Abstract
Contrairement aux mammifères, les insectes tels que la drosophile ont plusieurs organes de goût. Les neurones chimiosensorielles sur les jambes, les proboscidiens, les ailes et tarière de Drosophila expriment des récepteurs gustatifs 1,2, canaux ioniques 3-6, et les récepteurs ionotropiques 7 qui sont impliqués dans la détection des signaux sensoriels volatiles et non-volatiles. Ces neurones contacter directement tastants tels que la nourriture, les substances et les phéromones nocives et influencent donc beaucoup de comportements complexes tels que l'alimentation, la ponte et l'accouplement. enregistrements d'électrodes et de l'imagerie de calcium ont été largement utilisés dans les insectes pour quantifier les réponses neuronales évoquées par ces sapides. Cependant, l'électrophysiologie nécessite un équipement spécialisé et des mesures d'obtention d'un seul sensille goût peut être techniquement difficile en fonction du type cellulaire, la taille et la position. En outre, la résolution de neurone unique chez la drosophile peut être difficile à atteindre puisque le goût sensilla houSE plus d'un type de neurone chémosensoriel. Procédé d'imagerie en temps réel de calcium décrite ici permet aux réponses des neurones gustatifs simples dans les mouches vivantes à mesurer. Ce procédé est particulièrement adapté pour imager les réponses neuronales aux phéromones lipides et d'autres types de ligands qui ont une faible solubilité dans les solvants à base d'eau.
Introduction
Les animaux comptent sur l'information olfactive et gustative à la médiation des décisions essentielles pour la survie et la reproduction. Comprendre comment les indices chemosensory sont détectées et traitées par le système nerveux exige l' identification du récepteur (s) sensoriel et les ligands chimiques correspondants. Drosophila détecter une variété stupéfiante de composés volatiles et non-volatiles et sont un excellent modèle pour étudier l' état physiologique mécanismes sous-jacents chemosensation. Alors que les organes olfactifs perçoivent des molécules volatiles, les organes gustatifs sont spécialisés pour détecter des composés à faible volatilité. Ici, nous présentons une méthode pour mesurer directement les réponses neuronales des organes du goût de Drosophila melanogaster à faible volatilité, les ligands lipophiles.
organes gustatifs de la mouche comprennent les pattes antérieures, proboscis et les ailes. Distribué à la surface des organes de goût sont des structures ressemblant à des cheveux appelés sensilles qui répondent aux sugars, bitters, les sels, l' eau et les phéromones 8. Le sensilles ont été classés morphologiquement en poils de goût et le goût des pegs 9. Il y a environ 31 poils de goût sur le labelle qui sont classés dans le (type l) de long, court (type s) et (de type i) morphologies intermédiaires. Sensilla maison 4 neurones sensoriels «L» et «s qui répondent physiologiquement à sucre (la cellule S), faible teneur en sel (la cellule L1), en sel et des composés amers (la cellule L2) et de l' eau (la cellule W) 10 , 11. Les «i» maison 2 neurones sensilles sensoriels, dont répond à la fois à faible teneur en sel et de sucre, tandis que l'autre répond à haute teneur en sel 12. Il y a environ 41 goût sensilles chez les hommes et 26 sensilles chez les femelles répartis sur chacune des pattes. Pour les deux hommes et les femmes, il y a 21 sensilles sur le midleg, et environ 22 sensilles sur la patte arrière 13. Les neurones gustatifs clos par le sensilles du goût sur les jambes sont aussi classified en types L1, L2, W et S.
Une méthode standard pour mesurer l'activité électrique de neurones isolés utilise des électrodes extracellulaires ou intracellulaires pour enregistrer le flux d'ions. Mesures d'électrodes permettent la fonction neuronale à étudier dans les organismes non-modèles tels que les espèces de drosophile, les papillons et les abeilles qui manquent des outils génétiques étendus pour l' étiquetage neural. Cependant, alors que les méthodes électrophysiologiques ont été couramment utilisés pour mesurer l' activité de Drosophila goût sensilla 4,13,14, en appliquant cette approche présente plusieurs défis techniques. Tout d'abord, le goût des poils doivent être identifiés sur la base de la morphologie et la localisation spatiale. Après identification, les mesures électrophysiologiques peuvent être entravées par la petite taille de l'sensilla, l'accessibilité limitée en raison de la position, et la difficulté à appliquer des volumes contrôlés d'un stimulus chimique à un goût de poils. En outre, la stimulation de sensilles peut générer des signaux de plus d'unneuronal de type 15. Deuxièmement, la détection de signaux électriques peut être confondu par le bruit de fond résultant des vibrations mécaniques et le bruit des équipements électroniques. Troisièmement, l'utilisation d'une électrode affûtée peut endommager la préparation du vol, si elle est utilisée de façon incorrecte 14. Enfin, l'assemblage d'un appareil de électrophysiologie nécessite des composants électroniques spécialisés pour la livraison de relance, l'enregistrement du signal, et l'analyse de données et peut être coûteux.
Dans D. melanogaster, la disponibilité des outils génétiquement encodés a facilité le développement des techniques d'imagerie qui permettent les réponses des petites populations de neurones à étudier. Une telle approche est l'utilisation de la journaliste CaLexA 16. Dans ce procédé, les séquences de gènes codant pour le facteur de transcription VP16-LexA et une protéine sensible NFAT de calcium sont fondus ensemble. l'activation de calcium de la calcineurine protéine phosphatase de catalyse la phosphorylation de NFAT et, à son tour, facitES son importation dans le noyau. A l'intérieur du noyau, le domaine LexA se lie à un motif de liaison LexAop-ADN qui dirige l'expression d'une protéine fluorescente (GFP) reporteur verte, permettant ainsi l'identification durable de neurones fonctionnellement activés. L'approche a été utilisée avec succès pour mesurer la réponse des glomérules olfactifs spécifique dans le lobe antennaire après une exposition de mouches vivantes à un odorant 16. Récemment, les réponses physiologiques des neurones récepteurs gustatifs de IR52c ont été mesurées à partir de mouches en direct en utilisant CaLexA 7. Cependant, pour cette étude, il était nécessaire de vol d'âge jusqu'à 6 semaines pour améliorer la GFP transcription. Bien que immunocoloration avec un anticorps anti-GFP peut être utilisé pour amplifier le signal CaLexA, cette méthode nécessiterait la fixation des tissus, excluant ainsi la possibilité pour l'imagerie des cellules vivantes.
Calcium protéine indicatrice GCaMP codé génétiquement a également été largement utilisée pour étudier les réponses neuronales dans un certain nombre d'17 espèces. La GCaMP protéine fluoresce avec une faible intensité avant la stimulation neuronale. Application d'un stimulus déclenche un potentiel d'action dans les neurones, ce qui entraîne l'influx de Ca 2+. GCaMP, liés au Ca 2+, subit un changement de conformation, ce qui provoque la fluorescence avec une intensité plus claire (figure 1). Un seul neurone approche d'imagerie de calcium récemment mis au point a été utilisé pour identifier le glucose comme ligand pour les neurones gustatifs de patte spécifiques Gr61a 18. Dans cette étude, les pattes antérieures disséqués à partir de Drosophila exprimant GCaMP transgénique dans les neurones gustatifs Gr61a ont été recouvertes d'une couche d'agarose avant la formation d' image. Cependant, l'utilisation de tissus disséqués peut causer une éventuelle diminution de l'expression GCaMP, limitant ainsi le temps de mesure et de la sensibilité de détection. En outre, l'agarose peut limiter la sensibilité en raison de niveaux de fond élevés de fluorescence et de ses propriétés de diffusion de la lumière.
To résoudre certains de ces inconvénients, nous décrivons l'utilisation de l'imagerie calcique GCaMP médiation pour enregistrer les réponses physiologiques de patte et proboscis neurones gustatifs des animaux intacts. On montre les réponses physiologiques de Gr68a et les neurones exprimant ppk23 codés génétiquement GCaMP5G 19 à un lipide phéromone chez la drosophile, (3 R, 11 Z, 19 Z) -3-acétoxy-11,19-octacosadien-1-ol (CH503) 20, 21. les réponses neuronales sont mesurées par la quantification de l'augmentation de la fluorescence du signal GCaMP5G lors de la stimulation de la phéromone. Dans ce protocole, les neurones sont imagées pour une durée totale de 120 secondes, ce qui est suffisant pour différencier les modes d'activation neuronale dans des cellules individuelles.
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Protocol
Préparation 1. Echantillon
- Franchir la ligne Gal4 3,22 pilote pour UAS-GCaMP5G 19 mouches (w 1118; P {20XUAS-IVS-GCaMP5G} attP40). Laisser la croix de croître à 25 ° C.
Note: Génération vole avec plusieurs copies des transgènes Gal4 ou UAS-GCaMP peut aider à améliorer l'intensité du signal fluorescent. Une version antérieure du transgène UAS-GCaMP (UAS-GCaMP3) a montré très faible intensité de fluorescence lorsqu'elle est exprimée sous le contrôle du pilote Gr68a-Gal4.- Recueillir et séparés par sexe nouvellement éclos mouches adultes et d'élever à 25 ° C.
Remarque: Le niveau de GCaMP5G florescence de base est optimale dans les mouches âgés de 14-28 jours. Isoler mouches par sexe exclut la possibilité d'interactions sociales qui peuvent influer sur les réponses neuronales.
- Recueillir et séparés par sexe nouvellement éclos mouches adultes et d'élever à 25 ° C.
- Anesthetize une mouche sous un courant doux de CO 2.
- Fixer le fly à une lamelle de verre en plaçant d'abord une petite goutte de vernis à ongles dans le centre d'un 0,17 mm lamelle. Placez délicatement une mouche sur son côté sur la goutte de vernis à ongles transparent et veiller à ce que toute la baisse est couvert par la mouche.
- Effectuer les étapes 1.5 et 1.6 sous un stéréomicroscope disséquant, utilisé à un grossissement de 8x.
- Utilisez un pinceau humide pour étendre une patte de la mouche. Fixer la patte en position en plaçant deux bandes minces de ruban adhésif sur les premier et cinquième segments du tarse (figure 2A). Cela permettra d' exposer les segments du tarse T2-T4 pour l' imagerie (figure 2B).
- Pour les neurones d'image sur la trompe, placez une mince bande de ruban adhésif sur la tribune de la trompe pour exposer le labelle (figure 2C, D).
- Tracez une barrière hydrophobe autour de la mouche avec un stylo PAP pour empêcher la solution de circuler sur la surface de la lamelle. Faire des mesures dans les 30 min de montage.
2. Préparation de stimulationSolution
- Diluer les ligands lipophiles (tels que CH503, utilisé dans cette étude) dans une solution de PBST: NaCl 137 mM, KCl 2,7, 10 mM de Na 2 HPO 4, 1,8 mM de KH 2 PO 4, 0,1% de Triton X-100 (v / v ); pH 7,4.
- Faire un ml de solution 1 mg / stock du ligand en utilisant PBST. Préparer toutes les dilutions ultérieures de la solution mère en utilisant PBST.
Remarque: En fonction de la solubilité du ligand d'intérêt, des solvants différents peuvent être nécessaires pour dissoudre le ligand. La solubilité de l' CH503 dans divers solvants est décrite dans le tableau 1. Contrairement à d' autres solvants, PBST n'a pas produit une augmentation de la fluorescence.
- Faire un ml de solution 1 mg / stock du ligand en utilisant PBST. Préparer toutes les dilutions ultérieures de la solution mère en utilisant PBST.
3. Stimulation de Gustative Neurones et l'acquisition d'images
- En utilisant une pipette de 10 ul, placer 10 ul de PBST sur les segments du tarse.
Remarque: Cette étape humidifie la jambe et empêche les segments du tarse à la dérive. - Utiliser un système optique qui comporte une caméra de sula vitesse et la sensibilité FFICIENT pour atteindre un bon signal de fluorescence à haute résolution temporelle.
Note: Pour cette étude , nous avons utilisé un microscope confocal à disque tournant et une caméra sCMOS (voir la liste des matériaux). - Choisissez le segment et les neurones tarse spécifiques à imager. Acquérir trois pré-stimulation confocale Z-piles.
- Idéalement, les paramètres d'acquisition de l'utilisation que sont assez rapides pour permettre une résolution temporelle maximale tout en capturant le volume de la cellule entière. Paramètres d'acquisition de l' exemple sont les suivants : 200 msec exposition, binning 2 x 2 et 6 x 0,5 um 2 sections optiques, capturées toutes les 2 secondes.
Remarque: les jambes immobilisées ont été imagées avec succès jusqu'à 10 min, à intervalles de 30 s, sans blanchiment perceptible du signal GCaMP. Pour de plus longues durées d'enregistrement, veiller à ce que les jambes sont maintenus fermement en place sur la lamelle. - Optimiser la puissance du laser pour le plus haut rapport signal sur bruit réalisable avec photoblanchiment minimale pendant toute la durée imaging régime. Pour les expériences décrites ici, utiliser un 491 nm diode laser (100 mW) à l'émission de 30% pour l'imagerie deux neurones Gr68a et ppk23 gustatifs sur les jambes et proboscis. Utilisez 2 x 2 binning pour permettre la réduction des temps d'exposition tout en obtenant une résolution spatiale suffisante.
Remarque: Les réglages de puissance laser ont été optimisés pour permettre la détection du changement fluorescent allant d'une augmentation de 1,2 à 4,5 fois.
- Idéalement, les paramètres d'acquisition de l'utilisation que sont assez rapides pour permettre une résolution temporelle maximale tout en capturant le volume de la cellule entière. Paramètres d'acquisition de l' exemple sont les suivants : 200 msec exposition, binning 2 x 2 et 6 x 0,5 um 2 sections optiques, capturées toutes les 2 secondes.
- Pipette 10 pl de la solution de relance sur les segments du tarse. Pour les expériences de contrôle, ajouter un autre 10 pi de PBST. Immédiatement acquérir 117 images post-stimulation.
Remarque: Le nombre d'images post-stimulation acquises est basée sur la quantité de temps dans lequel le changement maximal de la fluorescence a été atteint (environ 2 min).- ÉTAPE CRITIQUE: Alors que pipetage solution sur la préparation, ne pas toucher à la volée avec la pointe de la pipette car dans ce cas la patte avant de se déplacer hors de position.
Remarque: Vous pouvez également utiliserun micromanipulateur pour positionner avec précision un capillaire en verre contenant du stimulus à proximité du tarsal à imager. Livrer des volumes contrôlés de stimulus en utilisant un distributeur microinjection intracellulaire selon les instructions du fabricant.
- ÉTAPE CRITIQUE: Alors que pipetage solution sur la préparation, ne pas toucher à la volée avec la pointe de la pipette car dans ce cas la patte avant de se déplacer hors de position.
4. Traitement de l'image et de l'analyse: Quantification de la réponse
- Ouvrez une série de Z-piles confocale en utilisant Fidji ( http://fiji.sc/Fiji ) 23 ou ImageJ ( http://imagej.nih.gov/ij/ ) analyse et de traitement d' image 24 logiciels.
- Faire une projection d'intensité somme des six tranches Z pour chacun des 120 points temporels.
- Sélectionnez l'option "Stack" sous "Image". De plus, sélectionnez l'option "Z de projection" et entrez "1" comme la tranche de début et "4" comme arrêt tranche. Pour le type de projection, sélectionnez R20; somme des tranches "dans le menu déroulant, et choisissez" Tous les délais ".
- Définir la région d'intérêt (ROI) en utilisant l'outil de sélection à main levée pour dessiner une frontière autour d'un corps cellulaire ou une projection neuronale. Cliquez sur l'étiquette "Analyser" et sélectionnez l'option «gestionnaire de ROI" dans "Outils".
- Quantifier la fluorescence du ROI en sélectionnant l'option "Set mesures", dans le menu "Analyser" et de vérifier les boîtes pour la densité intégrée, zone, moyenne et valeur de gris maximale et étiquette. Ensuite, sélectionnez l'option "Plus" dans le menu du gestionnaire de ROI, et sélectionnez encore l'option "Multi mesure".
Remarque: Cela va générer une boîte de pop-up avec des valeurs pour chacun des paramètres sélectionnés. - Vérifiez les valeurs de gris maximales pour veiller à ce qu'aucun des pixels ont atteint la saturation (par exemple, 65535 pour une caméra 16 bits).
NOTE: Pour les expériences montré en tses papiers, les réponses ont été mesurées soit par des organismes cellulaires ou des projections neuronales, selon l'endroit où on a observé l'augmentation maximale AF / F. - Calculer la variation relative maximale de la fluorescence (AF / F) au moment t est la suivante:
- Fond Soustraire fluorescence de chaque F (cellulaire) valeur. Pour quantifier la fluorescence de fond, mesurer la densité intégrée d'un retour sur investissement de taille et de forme équivalente d'une zone de la patte avant (ou proboscis) dépourvue de neurones détectables.
- Pour quantifier la fluorescence post-stimulation, F (cellule) t, mesurer la densité intégrée du ROI du corps ou d'un processus cellulaire à point de temps «t» après stimulation.
- Pour quantifier la fluorescence pré-stimulation, F (cellulaire) t = 0, l' analyse des images de pré-stimulation de l'organisme ou d'un processus cellulaire de la même manière quele signal post-stimulation. Utilisez la densité intégrée moyenne de 3 images pour déterminer F (cellule) t = 0.
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Representative Results
L'indicateur de calcium GCaMP a été génétiquement exprimé en utilisant Gr68a-Gal4 ou pilote ppk23-Gal4. Populations distinctes de neurones et les cellules de patte support non-neuronales sont marqués par chaque pilote (figure 3A-C). Réponses spécifiques Ligand à la phéromone CH503 lipophile ont été observées dans Gr68a-Gal4 et les cellules ppk23-Gal4 exprimant GCaMP (Figure 3D). La variation relative de l'intensité de fluorescence du signal GCaMP5G (AF / F) et augmente avec des concentrations plus élevées de CH503 (Figure 3E). Fait intéressant, la dose de 5 ng de CH503 peut supprimer la réponse neurale.
Gr68a et les neurones ppk23 présentaient des schémas de réponse différents. Neurones Gr68a ont montré un modèle tonique de réponse neuronale (Figure 3F), alors que ppk23 neurones ont montré une phasique, réponse oscillatoire (figure 3G). Les réponses des neurones ppk23 dans les proboscis étaient unLSO mesurée à l' aide de cette préparation et présentait une combinaison de phasiques et oscillatoires réponses (Figure 3H).
Figure 1. Le principe de base de la technique d'imagerie calcique GCaMP GCaMP5G est génétiquement exprimée dans les cellules et Gal4 marqué à fluoresce avec une faible intensité avant la stimulation neuronale. Application d'un stimulus déclenche un potentiel d'action dans les neurones et provoque l'afflux Ca. GCaMP5G, une fois lié à Ca 2+, subit un changement de conformation, ce qui entraîne une augmentation de la fluorescence (AF), qui change au fil du temps. La fluorescence de base (F) désigne l' intensité du signal fluorescent avant la stimulation.
Figure 2: Montage d' un vol direct pour l' imagerie des neurones ou proboscis patte.(A) Montage de la patte: une image de 3,2X d'une mouche mâle direct, montrant les pattes attachées à la lamelle avec du ruban adhésif. (B) d'image A 40X de la mouche, montrant chacun des segments du tarse (T1-5) et le placement de la bande au- dessus du premier segment du tarse et sur les cinquième segments du tarse. (C) Montage des proboscidiens: un morceau de ruban est placée sur la tribune pour exposer le bout de la trompe. (D) La pointe de pipette pour plus de relance est maintenu légèrement au- dessus de la mouche et ne fait pas de contact direct avec la préparation.
Figure 3:. Réponses neuronales induite par la phéromone dans les neurones GCaMP exprimant (A) Schéma de l'antérieur mâle de Drosophila montrant les positions spatiales des Gr68a-Gal4 marqué des cellules sur les segments du tarse T2-4. Les cellules non-neuronales (identifiées en fonction de la taille et la forme) sont colored jaune. (B) d'image fluorescente brut de la patte mâle montrant des cellules neurales et de soutien marqués par le conducteur Gr68a-Gal4. Barre d'échelle = 50 pm. (C) Schéma de la patte mâle de Drosophila montrant les positions spatiales des ppk23-Gal4 des cellules marquées sur les tarses T2-4. (D) Réponse de Gr68a- et les neurones T4 ppk23 exprimant à CH503 (structure chimique représentée ci - dessus). La moyenne AF / F en réponse à CH503 a été comparée à la moyenne AF / F après l' application de PBST solvant seul; test t de Student avec une variance inégale (pour Gr68a) ou test de Mann-Whitney (pour ppk23): * p <0,05, *** p <0,001. Les barres d'erreur représentent la puissance statistique sem = 0,93. (E) un changement de dose-dépendante Δ F / F est observée dans les neurones dans Gr68a T4. test t de Student avec une variance inégale: ** p <0,01, *** p <0,001. La puissance statistique = de 0,86 à 0,96. (F (G) Un cours de temps à code couleur montrant un oscillatoire, la réponse phasique en GCaMP fluorescence après stimulation de CH503 (500 ng) des neurones ppk23 exprimant. Les positions des neurones sur la patte antérieure sont présentés dans l'image fluorescente brute (à gauche). Barre d'échelle: 10 um; échelle de temps: 0-96 sec. Le graphique ci-contre montre une réponse à l'éclatement d'un neurone ppk23 à la stimulation par 500 ng de CH503. flèche rouge indique l'heure à laquelle on a ajouté le stimulus. Le pic response se produit à 76 sec. (H) un courant de neurones ppk23 exprimant sur la trompe montrant une réponse tonique survenue tardive à partir du corps cellulaire et une réponse oscillatoire à partir d' une projection des axones après une stimulation de CH503 (500 ng) Temps couleur. Les positions des cellules sont représentées dans l'image fluorescente brut (à gauche). Barre d'échelle = 10 pm; échelle de temps: 0-96 sec. Reproduit avec la permission de Shankar, S., et al. Le tachykinine neuropeptide est essentiel pour la détection de la phéromone dans un circuit neuronal gustatifs. doi:. 10,7554 / eLife.06914 (2015) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| 1,2 Solvent | La solubilité du CH 5 0 3 3 | Est -ce que la détente seule activité neuronale solvant? 4 |
| 0,1% PBST | OUI | NON |
| 100% d'éthanol | OUI | OUI |
| 100% Hexane | OUI | OUI |
| 10% d'éthanol | NON | (pas testé) |
| 10% Hexane | NON | (pas testé) |
| 100% de DMSO | OUI | OUI |
| 10% de DMSO | OUI | OUI |
| 0,4% de DMSO | OUI | OUI |
| 0,2% de DMSO | OUI | OUI |
Tableau 1:. Solubilité du CH 5 0 3 dans divers solvants 1 DMSO:. Diméthylsulfoxyde 2 éthanol, l' hexane, et des solutions de DMSO ont été dans dilué avec dH 2 O (v / v) 3 Solubilité du CH503 dans 0,2% de DMSO a été limitée. seulement à 250 ng / ml. 4 Augmentation de l'AF / F avec le solvant seul était équivalente à celle obsercb lors d'une stimulation avec phéromone.
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Discussion
Nous décrivons ici une méthode pour effectuer l' imagerie calcique en direct des neurones périphériques drosophile dans 2 organes sensoriels différents. Ca2 + -evoked GCaMP réponses fluorescentes dans Gr68a-neurones induite par le ligand de phéromone CH503 étaient dose-dépendante et quantitative. Il était également possible de discerner différents modèles tels que phasique et réponses toniques réponse neurale.
Neurones montrant les réponses phasiques sont censées permettre une adaptation rapide aux stimuli continus. Ce type de réaction a été associée à la détection des odeurs 25 et la génération des modèles d'activité rythmique du moteur 26. En revanche, les oscillations neuronales, qui ont été décrits dans de nombreux systèmes sensoriels, sont pensés pour synchroniser plusieurs entrées sur un site postsynaptique unique et de transmettre des caractéristiques spécifiques sur le stimulus 27. La base moléculaire des oscillations associées aux neurones ppk23 n'a pas encore été signalé, à notre knowledge. Dans d' autres types de cellules pouvant être excitées montrant des réponses oscillatoires, la fréquence des oscillations a été démontré être réglée par un processus appelé libération induite par le calcium de calcium 28. Dans ce procédé, le calcium est libéré de réserves internes sous le contrôle du second messager d'inositol-triphosphate, et la fréquence de sa sortie dépend de la force du stimulus externe. Regards sur la base moléculaire des réponses neuronales toniques ont été acquises à partir d' études sur les récepteurs de détection d'oxygène de C. elegans 29. Une augmentation prolongée des taux de calcium dans les neurones a été trouvée être médiés par des canaux de type L tension gated calcium, de ryanodine, et les voies de signalisation 29 triphosphate d' inositol. Il sera important de déterminer si des mécanismes similaires jouent un rôle dans les réponses des neurones ppk23.
l'imagerie en temps réel de calcium peut être adaptée de plusieurs façons pour l'étude d'autres populations
Plusieurs consi techniquesrations sont indispensables pour obtenir des images stables et de mesurer avec précision l'évolution temporelle des réponses physiologiques. Tout d'abord, la patte doit être solidement positionnée puisque la mouche présente un mouvement vigoureux lors de l'addition de la solution, qui peut être une source de variation entre les préparations. Bien que l'application de bain de solution de phéromone permet au ligand d'atteindre tous les sensilles gustatifs sur les segments du tarse exposés, une partie de la solution peut couler vers d'autres parties de la préparation montée. En outre, la patte pourrait dériver loin lorsque la solution est ajoutée. En second lieu, avec précision à l'image quasi-instantanées augmentations de fluorescence, il est important de reprendre l'image immédiatement après l'ajout du stimulus étant donné que certains neurones présentent une réponse rapide et maximale en moins de 4 secondes de stimulation. Alternativement, une série chronologique continue peut être initiée avant d'ajouter la solution de relance, et le point de temps précis où le stimulus est administré peut être marqué.
lass = "jove_content"> Deux sources de fausses réponses positives ont été observées. Tout d'abord, le solvant lui-même peut induire des réponses fluorescentes, même en l'absence d'un ligand. Le solvant PBST a provoqué une telle réaction dans certaines cellules ppk23-Gal4 marqués. En outre, le DMSO, un solvant couramment utilisé pour des molécules polaires et apolaires, a également induit une réponse dans certains neurones Gr68a-Gal4 marqués. Il est donc essentiel de déterminer si le solvant lui-même induit un signal de fluorescence et pour sélectionner un système de solvants avec une faible activité de fond. D'autre part, une réponse de type phasique forte dans les cellules de support non nerveuses a été observée au solvant PBST seul. Le conducteur Gr68a-Gal4 est exprimé dans les neurones et les cellules de soutien qui apparaissent à entourer certains des neurones et , en général, sont plus grands, en forme amorphe, et manquent de projections visibles. Il est donc important de différencier neuronal des réponses non-neuronales pour chaque ligne Gal4 lors du choix ROIs.
_content "> Une limitation importante de ce procédé est que la même préparation de mouche ne peut pas être utilisé pour des expériences successives pour tester différentes concentrations ou des types de ligands, à moins que le stimulus appliqué est tout d'abord complètement éliminé de la surface de la lamelle. En outre, ce procédé ne peut pas être utilisé pour l' imagerie à haut débit de plusieurs mouches à la fois, en raison du fort grossissement nécessaire pour la visualisation des neurones de drosophile, et la nécessité pour l' acquisition rapide et haute résolution temporelle. Enfin, cette méthode nécessite la disponibilité d'outils génétiques pour l' expression du gène transgénique , limitant ainsi l'application principalement aux grands organismes modèles.Au total, ce procédé est une alternative plus facile aux enregistrements cellulaires en utilisant des électrodes et ne nécessite aucune instrumentation spécialisée. En outre, contrairement à d'autres journalistes génétiquement codés tels que CaLexA, l'animal est maintenu en vie tout au long de l'imagerie permettant des réponses physiologiques à mesurer dans real-temps avec une sensibilité élevée chez les mouches de tous âges. Cette fonctionnalité pourrait permettre le dépistage des réponses dépendant de l'âge à des ligands ou comparaison des réponses neuronales suite à des changements dans les conditions sociales ou l'état de la reproduction. De plus, les enregistrements soutenus peuvent être effectués pendant au moins 10 min sans photoblanchiment évidente ou diminution des effectifs de signaux GCaMP.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gr68a-Gal4 | Gift from H. Amrein (Texas A&M Health Science Center, TX, USA) and J. Carlson (Yale University, CT, USA) | ||
| ppk23-Gal4 | Gift from K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA) | ||
| UAS-GCaMP5 | 42037 | Bloomington Drosophila Stock Center | |
| 0.17 mm coverslip (Gold-Seal coverslip) | Electron Microscopy Services | 63790-10 | |
| Nail polish, "Hard as Nails Clear" | Sally Hansen | ||
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Paint brush | fine-tipped brush | ||
| Tape | Scotch brand | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 13021 | |
| Ethanol, lab grade | Merck | 10094 | |
| Hexane, HPLC grade | Sigma-Aldrich | H303SK-4 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| PBST | Recipe described in the protocol section | ||
| CH503 | Synthesis described in Mori et al., 2010 | ||
| sCMOS Camera (ORCA Flash4.0) | Hamamatsu | C11578-22U | |
| Microscope (Ti-Eclipse) | Nikon | Ni-E | |
| Spinning Disk Scan head | Yokogawa | CSU-X1-A1 | |
| Aquistion Software (MetaMorph Premier) | Molecular Devices | 40002 | |
| Fiji software | open source | http://fiji.sc/Fiji |
References
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R.
- Dunipace, L., Meister, S., McNealy, C., Amrein, H. Spatially restricted expression of candidate taste receptors in the Drosophila gustatory system. Curr. Biol. 11, 822-835 (2001).
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