Abstract
В отличие от млекопитающих, насекомых , таких как Drosophila есть несколько органов вкуса. В хемосенсорные нейроны на ногах, хоботок, крылья и яйцеклада дрозофилы выражают вкусовых рецепторов 1,2, ионные каналы 3-6 и ионотропные рецепторы 7, которые участвуют в обнаружении летучих и нелетучих сенсорных сигналов. Эти нейроны напрямую связаться с Tastants, такие как продукты питания, вредных веществ и феромонов и, следовательно, влияют на многие сложные поведения, такие как кормление, яйцекладки и вязки. Электрод записи и визуализации кальция широко используются в насекомых для количественного определения нейронные реакции, навеянные этими Tastants. Тем не менее, электрофизиологии требует специального оборудования и получения измерений от одного вкуса сенсиллы может быть технически сложным в зависимости от клеточного типа, размера и положения. Кроме того, одной резолюции нейрон у дрозофилы может быть трудно достичь , так как вкус сенсилл хоуС.Е. более чем один тип хемосенсорной нейроне. Метод живой визуализации кальция, описанный здесь позволяет реакции отдельных нейронов вкусовыми в живых мух необходимо измерить. Этот способ особенно подходит для получения изображения нейрональных ответов на липидные феромонов и других лигандов типов, которые имеют низкую растворимость в воде на основе растворителей.
Introduction
Животные полагаются на обонятельный и вкусовой информации посредничать решения, необходимые для выживания и размножения. Понимание того, как хемосенсорных сигналы обнаруживаются и обрабатываются нервной системы требует идентификации сенсорных рецепторов (ов) и соответствующих химических лигандов. Drosophila обнаружить ошеломляющее разнообразие летучих и нелетучих соединений и являются прекрасной моделью , в которой изучить физиологические механизмы, лежащие в основе chemosensation. В то время как обонятельные органы воспринимают летучие молекулы, вкусовой органы специализированы для выявления низкой летучести соединений. Здесь мы представляем метод непосредственного измерения нейронные ответы от вкусовых органов дрозофилы к низкой волатильности, липофильных лигандов.
Вкусовые органы мухи включают передних, хоботок и крылья. Распределенные на поверхности органов, вкусовыми известны как сенсиллах похожие на волосы структуры, которые отвечают на Sugars, настоек, соли, воды и феромоны 8. Сенсиллы были классифицированы морфологически на вкус щетиной и вкус колышки 9. Есть около 31 вкус щетина на labellum, которые классифицируются в длинную (L-типа), короткие (s-типа) и промежуточные (I-типа) морфологией. Сенсиллы дом 4 сенсорные нейроны 'L' и 'S' , что физиологически реагируют на сахар (Клетка S), с низким содержанием соли (клетка L1), с высоким содержанием соли и горькие соединения (ячейка L2) и воды (W клеток) 10 , 11. "Я" сенсиллах дом 2 сенсорных нейронов, один из которых реагирует как с низким содержанием соли и сахара, в то время как другие реагирует на высокой концентрации соли 12. Есть приблизительно 41 вкус сенсиллы у самцов и 26 самок сенсиллы в распределенных на каждом из передних ног. Для мужчин и женщин, есть 21 сенсиллы на midleg, и около 22 сенсиллы на задних ног 13. Нейроны вкусовым приложенные вкуса сенсиллах на ногах также свана в L1, L2, W и S типов.
Один стандартный метод измерения электрической активности от отдельных нейронов использует внеклеточные или внутриклеточные электроды для записи потока ионов. Измерения электродов позволяют нейронная функции должны быть изучены в не модельных организмов , таких как виды Drosophila, мотыльков и пчел , которые не имеют обширные генетические инструменты для нервной маркировки. Тем не менее, в то время как электрофизиологические методы были обычно используются для измерения активности от Drosophila вкуса сенсиллы 4,13,14, применяя этот подход несколько технических проблем. Во-первых, вкус щетина должны быть идентифицированы на основе морфологии и пространственного расположения. После идентификации, электрофизиологических измерений может быть затруднено из-за малого размера сенсиллах, ограниченный доступ из-за позиции, а также трудности в применении контролируемых объемов химического стимула к вкусу щетиной. Кроме того, стимуляция сенсиллах может генерировать сигналы от более чем однойнейронная тип 15. Во-вторых, обнаружение электрических сигналов могут быть искажены фонового шума в результате механических вибраций и шума от электронного оборудования. В- третьих, использование заостренного электрода может привести к повреждению препарат муху, при неправильном использовании 14. И, наконец, сборке электрофизиологии буровой установки требует специализированных электронных компонентов для доставки стимула, записи сигнала и анализа данных и может быть дорогостоящим.
В D. MELANOGASTER, наличие генетически кодируемых инструментов способствовало развитию методов визуализации , которые позволяют ответы небольших популяций нейронов для изучения. Одним из таких подходов является использование репортера CaLexA 16. В этом методе, генные последовательности, кодирующие фактор транскрипции LexA-VP16 и кальций чувствительный белок NFAT сплавлены вместе. активация кальциевая белка фосфатазы кальциневрина катализирует де-фосфорилирование NFAT и, в свою очередь, facilitaTES его импорт в ядро. Внутри ядра, домен LexA связывается с мотив связывания LexAop-ДНК, которая направляет экспрессию зеленого флуоресцентного белка (GFP) репортера, что позволяет устойчивую идентификацию функционально активированных нейронов. Этот подход был успешно использован для измерения реакции специфического обонятельного клубочков в усиков доли после воздействия живых мух на одоранта 16. В последнее время физиологические реакции IR52c нейронов вкусовыми рецепторами измеряли от живых мух с использованием CaLexA 7. Тем не менее, для этого исследования, это было необходимо для мух возраста до 6 недель для повышения GFP транскрипции. В то время как иммунным окрашиванием с анти-GFP антитела могут быть использованы для усиления сигнала CaLexA, этот метод требует фиксации тканей, тем самым, исключающие возможность для живых клеток.
Генетически закодированы кальция индикатор белка GCaMP также широко используется для изучения нейрональных ответов в ряде17 видов. Белок GCaMP флуоресцирует с низкой интенсивностью до стимуляции нейронов. Применение стимула вызывает потенциал действия в нейроне, что приводит к притоку Ca 2+. GCaMP, связанный с Са 2+, претерпевает конформационные изменения, заставляя его флуоресцировать с яркой интенсивностью (рисунок 1). Недавно разработанный одним нейроном подход визуализации кальция был использован для идентификации глюкозы в качестве лиганда для передней конечности специфических нейронов вкусовыми Gr61a 18. В этом исследовании, расчлененные передние конечности от трансгенного дрозофилы , выражающие GCaMP в вкусовыми нейронов Gr61a были покрыты слоем агарозы до начала визуализации. Тем не менее, использование рассеченной ткани может привести к возможной изношенном выражения GCaMP, ограничивая тем самым время измерения и чувствительность обнаружения. Кроме того, агарозы может ограничить чувствительность из-за высоких фоновых уровней флуоресценции и его свойства рассеяния света.
TO решить некоторые из этих недостатков, мы опишем использование GCaMP-опосредованной визуализации кальция для записи физиологических реакций от лапе и хобота вкусовыми нейронов интактных животных. Нам показывают физиологические реакции Gr68a и ppk23 нейроны , выражающие генетически закодированы GCaMP5G 19 с липидной феромон дрозофилы (R 3, 11 Z, 19 Z) -3-ацетокси-11,19-octacosadien-1-ол (CH503) 20, 21. Нейронные ответа измеряется путем количественного увеличения флуоресценции сигнала GCaMP5G во время стимуляции феромонов. В этом протоколе нейроны изображаются на общей продолжительностью 120 сек, что вполне достаточно, чтобы дифференцировать паттерны нейрональной активации в отдельных клетках.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка образцов
- Крест драйвер линии Gal4 3,22 к UAS-GCaMP5G 19 мух (вес 1118, P {20XUAS-IVS-GCaMP5G} attP40). Дайте кросс расти при 25 ° С.
Примечание: Генерация мух с несколькими копиями трансгенов Gal4 или UAS-GCaMP может способствовать повышению интенсивности флуоресцентного сигнала. Более ранняя версия UAS-GCaMP трансгена (UAS-GCaMP3) показал очень слабую интенсивность флуоресценции при экспрессии под контролем водителя Gr68a-Gal4.- Сбор и отдельно по полу вновь eclosed взрослых мух и поднимают при 25 ° C.
Примечание: Базовый уровень GCaMP5G цветении является оптимальным у мух в возрасте от 14-28 дней. Разделительный мух по полу исключает возможность социальных взаимодействий, которые могут влиять на нервные реакции.
- Сбор и отдельно по полу вновь eclosed взрослых мух и поднимают при 25 ° C.
- Обезболить муху под мягким потоком CO 2.
- Прикрепите пLY к покровного стекла, предварительно поместив небольшую каплю лака для ногтей в центре 0,17 мм покровным. Аккуратно муху на своей стороне на каплю прозрачного лака для ногтей и убедитесь, что вся капля покрыта лету.
- Выполните шаги 1.5 и 1.6 под рассекает стереомикроскопа, используемого при 8х.
- Используйте влажную кисть, чтобы расширить переднюю ногу мухи. Закрепите переднюю ногу в положении, помещая две тонкие полоски ленты над первой и пятой предплюсны сегментов (рис 2А). Это подвергнет члеников лапок T2-T4 для визуализации (рис 2В).
- Для нейронов изображения на хоботка, поместите тонкую полоску ленты на трибуну хоботка разоблачить labellum (рис 2C, D).
- Нарисуйте гидрофобный барьер вокруг лету с PAP ручкой, чтобы предотвратить протекание раствора по поверхности покровного. Проводите измерения в течение 30 мин монтажа.
2. Получение СтимулРешение
- Развести липофильные лиганды (например, CH503, используемые в данном исследовании) в растворе PBST: 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na 2 HPO 4, 1,8 мМ KH 2 PO 4, 0,1% Тритон Х-100 (об / об ); рН 7,4.
- Сделать 1 мг / мл исходного раствора лиганда с использованием PBST с. Приготовьте все последующие разведени исходного раствора с использованием PBST.
Примечание: В зависимости от растворимости интересующих лигандов, различные растворители могут быть необходимы, чтобы растворить лиганд. Растворимость CH503 в различных растворителях описана в таблице 1. В отличие от других растворителей, PBST , не приводят к увеличению флуоресценции.
- Сделать 1 мг / мл исходного раствора лиганда с использованием PBST с. Приготовьте все последующие разведени исходного раствора с использованием PBST.
3. Стимулирование вкусовой Нейроны и Image Acquisition
- Использование 10 мкл пипетки поместите 10 мкл PBST на члеников лапок.
Примечание: Этот шаг смачивает ногу и предотвращает члеников лапок с дрейфующих. - С помощью оптической системы, которая имеет камеру суfficient скорость и чувствительность для достижения хорошего сигнала флуоресценции при высоким временным разрешением.
Примечание: Для этого исследования мы использовали вращающийся диск конфокальной микроскопии и камеру sCMOS (см список материалов). - Выберите конкретный членик и нейроны, которые будут отображены. Приобретать три предварительной стимуляции конфокальной Z-стеки.
- В идеале, параметры сбора данных использования, которые достаточно быстро, чтобы обеспечить максимальное разрешение по времени при этом захватив весь объем клеток. Пример настроек сбора являются: 200 мс экспозиции, бинирование 2 х 2 и 6 х 0,5 мкм 2 оптических секций, захваченные каждые 2 секунды.
Примечание: Иммобилизованные ножки были успешно отображены в течение до 10 мин, при 30-секундными интервалами, без заметной отбеливания сигнала GCaMP. Для увеличения времени записи, убедитесь, что ноги удерживаются очень твердо на месте на покровное. - Оптимизация мощности лазера для высокий сигнал-шум достижимой с минимальными фотообесцвечиванию в течение всего IMAПеренять режим. Для экспериментов, описанных здесь, используют диодный лазер 491 нм (100 мВт) при передаче 30% для работы с изображениями как Gr68a и ppk23 вкусовыми нейроны на ногах и хобота. Используйте 2 х 2 биннинга, чтобы в течение более короткого времени экспозиции в то же время достижения достаточного пространственного разрешения.
Примечание: Установки лазерные мощности были оптимизированы, чтобы обнаружить флуоресцентной изменения в диапазоне от 1,2- до 4,5-кратного увеличения.
- В идеале, параметры сбора данных использования, которые достаточно быстро, чтобы обеспечить максимальное разрешение по времени при этом захватив весь объем клеток. Пример настроек сбора являются: 200 мс экспозиции, бинирование 2 х 2 и 6 х 0,5 мкм 2 оптических секций, захваченные каждые 2 секунды.
- Пипетка 10 мкл раствора стимула на предплюсны сегментов. Для контрольных экспериментов, добавить еще 10 мкл PBST. Сразу получить 117 после стимуляции изображений.
Примечание: Число после стимуляции изображений, полученных на основе количества времени, в котором было достигнуто максимальное изменение флуоресценции (приблизительно 2 мин).- ШАГ КРИТИЧЕСКОЕ: В то время как пипеткой решение по подготовке, не прикасаться к лету кончиком пипетки, так как это приведет к тому, передняя лапа, чтобы выйти из положения.
Примечание: В качестве альтернативы, используйтемикроманипулятор точно позиционировать стеклянный капилляр, содержащий стимул близко к предплюсневому сегмента быть отображены. Deliver контролируемые объемы стимула, используя внутриклеточный микроинъекции дозатор в соответствии с инструкциями изготовителя.
- ШАГ КРИТИЧЕСКОЕ: В то время как пипеткой решение по подготовке, не прикасаться к лету кончиком пипетки, так как это приведет к тому, передняя лапа, чтобы выйти из положения.
4. Обработка изображений и анализ: Количественное Ответе
- Открыть серию конфокальной Z-стеки с помощью Фиджи ( http://fiji.sc/Fiji ) 23 или ImageJ ( http://imagej.nih.gov/ij/ ) анализа и обработки изображений 24 программного обеспечения.
- Сделать сумма интенсивности проекции всех шести Z срезах для каждого из 120 временных точек.
- Выберите опцию "Stack" под "Image". Далее, выберите опцию "проекцию Z" и введите "1" в качестве начального фрагмента и "4" в качестве стоп-среза. Для проекционного типа, выберите R20; сумма ломтики "из выпадающего меню и выберите" Все временные рамки ".
- Определить области интереса (ROI) с помощью инструмента выбора руки, чтобы нарисовать границу вокруг тела клетки или нейронного проекции. Нажмите на этикетке "Analyze" и выберите опцию "менеджер ROI" в разделе "Инструменты".
- Количественная флуоресценции ROI, выбрав опцию "Set измерения", в меню "Анализ" и установив флажки для интегральной плотности, площади, среднее и максимальное значение серого и этикетки. Затем выберите "Дополнительно" опцию в меню менеджера ROI, и далее выберите опцию "Multi меру".
Примечание: При этом генерируется всплывающее окно со значениями для каждого из выбранных параметров. - Проверьте максимальные значения серого , чтобы гарантировать , что ни один из пикселей не достиг насыщения (например, 65535 для 16-разрядной камерой).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов приведены в тего бумаги, ответы были измерены либо из клеточных тел или нейрональных проекций, в зависимости от того, где наблюдалось максимальное увеличение; F / F. - Вычислить максимальное относительное изменение флуоресценции ( ; F / F) в момент времени Т следующим образом :
- Вычтите фоновой флуоресценции от каждого значения F (ячейки). Для количественной оценки фоновой флуоресценции, измерения интегральной плотности в ROI эквивалентного размера и формы из области передней конечности (или хоботка), лишенной обнаруживаемых нейронов.
- Для количественной оценки после стимуляции флуоресценции, F (ячейка) T, измерить интегральную плотность ROI тела клетки или процесса в момент времени "т" после стимуляции.
- Для количественной оценки предварительной стимуляции флуоресценции F (ячейка) T = 0, анализировать предварительно стимула изображения тела клетки или процесса таким же образом , как ипост-стимуляции сигнала. Используйте среднюю интегрированную плотность 3 изображений для определения F (клеток) т = 0.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Был генетически Высказывалось показатель кальция GCaMP использованием Gr68a-GAL4 или драйверы ppk23-GAL4. Четкие популяции нейронов передней конечности и не-нейронных клеток поддержки помечены каждым драйвером (рис 3A-C). Лигандом конкретные ответы на липофильной феромона CH503 наблюдались в Gr68a-Gal4 и ppk23-Gal4 клетки , экспрессирующие GCaMP (рис 3D). Относительное изменение интенсивности флуоресценции сигнала GCaMP5G ( ; F / F) и увеличилась с более высокими концентрациями CH503 (рис 3Е). Интересно отметить, что 5 нг доза CH503 может подавлять нервную реакцию.
Gr68a и ppk23 нейроны выставлены различные образцы ответов. Gr68a нейроны показали тонизирующее картину нейронного ответа (рис 3F), в то время как ppk23 нейроны показали фазическая, колебательный отклик (рис 3G). Ответы, полученные от ppk23 нейронов в хоботка былиРБП измеряется с помощью этого препарата и показал сочетание фазических и колебательные реакций (рис 3Н).
Рисунок 1:. Основной принцип метода визуализации кальция GCaMP GCaMP5G генетически выражается в Gal4 меченных клеток и флуоресцирует с низкой интенсивностью до стимуляции нейронов. Применение стимула вызывает потенциал действия в нейроне и вызывает приток Са 2+. GCaMP5G, когда - то связан с Са 2+, претерпевает конформационные изменения, что приводит к увеличению флуоресценции ( ; F), которая меняется с течением времени. Базовый уровень флуоресценции (F) , относится к интенсивности флуоресцентного сигнала перед стимуляцией.
Рисунок 2: Монтаж живого муху для работы с изображениями передней конечности или хоботок нейронов.(A) Монтаж: на переднюю ногу 3.2x образ живого самца мухи, показывая передние ноги прикреплены к покровным с лентой. (Б) 40X образ лету, показывающий каждый из предплюсны сегментов (T1-5) и размещения ленты выше первого членика лапки и на пятом предплюсны сегментах. (C) Монтаж хоботок: кусок ленты помещается на трибуну , чтобы выставить кончик хобота. (D) Наконечник пипетки для стимула Кроме того слегка удерживаются выше лету и не делает прямой контакт с препаратом.
Рис . 3: Феромонные индуцированных нервных реакций в GCaMP-экспрессирующих нейронов (А) Схематическое мужской лапе дрозофилы показывая пространственные позиции Gr68a-Gal4 меченых клеток на члеников лапок T2-4. Non-нейронные клетки (идентифицированные в зависимости от размера и формы) являются совместноlored желтый. (B) Сырье флуоресцентное изображение мужского лапе , показывающий нервные и поддерживающие клетки , помеченных драйвером Gr68a-Gal4. Шкала бар = 50 мкм. (C) Схема мужской лапе дрозофилы показывая пространственные позиции ppk23-Gal4 меченых клеток на члеников лапок T2-4. (D) Ответ Gr68a- и ppk23-экспрессирующих нейронов Т4 к CH503 (химическая структура , показанная выше). Среднее ; F / F в ответ на CH503 сравнивали со средним ; F / F следующее применение PBST только растворитель; T-критерий Стьюдента с неравной дисперсией (для Gr68a) или теста Манна-Уитни (для ppk23): * р <0,05, *** р <0,001. Столбики ошибок показывают статистическую мощность сем = 0,93. (E) зависит от дозы изменения в А F / F наблюдается в Gr68a нейронов Т4. T-критерий Стьюдента с неравной дисперсией: ** р <0,01, *** р <0,001. Статистическая мощность = 0.86-0.96. (F (G) с цветовым кодом временной ход , показывающий колебательные, фазическая ответ в GCaMP флуоресценции следующие CH503 стимуляции (500 нг) ppk23-экспрессирующих нейронов. Позиции нейронов на лапе показаны в сыром флуоресцентное изображение (слева). Шкала бар: 10 мкм; Временная шкала: 0-96 сек. Сопроводительный линейный график показывает ответ разрывной от ppk23 нейрон на стимуляцию 500 нг CH503. Красная стрелка указывает на время, в которое был добавлен стимул. Пик RespoNSE происходит на 76 сек. (H) с цветовым кодом времени курс ppk23-экспрессирующих нейронов на хоботка , показывая поздним началом ответа тонизирующее от тела клетки и колебательный ответ от аксонов проекции следующей CH503 стимуляции (500 нг). Позиции клеток показаны в сыром флуоресцентное изображение (слева). Шкала бар = 10 мкм; Временная шкала: 0-96 сек. Воспроизводится с разрешения Шанкар, С. и др. Нейропептида Тахикининовые имеет важное значение для обнаружения феромонов в вкусового нейронной цепи. DOI:. 10,7554 / eLife.06914 (2015) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Растворитель 1,2 | Растворимость CH 5 0 3 3 | Имеет ли только растворитель триггер нейронную активность? 4 |
| 0,1% PBST | ДА | НЕТ |
| 100% Этанол | ДА | ДА |
| 100% Гексан | ДА | ДА |
| 10% -ного этилового спирта | НЕТ | (не испытано) |
| 10% Гексан | НЕТ | (не испытано) |
| 100% ДМСО | ДА | ДА |
| 10% ДМСО | ДА | ДА |
| 0,4% ДМСО | ДА | ДА |
| 0,2% ДМСО | ДА | ДА |
Таблица 1:. Растворимость CH 5 0 3 в различных растворителях 1 ДМСО:. Диметилсульфоксид 2 этанол, гексан, и ДМСО растворы в разбавили дН 2 O (V / V) 3 Растворимость CH503 в 0,2% ДМСО был ограничен. только до 250 нг / мл. 4 Увеличение / F ; F с только растворителем была эквивалентна obserвед при стимуляции с феромоном.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы опишем здесь метод для выполнения живого изображения кальция дрозофилы периферических нейронов в 2 -х различных органов чувств. Ca 2+ -evoked ответов флуоресцентных GCaMP в Gr68a-нейронов , вызванных феромона лиганда CH503 были дозозависимое и количественный. Также можно было различить различные модели нейронных реагирования, такие как фазическими и тонических реакций.
Нейроны, показывающие ответы фазовые Считается, что позволяет быстро адаптироваться к непрерывным раздражители. Этот тип реакции был связан с обнаружением 25 запахов и генерации шаблонов 26 активности ритмические двигателя. В отличие от этого , нервные колебания, которые были описаны во многих сенсорных систем, как полагают , чтобы синхронизировать несколько входов на один постсинаптической сайт и передать специфические особенности о раздражителя 27. Молекулярные основы колебаний, связанных с ppk23 нейронов до сих пор не сообщалось, в нашем Knowledge. В других типах возбудимых клеток , показывающих колебательные реакции, частота колебаний , как было показано, регулируется с помощью процесса , называемого кальций-индуцированное высвобождение кальция 28. В этом процессе, кальций высвобождается из внутренних запасов под контролем вторичного мессенджер инозитол трифосфата, а частота его выхода зависит от силы внешнего стимула. Способность проникновения в суть молекулярных основ тонических реакций нейронов были приобретены в результате исследований по зондированию кислорода рецепторов C. Элеганс 29. Было обнаружено, что длительное повышение уровней кальция в пределах нейронов, опосредуется L-типа напряжения кальциевых каналов, Рианодин и передачу сигналов инозитолтрифосфат путей 29. Важно, чтобы установить, является ли играть определенную роль в ответах ppk23 нейронов подобные механизмы.
Живая съемка кальция может быть адаптирована несколькими способами для изучения других популяций
Несколько технических consideрационы необходимо, чтобы получить стабильные изображения и точно измерить временной ход физиологических реакций. Во-первых, передняя нога должна быть надежно установлен, так как муха проявляет энергичное движение при добавлении раствора, который может быть источником изменчивости между препаратами. Хотя ванны применение феромонов раствора позволяет лиганд достичь всех вкусового сенсиллах на обнаженном предплюсны сегментов, некоторые из раствора может течь к другим частям смонтированном препарата. Кроме того, передняя нога потенциально может отпасть при добавлении раствора. Во-вторых, для точного изображения практически мгновенного увеличения флуоресценции, важно, чтобы возобновить визуализацию сразу после добавления стимула, так как некоторые нейроны показывают быстрое и максимальный ответ в течение 4 секунд стимуляции. В качестве альтернативы, непрерывный временной ряд может быть начато до добавления раствора стимул, и точное значение момента времени, при котором стимул вводят могут быть отмечены.
деваха = "jove_content"> наблюдались два источника ложных положительных ответов. Во-первых, сам растворитель может вызывать флуоресцентные реакции даже в отсутствие лиганда. PBST растворитель вызвало такую реакцию у некоторых ppk23-Gal4 меченых клеток. Кроме того, ДМСО, обычно используемый растворитель для полярных и неполярных молекул, также индуцирует ответ в некоторых Gr68a-GAL4 меченных нейронов. Поэтому очень важно, чтобы определить, является ли индуцирует сам растворитель флуоресцентный сигнал и выбрать систему растворителей с низкой фоновой активностью. Во-вторых, сильный ответ фазическая типа в не нейрональных клеток поддержки наблюдалось в PBST только растворитель. Драйвер Gr68a-GAL4 экспрессируется в обоих нейронов и опорных клеток , которые появляются окружать некоторые из нейронов и в целом крупнее, аморфно формы, а также отсутствие видимых выступов. Поэтому важно , чтобы дифференцировать нервные от не-нейрональных ответов для каждой строки Gal4 при выборе трансформирования.
_content "> Одним из основных ограничений этого метода состоит в том, что тот же препарат муха не может быть использован для последующих экспериментов для тестирования различных концентраций или типы лигандов, если приложенное стимул сначала не полностью удалены с поверхности покровного стекла. Кроме того, этот метод не может быть использован для высокой пропускной способности обработки изображений нескольких мух сразу, в связи с большим увеличением , необходимой для визуализации дрозофилы нейронов, а также необходимость быстрого приема и высоким временным разрешением. и, наконец, этот метод требует наличия генетических инструментов для трансгенной экспрессии гена , тем самым ограничивая применение в первую очередь для крупных модельных организмов.В целом этот метод является более простой альтернативой сотовой записи с использованием электродов, и не требует специальных приборов. Кроме того, в отличие от других генетически кодируемых репортеров, таких как CaLexA, животное сохраняется живым на протяжении обработки изображений, позволяя физиологические реакции, которые будут измерены в реаль-времени с высокой чувствительностью в мух всех возрастов. Эта функция может потенциально позволить для скрининга возрастных ответов лигандов или сравнения нейронных реакций следующие изменения в социальных условиях или репродуктивного состояния. Кроме того, устойчивые записи могут быть выполнены в течение по крайней мере 10 мин без явного фотообесцвечивания или изношенном сигнала GCaMP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gr68a-Gal4 | Gift from H. Amrein (Texas A&M Health Science Center, TX, USA) and J. Carlson (Yale University, CT, USA) | ||
| ppk23-Gal4 | Gift from K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA) | ||
| UAS-GCaMP5 | 42037 | Bloomington Drosophila Stock Center | |
| 0.17 mm coverslip (Gold-Seal coverslip) | Electron Microscopy Services | 63790-10 | |
| Nail polish, "Hard as Nails Clear" | Sally Hansen | ||
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Paint brush | fine-tipped brush | ||
| Tape | Scotch brand | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 13021 | |
| Ethanol, lab grade | Merck | 10094 | |
| Hexane, HPLC grade | Sigma-Aldrich | H303SK-4 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| PBST | Recipe described in the protocol section | ||
| CH503 | Synthesis described in Mori et al., 2010 | ||
| sCMOS Camera (ORCA Flash4.0) | Hamamatsu | C11578-22U | |
| Microscope (Ti-Eclipse) | Nikon | Ni-E | |
| Spinning Disk Scan head | Yokogawa | CSU-X1-A1 | |
| Aquistion Software (MetaMorph Premier) | Molecular Devices | 40002 | |
| Fiji software | open source | http://fiji.sc/Fiji |
References
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R.
- Dunipace, L., Meister, S., McNealy, C., Amrein, H. Spatially restricted expression of candidate taste receptors in the Drosophila gustatory system. Curr. Biol. 11, 822-835 (2001).
- Thistle, R., Cameron, P., Ghorayshi, A., Dennison, L., Scott, K. Contact chemoreceptors mediate male-male repulsion and male-female attraction during Drosophila courtship. Cell. 149, 1140-1151 (2012).
- Toda, H., Zhao, X., Dickson, B. J. The Drosophila female aphrodisiac pheromone activates ppk23(+) sensory neurons to elicit male courtship behavior. Cell Rep. 1, 599-607 (2012).
- Vijayan, V., Thistle, R., Liu, T., Starostina, E., Pikielny, C. W. Drosophila pheromone-sensing neurons expressing the ppk25 ion channel subunit stimulate male courtship and female receptivity. PLoS Genet. 10, 1004238 (2014).
- Lu, B., LaMora, A., Sun, Y., Welsh, M. J., Ben-Shahar, Y. ppk23-Dependent chemosensory functions contribute to courtship behavior in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 8, e1002587 (2012).
- Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a Clade of Ionotropic Receptors Are Candidate Taste and Pheromone Receptors. Neuron. 83, 850-865 (2014).
- Montell, C. A taste of the Drosophila gustatory receptors. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 345-353 (2009).
- Shanbhag, S. R., Park, S. K., Pikielny, C. W., Steinbrecht, R. A. Gustatory organs of Drosophila melanogaster: fine structure and expression of the putative odorant-binding protein PBPRP2. Cell Tissue Res. 304, 423-437 (2001).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. J. Neurobiol. 56, 139-152 (2003).
- Rodrigues, V., Siddiqi, O. A gustatory mutant of Drosophila defective in pyranose receptors. Mol. Genet. Genomics. 181, 406-408 (1981).
- Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. J. Neurobiol. 61, 333-342 (2004).
- Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of Drosophila. J. Neurosci. 34, 7148-7164 (2014).
- Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. J. Vis. Exp. , e51355 (2014).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Lansky, P., Rospars, J. P. Estimation of the individual firing frequencies of two neurons recorded with a single electrode. Chem. Senses. 28, 671-679 (2003).
- Masuyama, K., Zhang, Y., Rao, Y., Wang, J. W. Mapping neural circuits with activity-dependent nuclear import of a transcription factor. J. Neurogenet. 26, 89-102 (2012).
- Akerboom, J., et al. Crystal structures of the GCaMP calcium sensor reveal the mechanism of fluorescence signal change and aid rational design. J. Biol. Chem. 284, 6455-6464 (2009).
- Miyamoto, T., Chen, Y., Slone, J., Amrein, H. Identification of a Drosophila glucose receptor using Ca2+ imaging of single chemosensory neurons. PloS One. 8, e56304 (2013).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
- Shikichi, Y., et al. Pheromone synthesis. Part 250: Determination of the stereostructure of CH503 a sex pheromone of male Drosophila melanogaster, as (3R,11Z,19Z)-3-acetoxy-11,19-octacosadien-1-ol by synthesis and chromatographic analysis of its eight isomers. Tetrahedron. 68, 3750-3760 (2012).
- Yew, J. Y., et al. A new male sex pheromone and novel cuticular cues for chemical communication in Drosophila. Curr. Biol. 19, 1245-1254 (2009).
- Bray, S., Amrein, H. A putative Drosophila pheromone receptor expressed in male-specific taste neurons is required for efficient courtship. Neuron. 39, 1019-1029 (2003).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Kaissling, K. E., Zack Strausfeld, C., Rumbo, E. R. Adaptation processes in insect olfactory receptors. Mechanisms and behavioral significance. Ann. N. Y. Acad. Sci. 510, 104-112 (1987).
- Marder, E., Bucher, D. Central pattern generators and the control of rhythmic movements. Curr. Biol. 11, 986-996 (2001).
- Koepsell, K., Wang, X., Hirsch, J. A., Sommer, F. T. Exploring the function of neural oscillations in early sensory systems. Front Neurosci. 4, 53 (2010).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
- Busch, K. E., et al. Tonic signaling from O(2) sensors sets neural circuit activity and behavioral state. Nat Neurosci. 15, 581-591 (2012).
