16を使用することです。この方法では、のLexA-VP16転写因子及びカルシウム感受性タンパク質NFATをコードする遺伝子配列が一緒に融合されます。プロテインホスファターゼカルシニューリンのカルシウム活性化は、NFATの脱リン酸化を触媒し、順番に、facilita核へのインポートをTES。核内部に、LexAのドメインは、このように機能的に活性化されたニューロンの持続的な同定を可能にする、緑色蛍光タンパク質（GFP）レポーターの発現を導くLexAop-DNA結合モチーフに特異的に結合します。アプローチは、付臭剤16へのライブハエの暴露後の触角葉における特定の嗅覚糸球体の応答を測定するために成功裏に使用されてきました。最近、IR52c味覚受容体ニューロンの生理学的反応はCaLexA 7を使ってライブハエから測定しました。しかしながら、この研究のために、それは、GFPの転写を増強するために最大6週間齢のハエに必要でした。抗GFP抗体で免疫染色するCaLexA信号をブーストするために使用することができるが、この方法は、このように生細胞イメージングの可能性を排除し、組織の固定を必要とするであろう。
遺伝的にコードされたカルシウム指標タンパク質GCaMPも広範囲の数の神経細胞応答を研究するために使用されてきました種17。タンパク質GCaMPは、神経刺激の前に、低強度で蛍光を発します。刺激の適用は、Ca 2+の流入で、その結果、神経細胞に活動電位をトリガします。 Ca 2+に結合したGCaMPは、それが明るい強度（ 図1）と蛍光を引き起こし、コンフォメーション変化を受けます。最近開発された単一ニューロンカルシウムイメージング法は、前足特定Gr61aの味覚ニューロン18のリガンドとしてグルコースを同定しました。本研究では、Gr61aの味覚ニューロンにおいてGCaMPを発現するトランスジェニックショウジョウバエから解剖前足は、撮像前にアガロースの層で覆われていました。しかしながら、解剖組織の使用は、測定時間と検出感度を制限し、GCaMP発現の最終的荒廃を引き起こすことができます。また、アガロースは、高い蛍光のバックグラウンドレベルとその光散乱特性に対する感度を制限することができます。
TOこれらの欠点のいくつかを解決、我々は前脚と口吻無傷の動物の味覚ニューロンからの生理的反応を記録するGCaMP媒介カルシウムイメージングの使用を記載しています。我々は（3 R、11 Z、19 Z）-3-アセトキシ-11,19-octacosadien -1-オール（CH503）20、 ショウジョウバエの脂質フェロモンに遺伝的にコードされGCaMP5G 19を表現Gr68aとppk23ニューロンの生理学的応答を示します21。ニューロンの応答は、フェロモン刺激時GCaMP5G信号の蛍光の増加を定量することによって測定されます。このプロトコルでは、ニューロンは、個々の細胞内の神経活動のパターンを区別するのに十分である120秒の総持続時間のために結像されます。
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Protocol
1.試料の調製
- UAS-GCaMP5G 19ハエ（; P {20XUAS-IVS-GCaMP5G} attP40 1118ワット ）にGal4の 3,22ドライバーラインを通過。クロスは、25℃で成長させます。
注：生成は、蛍光シグナル強度を高めるために助けることができるのGal4またはUAS-GCaMP導入遺伝子の複数のコピーに飛びます。 Gr68a-Gal4ドライバーの制御下で発現された場合UAS-GCaMP導入遺伝子（UAS-GCaMP3）の以前のバージョンは、非常に微弱な蛍光強度を示しました。- 収集し、分離セックス新たeclosed大人のハエによって、25℃で引き上げます。
注：GCaMP5Gの蛍光のベースラインレベルは14から28日の間熟成させハエにおける最適です。性別によってハエを分離することにより、神経応答に影響を与える可能性があり、社会的相互作用の可能性を排除します。
- 収集し、分離セックス新たeclosed大人のハエによって、25℃で引き上げます。
- CO 2の穏やかな流れの下でハエを麻酔。
- Fを添付最初の0.17ミリメートルのカバースリップの中央にマニキュアの小滴を配置することにより、カバーガラスにLY。静かに明確なマニキュアの降下にその側にフライを配置し、全体の低下はハエで覆われていることを確認してください。
- 8X倍率で使用される解剖実体顕微鏡、下の手順1.5と1.6を実行します。
- ハエの前肢を拡張するために湿った絵筆を使用してください。第1,5足根のセグメント（ 図2A）の上にテープの2つの薄いストリップを配置することによって所定の位置に前足を固定します。これは、イメージング（ 図2B）のための足根セグメントT2-T4を公開します。
- 口先上の画像ニューロンに、唇弁（ 図2C、D）を露出する吻の演壇の上にテープの薄いストリップを配置します。
- カバーガラスの表面上を流れるの解決策を防ぐために、PAPペンでフライの周りに疎水性の障壁を描画します。取り付けの30分以内に測定を行います。
刺激の調製溶液
- 親油性リガンドを希釈PBST溶液中（例えば、本研究で使用CH503、など）：137のNaCl、2.7ミリモルのKCl、10mMののNa 2 HPO 4、1.8mMのKH 2 PO 4、0.1％トリトンX-100（v / v ）; pHは7.4。
- PBSTを用いて、リガンドの1mg / mlの原液を作成します。 PBSTを用いて、原液のすべての後続の希釈液を調製します。
注：目的のリガンドの溶解性に応じて、異なる溶媒リガンドを溶解するために必要とされ得ます。種々の溶媒中でCH503の溶解度は、 表1に記載されている。他の溶媒と異なり、PBSTで蛍光の増加を生じませんでした。
- PBSTを用いて、リガンドの1mg / mlの原液を作成します。 PBSTを用いて、原液のすべての後続の希釈液を調製します。
味覚ニューロンおよび画像取得の3刺激
- 10μlのピペッターを使用して、瞼のセグメント上にPBST10μlのを配置します。
注：このステップは、足を湿らし、漂流から足根セグメントを防ぎます。 - suコマンドのカメラを持つ光学系を使用してください高時間分解能に優れた蛍光シグナルを達成するためにfficient速度と感度。
注：この研究のために我々は（ 材料リストを参照してください）スピニングディスク共焦点顕微鏡とsCMOSカメラを使用していました。 - 撮像されるべき特定の瞼板セグメントとニューロンを選択してください。 3刺激前の共焦点Z-スタックを取得します。
- 理想的には、まだ全体の細胞容積をキャプチャしながら、最大の時間分解能を可能にするのに十分に高速で取得設定を使用します。例取得設定は次のとおりです。200ミリ秒露出、2秒ごとに撮影し、×2 2と6×0.5μmの2光学切片をビニング。
注：固定化された脚はGCaMP信号の識別可能な漂白で、30秒間隔で、最大10分間正常に撮像されています。長時間録画のために、脚はカバースリップ上の所定の位置に非常に強固に保持されていることを確認してください。 - 最高の信号対雑音全体IMA中に最小限の光退色で達成するためのレーザパワーを最適化します政権を銀杏。ここで説明する実験のために、脚と口吻にGr68aとppk23味覚ニューロンの両方を撮像するための30％の送信時に491 nmのダイオードレーザー（100ミリワット）を使用します。まだ十分な空間分解能を達成しながら、より短い露光時間を可能にするために2×2ビニングを使用してください。
注：レーザパワー設定値が1.2〜4.5の倍の増加の範囲の蛍光変化の検出を可能にするように最適化しました。
- 理想的には、まだ全体の細胞容積をキャプチャしながら、最大の時間分解能を可能にするのに十分に高速で取得設定を使用します。例取得設定は次のとおりです。200ミリ秒露出、2秒ごとに撮影し、×2 2と6×0.5μmの2光学切片をビニング。
- ピペット瞼のセグメントへの刺激溶液10μl。対照実験のために、PBSTの別の10μlを添加します。すぐに117刺激後の画像を取得します。
注：取得された刺激後画像の数は、蛍光の最大変化が達成された時間（約2分）に基づいています。- 重要なステップ：これは前脚が所定の位置から移動しますので、準備にソリューションをピペット一方で、ピペットチップでフライに触れることはありません。
注：別の方法として、使用正確に結像される瞼のセグメントに近い刺激を含むガラスキャピラリーを配置するマイクロマニピュレーター。製造元の指示に従って、細胞内マイクロインジェクションディスペンサーを使用して、刺激の制御されたボリュームを提供します。
- 重要なステップ：これは前脚が所定の位置から移動しますので、準備にソリューションをピペット一方で、ピペットチップでフライに触れることはありません。
4.画像処理と解析：応答の定量
- フィジー（用いた共焦点Z-スタックの一連開きhttp://fiji.sc/Fiji ）23またはImageJの（ http://imagej.nih.gov/ij/ ）24画像解析および処理ソフトウェアを。
- 120の時点のそれぞれについて、すべての6つのZスライスの和強度投影を行います。
- 「イメージ」の下の「スタック」オプションを選択します。さらに、「Z投影」オプションを選択し、開始スライスとストップスライスとして「4」と「1」を入力します。投射型の場合は、Rを選択20;和スライスすべての時間枠」をプルダウンメニューから、とは選択します ""。
- 細胞体または神経突起の周りに境界線を描くようにフリーハンド選択ツールを使用して、関心領域（ROI）を定義します。 「分析」ラベルをクリックし、「ツール」の「ROIマネージャー」オプションを選択します。
- 「分析」メニューとの統合密度、面積、平均値、最大グレー値とラベルのボックスをチェックの下、「測定値の設定」オプションを選択することにより、ROIの蛍光を定量化します。そして、ROIマネージャのメニューの下の「詳細」オプションを選択し、さらに「マルチ測定」オプションを選択します。
注：これは、選択した各パラメータの値を持つポップアップボックスを生成します。 - ピクセルのいずれも（16ビットカメラ用に例えば 、65535）飽和状態に達していないことを確認するために、最大グレー値を確認してください。
注：トンに示す実験について彼の論文は、応答はΔF/ Fの最大増加が観察された場所に応じて、細胞体または神経細胞の突起のいずれかから測定しました。 - 時刻tでの蛍光の最大相対変化（ΔF/ F）を計算し 、次のとおりです。
- 各F（セル）の値からバックグラウンド蛍光を引きます。バックグラウンド蛍光を定量化するために、検出可能なニューロンを欠い前足（または吻）の領域から同等のサイズと形状のROIの統合密度を測定。
- 刺激後の蛍光を定量化するために、F（セル）T、時点における細胞体またはプロセスのROIの集積密度を測定し、「T」刺激後。
- 予備刺激蛍光、F（細胞）、T = 0を定量化するために、同様に細胞体または工程の前刺激画像を解析ポスト刺激信号。 F（セル） トン = 0を決定するために3つの画像の平均統合密度を使用してください。
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Representative Results
GCaMPのカルシウム指示薬を遺伝子Gr68a-GAL4またはppk23-Gal4のドライバを使用して発現させました。前脚の神経細胞および非神経支持細胞の異なる集団は、各ドライバ（ 図3A-C）によって標識されています。親油性フェロモンCH503へのリガンド特異的応答はGr68a-GAL4とGCaMP（ 図3D）を発現ppk23-Gal4の細胞で観察されました。 GCaMP5G信号（ΔF/ F）の蛍光強度の相対変化とCH503のより高い濃度（ 図3E）と増加しました。興味深いことに、CH503の5 ngの用量は、神経応答を抑制することができます。
Gr68aとppk23ニューロンは異なる応答パターンを示しました。 ppk23ニューロンは相性、振動応答（ 図3G）を示したのに対し、Gr68aニューロンは、ニューロンの応答（ 図3F）の強壮剤パターンを示しました。口先でppk23ニューロンからの応答がありましたLSOこの準備を使用して測定し、相性や振動応答（ 図3H）の組み合わせを示しました。
図1：GCaMPカルシウムイメージング法の基本原則 GCaMP5Gが遺伝的にGal4で表現され、細胞を標識し、神経刺激の前に、低強度で蛍光を発します。刺激の適用は、ニューロンに活動電位をトリガーおよびCa 2+流入を引き起こします。一回の Ca 2+に結合GCaMP5Gは、経時的に変化する蛍光の増加（ΔF）、その結果、コンフォメーション変化を受けます。基準蛍光（F）は、刺激前の蛍光シグナル強度を指します。
図2：前足または吻ニューロンのイメージングのためのライブフライをマウント。テープでカバーガラスに固定前足を示す、生きた男性のハエの3.2倍の画像：（A）前肢のマウント。 （B）フライの40X画像、瞼のセグメント（T1-5）と第1の足根セグメント上記及び第五足根セグメント上のテープの配置のそれぞれを示します。 （C）口吻取付：テープ片は吻の先端を露出させるために演壇の上に配置されています。 （D）刺激添加のためのピペットチップは、わずかにフライの上に保持され、準備と直接接触しません。
図3：GCaMP発現ニューロンにおけるフェロモンによって誘導される神経応答瞼セグメントT2-4上Gr68a-GAL4標識細胞の空間的な位置を示すショウジョウバエの雄の前足の（A）の回路図。 （大きさや形状に基づいて識別された）非神経細胞が共存しています黄色いlored。 （B）Gr68a-Gal4ドライバーによって標識神経およびサポート細胞を示す雄の前足の生の蛍光画像。 =50μmのスケールバー。 （C） ショウジョウバエは ppk23-GAL4の空間的な位置を示すの男性前肢の概略は、瞼のセグメントT2-4上で細胞を標識しました。 （D）CH503にGr68a-とppk23発現T4ニューロンの応答（化学構造は、上記に示しました）。 CH503に応じて平均ΔF/ Fは、溶媒単独PBSTの平均ΔF/ F以下のアプリケーションと比較しました。不等（Gr68aのための）分散または（ppk23用）マンホイットニー検定を持つスチューデントのt検定：* P <0.05、*** P <0.001。エラーバーはSEM統計電力を描く= 0.93。 （E）ΔF / Fの用量依存的変化はT4でGr68aニューロンにおいて観察されます。不等分散を持つスチューデントのt検定：** P <0.01、*** P <0.001。統計的なパワー= 0.86から0.96。 （F （G）振動を示す色分けされた時間経過、ppk23発現ニューロンのCH503刺激（500ngの）次のGCaMP蛍光の相性応答。前足に神経細胞の位置は、生の蛍光画像（左）に示されています。スケールバー：10μmで、時間スケール：0-96秒。添付折れ線グラフは、CH503 500ngのによる刺激にppk23ニューロンからの破裂の応答を示しています。赤矢印は刺激が追加された時刻を示しています。ピークRESPONSEは76秒で起こります。 （H）細胞体からの遅発性強直性応答とCH503刺激（500ngの）次の軸索投射からの振動応答を示す口先上ppk23発現ニューロンの色分けされた時間経過。セルの位置は、生の蛍光画像（左側）に示されています。スケールバー=10μmの。時間スケール：0-96秒。 らシャンカール、S.、から許可を得て転載。神経ペプチドのタキキニンは、味覚神経回路におけるフェロモン検出のために不可欠です。 DOI：10.7554 / eLife.06914（2015）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 溶剤1,2 | CH 5 0 3 3の溶解度 | 溶剤単独でトリガー神経活動をしていますか？4 |
| 0.1％PBST | はい | NO |
| 100％エタノール | はい | はい |
| 100％ヘキサン | はい | はい |
| 10％エタノール | NO | （テストしていません） |
| 10％ヘキサン | NO | （テストしていません） |
| 100％DMSO | はい | はい |
| 10％DMSO | はい | はい |
| 0.4％DMSO | はい | はい |
| 0.2％DMSO | はい | はい |
表1：様々な溶媒中でCH 5 0 3の溶解度 1 DMSO：ジメチルはスルホキシド2エタノール、ヘキサン、およびDMSO溶液は、中の dH 2で希釈したOは、（v / v）の0.2％DMSO中でCH503の3溶解度が限られていました。わずか250 ng / mlである。溶媒のみでΔF/ Fで4増加はそのobserと同等でしたフェロモンで刺激の際にVED。
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Discussion
ここでは2つの異なる感覚器官にショウジョウバエ末梢ニューロンのライブカルシウムイメージングを実行する方法について説明します。 Ca 2+が CH503は、用量依存的かつ定量的であったフェロモンリガンドによって誘導されるGr68a-ニューロンにおけるGCaMP蛍光応答を-evoked。このような相性や強壮剤応答など、さまざまな神経応答パターンを識別することも可能でした。
一過性応答を示すニューロンの連続刺激に対して迅速な適応を可能にすると考えられています。反応のこのタイプは、臭気検出25とリズム運動活動パターン26の発生と関連しています。対照的に、多くの感覚系に記載されている神経の振動は、単一のシナプス部位に複数の入力を同期させるようにし、刺激27に関する特定の機能を伝達すると考えられています。 ppk23ニューロンに関連した振動の分子的基礎はまだ私達のKNに、報告されていませんowledge。振動応答を示す興奮性細胞の他のタイプでは、振動の周波数は、カルシウム誘発性カルシウム放出28と呼ばれるプロセスによって調節されることが示されています。このプロセスでは、カルシウムは、二次メッセンジャー、イノシトール三リン酸の制御下で、内部貯蔵から放出され、その放出の周波数は、外部刺激の強さに依存します。トニック神経細胞応答の分子基盤への洞察は、Cの受容体を検出する酸素の研究から得られていますエレガンス 29。神経細胞内カルシウムレベルの長期の増加は、L型電位依存性カルシウムチャネル、リアノジン、およびイノシトール三リン酸シグナル伝達経路29によって媒介されることが見出されました。同様のメカニズムがppk23ニューロンの応答における役割を果たしているかどうかを確認することが重要になります。
ライブカルシウムイメージングは、他の集団の研究のためのいくつかの方法で適合させることができます
いくつかの技術的なconside飼料は、安定した画像を得るために、かつ正確な生理学的応答の経時変化を測定するために不可欠です。フライは、調剤間の変動の原因となる可能性が溶液の添加時に活発な動きを示すのでまず、前肢が確実に配置されなければなりません。フェロモン溶液の浴アプリケーションは、リガンドが露出足根セグメントの味覚の感覚器のすべてに到達することを可能にするが、溶液の一部は、取り付けられた製剤の他の部分に向かって流れることができます。溶液を添加した場合にも、前肢は、潜在的に離れてドリフトする可能性があります。第二に、蛍光の正確画像ほぼ瞬時に増加し、いくつかのニューロンが刺激の4秒以内に迅速かつ最大応答を示しているので、すぐに刺激を加えた後、撮影を再開することが重要です。代替的に、連続的な時系列は、刺激溶液、及び刺激をマークすることができる投与される正確な時刻を追加する前に開始することができます。
小娘= "jove_content">偽陽性反応の二つのソースが観察されました。まず、溶媒自体も、リガンドの非存在下で蛍光応答を誘導することができます。 PBST溶媒は、いくつかのppk23-GAL4標識細胞におけるそのような応答を引き起こしました。また、DMSO、極性および非極性分子のために一般的に使用される溶媒は、また、いくつかのGr68a-GAL4ラベルされたニューロンにおける応答を誘導しました。溶媒自体が蛍光シグナルを誘導するかどうかを決定するために、低バックグラウンド活性を有する溶媒系を選択することが不可欠です。第二に、非神経支持細胞において強い相性型応答は、単独の溶媒PBSTに観察されました。 Gr68a-GAL4ドライバーは、ニューロンの一部を囲むように見える両方のニューロン及び支持細胞中で発現され、一般的に、大きく、アモルファス形、可視突起を欠いています。関心領域を選択する際、それぞれのGal4ラインの非神経応答から神経を区別することが重要です。
_content ">この方法の1つの主要な制限は適用された刺激は、最初に完全にカバースリップの表面から除去されない限り、同じフライ製剤は、リガンドの異なる濃度または種類をテストするために、連続する実験のために使用することができないことである。加えて、この方法ショウジョウバエのニューロンの可視化のために必要とされる高倍率、および高速取得および高時間分解能を必要とし、一度に複数のハエの高スループット画像化のために使用することができない。最後に、この方法は、トランスジェニック遺伝子発現のための遺伝的ツールの利用可能性を必要とします、したがって、主に主要なモデル生物への適用を制限します。要するに、この方法は、電極を用いた携帯レコーディングに簡単に代替され、特殊な機器を必要としません。また、このようなCaLexAなどの他の遺伝的にコードされた記者とは異なり、動物を再で測定される生理的反応を可能にするイメージング全体に生かされていますすべての年齢のハエで高感度でアルタイム。この機能は、潜在的リガンドまたは社会的条件や生殖状態の変化を次の神経応答の比較に年齢依存性応答のスクリーニングを可能にすることができます。また、持続的な記録は明らか退色またはGCaMP信号の要約することなく、少なくとも10分間行うことができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gr68a-Gal4 | Gift from H. Amrein (Texas A&M Health Science Center, TX, USA) and J. Carlson (Yale University, CT, USA) | ||
| ppk23-Gal4 | Gift from K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA) | ||
| UAS-GCaMP5 | 42037 | Bloomington Drosophila Stock Center | |
| 0.17 mm coverslip (Gold-Seal coverslip) | Electron Microscopy Services | 63790-10 | |
| Nail polish, "Hard as Nails Clear" | Sally Hansen | ||
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Paint brush | fine-tipped brush | ||
| Tape | Scotch brand | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 13021 | |
| Ethanol, lab grade | Merck | 10094 | |
| Hexane, HPLC grade | Sigma-Aldrich | H303SK-4 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| PBST | Recipe described in the protocol section | ||
| CH503 | Synthesis described in Mori et al., 2010 | ||
| sCMOS Camera (ORCA Flash4.0) | Hamamatsu | C11578-22U | |
| Microscope (Ti-Eclipse) | Nikon | Ni-E | |
| Spinning Disk Scan head | Yokogawa | CSU-X1-A1 | |
| Aquistion Software (MetaMorph Premier) | Molecular Devices | 40002 | |
| Fiji software | open source | http://fiji.sc/Fiji |
References
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