Abstract
A differenza dei mammiferi, insetti come Drosophila hanno più organi del gusto. I neuroni chemosensoriali sulle gambe, proboscide, ali e ovipositor di Drosophila esprimono recettori gustativi 1,2, canali ionici 3-6, e recettori ionotropici 7 che sono coinvolti nella rilevazione di segnali sensoriali volatili e non volatili. Questi neuroni contattare direttamente tastants come il cibo, sostanze e feromoni influenzano nocivi e quindi molti comportamenti complessi come l'alimentazione, la deposizione delle uova e l'accoppiamento. registrazioni elettrodi e l'imaging di calcio sono stati ampiamente utilizzati negli insetti per quantificare le risposte neuronali evocati da queste sostanze sapide. Tuttavia, elettrofisiologia richiede attrezzature specializzate e le misurazioni ottenere da un singolo sensillum gusto può essere tecnicamente impegnativo a seconda della cellula-tipo, le dimensioni e la posizione. Inoltre, la risoluzione neurone singolo in Drosophila può essere difficile da realizzare, poiché il gusto sensilla House più di un tipo di chemosensory neurone. Il metodo di imaging di calcio in diretta qui descritta permette risposte dei singoli neuroni gustative in mosche in tensione da misurare. Questo metodo è particolarmente adatto per l'imaging risposte neuronali a feromoni lipidici e altri tipi di ligandi che hanno una bassa solubilità in solventi a base acquosa.
Introduction
Gli animali si basano su informazioni olfattive e gustative di mediare decisioni essenziali per la sopravvivenza e la riproduzione. Capire come spunti chemosensory vengono rilevati ed elaborati dal sistema nervoso richiede l'identificazione del recettore sensoriale (s) e le corrispondenti leganti chimici. Drosophila rilevare una varietà impressionante di composti volatili e non volatili e sono un modello eccellente in cui studiare il fisiologico meccanismi sottostanti chemosensation. Mentre gli organi olfattivi percepiscono molecole volatili, gli organi gustativi sono specializzati per rilevare i composti a bassa volatilità. Qui, vi presentiamo un metodo per misurare direttamente le risposte neuronali dagli organi del gusto di Drosophila melanogaster a bassa volatilità, ligandi lipofile.
organi gustativi della mosca sono le zampe anteriori, proboscide, e le ali. Distribuita sulla superficie degli organi gustative sono strutture simili a capelli noti come sensilla che rispondono al sugars, amari, sali, acqua e feromoni 8. Il sensilla sono stati classificati morfologicamente in setole di gusto e sapore pioli 9. Ci sono circa 31 setole gusto sul labello che sono classificati in lungo (tipo L), breve (s-type) e morfologie (I-tipo) intermedi. Casa sensilla 4 neuroni sensoriali 'L' e 'S' che rispondono fisiologicamente allo zucchero (la cella S), basso contenuto di sale (la cella L1), di sale e composti amari (la cella L2) e l'acqua (la cellula W) 10 , 11. La 'i' Casa 2 neuroni sensoriali sensilli, di cui uno risponde sia a basso contenuto di sale e zucchero, mentre l'altro risponde ad alto sale 12. Ci sono circa 41 gusto sensilli nei maschi e 26 femmine sensilla in distribuite su ciascuno degli arti anteriori. Per entrambi i maschi e femmine, ci sono 21 sensilla sul midleg, e circa il 22 sensilla sul hindleg 13. I neuroni gustative racchiuse dalla sensilla gusto sulle gambe sono anche classified in tipi L1, L2, W e S.
Un metodo standard per misurare l'attività elettrica da singoli neuroni utilizza elettrodi extracellulari o intracellulari per registrare il flusso di ioni. Misure elettrodi permettono la funzione neuronale di essere studiato in organismi non modello, come specie Drosophila, falene, api e che mancano ampi strumenti genetici per l'etichettatura neurale. Tuttavia, mentre i metodi elettrofisiologici sono stati utilizzati di routine per misurare l'attività di Drosophila gusto sensilli 4,13,14, l'applicazione di questo approccio presenta diverse sfide tecniche. In primo luogo, il gusto setole devono essere identificati sulla base di morfologia e posizione spaziale. Dopo l'identificazione, misurazioni elettrofisiologiche possono essere ostacolate dalle piccole dimensioni del sensilli, accessibilità limitata a causa della posizione, e difficoltà nell'applicare volumi controllati di uno stimolo chimico per un gusto setola. Inoltre, la stimolazione di sensilli può generare segnali da più di untipo neuronale 15. In secondo luogo, l'individuazione di segnali elettrici può essere confuso con il rumore di fondo derivanti da vibrazioni meccaniche e rumori provenienti da apparecchiature elettroniche. In terzo luogo, l'uso di un elettrodo affilata può danneggiare la preparazione mosca, se usato in modo errato 14. Infine, montaggio di un impianto di perforazione elettrofisiologia richiede componenti elettronici specializzati per la consegna stimolo, la registrazione del segnale e analisi dei dati e può essere costoso.
In D. melanogaster, la disponibilità di strumenti geneticamente codificati ha facilitato lo sviluppo di tecniche di imaging che consentono le risposte di piccole popolazioni di neuroni da studiare. Un tale approccio è l'uso del reporter CaLexA 16. In questo metodo, sequenze di geni codificanti il fattore di trascrizione LexA-VP16 e NFAT proteina sensibile calcio sono fusi insieme. Attivazione di calcio della calcineurina proteina fosfatasi catalizza la de-fosforilazione di NFAT e, a sua volta, facilitaTES sua importazione nel nucleo. All'interno del nucleo, il dominio LexA lega a un motivo di legame LexAop-DNA che dirige l'espressione di una verde giornalista proteina fluorescente (GFP), permettendo così l'identificazione sostenuta di neuroni funzionalmente attivati. L'approccio è stato utilizzato con successo per misurare la risposta della specifica glomeruli olfattivi nel lobo antenne in seguito all'esposizione di mosche dal vivo ad un odorizzante 16. Recentemente, le risposte fisiologiche di IR52c neuroni recettori gustativi sono stati misurati dalle mosche dal vivo utilizzando CaLexA 7. Tuttavia, per questo studio, è stato necessario mosche di età fino a 6 settimane per migliorare la trascrizione GFP. Mentre immunocolorazione con un anticorpo anti-GFP può essere utilizzato per amplificare il segnale CaLexA, questo metodo richiederebbe fissaggio del tessuto, precludendo così la possibilità per l'imaging live-cell.
Il GCaMP indicatore di proteine calcio geneticamente codificato è anche stato ampiamente utilizzato per studiare le risposte neuronali in diversiSpecie 17. Il GCaMP proteina fluorescente con bassa intensità prima di stimolazione neuronale. L'applicazione di uno stimolo innesca un potenziale d'azione nel neurone, conseguente afflusso di Ca 2+. GCaMP, legato a Ca 2+, subisce un cambiamento conformazionale, provocando la fluorescenza con intensità luminosa (Figura 1). Un approccio di imaging del calcio singolo neurone sviluppato di recente è stato utilizzato per identificare il glucosio come legante per gli specifici neuroni gustative Gr61a zampa anteriore 18. In questo studio, gli arti anteriori sezionati da transgenici Drosophila che esprimono GCaMP nei neuroni gustative Gr61a erano coperti da uno strato di agarosio prima di imaging. Tuttavia, l'uso di tessuto sezionato può causare eventuale carrellata di espressione GCaMP, limitando così il tempo di misura e la sensibilità di rilevazione. Inoltre, agarosio può limitare la sensibilità a causa di alti livelli di fondo di fluorescenza e le sue proprietà di diffusione della luce.
To affrontare alcuni di questi inconvenienti, si descrive l'utilizzo di immagini di calcio GCaMP-mediata per registrare le risposte fisiologiche di zampa anteriore e proboscide neuroni gustative di animali intatti. Noi mostriamo le risposte fisiologiche di Gr68a e neuroni che esprimono ppk23 geneticamente codificato GCaMP5G 19 per un lipide feromone Drosophila, (3 R, 11 Z, Z 19) -3-acetossi-11,19-octacosadien-1-olo (CH503) 20, 21. risposte neuronali sono misurati quantificando l'aumento della fluorescenza del segnale GCaMP5G durante la stimolazione feromone. In questo protocollo, i neuroni vengono esposte per una durata totale di 120 secondi, che è sufficiente a differenziare pattern di attivazione neuronale in singole cellule.
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Protocol
Preparazione 1. Esempio
- Attraversare la linea GAL4 3,22 conducente di UAS-GCaMP5G 19 mosche (w 1118; P {20XUAS-IVS-GCaMP5G} attP40). Lasciare che la croce di crescere a 25 ° C.
Nota: Generazione vola con più copie dei transgeni GAL4 o UAS-GCaMP può aiutare a migliorare l'intensità del segnale fluorescente. Una versione precedente del transgene UAS-GCaMP (UAS-GCaMP3) ha mostrato intensità di fluorescenza molto debole quando espresso sotto il controllo del pilota Gr68a-GAL4.- Raccogliere e separati per sesso nuova eclosed mosche adulte ed aumentare a 25 ° C.
Nota: il livello di base di GCaMP5G fluorescenza è ottimale in mosche di età compresa tra 14-28 giorni. Isolando le mosche per sesso preclude la possibilità di interazioni sociali che possono influenzare le risposte neurali.
- Raccogliere e separati per sesso nuova eclosed mosche adulte ed aumentare a 25 ° C.
- Anestetizzare una mosca sotto un flusso delicato di CO 2.
- Fissare la Fmente ad un vetrino di vetro in primo luogo mettendo una piccola goccia di smalto al centro di un vetrino 0,17 millimetri. Delicatamente posizionare una mosca su un fianco sulla goccia di smalto trasparente e garantire che l'intera goccia è coperto dalla mosca.
- Eseguire i punti 1.5 e 1.6 sotto uno stereomicroscopio dissezione, utilizzato a 8X ingrandimento.
- Utilizzare un pennello bagnato per estendere una zampa anteriore della mosca. Fissare la zampa anteriore in posizione posizionando due sottili strisce di nastro sopra primo e quinto segmenti tarso (Figura 2A). Questo esporrà segmenti tarsali T2-T4 per l'imaging (Figura 2B).
- Per neuroni immagine sulla proboscide, posizionare una sottile striscia di nastro adesivo sopra la tribuna della proboscide per esporre il labello (Figura 2C, D).
- Disegnare una barriera idrofobica intorno al volo con una penna PAP per evitare che la soluzione di fluire sulla superficie coprioggetto. Effettuare misure entro 30 minuti di montaggio.
2. Preparazione di stimoloSoluzione
- Diluire ligandi lipofile (come CH503, utilizzato in questo studio) in una soluzione PBST: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4, 0,1% Triton X-100 (v / v ); pH 7.4.
- Fare un 1 mg / ml soluzione madre del legante con PBST. Preparare tutte le diluizioni successive della soluzione madre con PBST.
Nota: A seconda della solubilità del ligando di interesse, solventi diversi possono essere necessari per sciogliere il ligando. La solubilità di CH503 in vari solventi sono descritte nella Tabella 1. A differenza di altri solventi, PBST non ha prodotto un aumento della fluorescenza.
- Fare un 1 mg / ml soluzione madre del legante con PBST. Preparare tutte le diluizioni successive della soluzione madre con PBST.
3. Stimolazione della Gustativo neuroni e Image Acquisition
- Utilizzando una pipetta 10 ml, versare 10 ml di PBST sui segmenti del tarso.
Nota: Questo passaggio inumidisce la gamba ed evita i segmenti del tarso da deriva. - Utilizzare un sistema ottico che ha una fotocamera suvelocità sere sufficienti e la sensibilità per ottenere un buon segnale di fluorescenza ad alta risoluzione temporale.
Nota: Per questo studio abbiamo utilizzato un microscopio confocale disco rotante e una fotocamera sCMOS (vedi Lista dei materiali). - Scegliere il segmento tarsale specifico e neuroni di essere ripreso. Acquisire tre pre-stimolazione confocale Z-stack.
- Idealmente, le impostazioni di acquisizione uso che sono abbastanza veloce per consentire la risoluzione tempo massimo, mentre ancora catturare l'intero volume delle cellule. Impostazioni di acquisizione esempio sono: 200 msec esposizione, binning 2 x 2 e 6 x 0,5 micron 2 sezioni ottiche, catturate ogni 2 secondi.
Nota: le gambe sono stati immobilizzati ripreso con successo per un massimo di 10 minuti, a intervalli di 30 secondi, con nessun imbianchimento discernibile del segnale GCaMP. Per i tempi di registrazione più lunghi, in modo che le gambe sono tenute molto saldamente in posizione sul vetrino. - Ottimizzare la potenza del laser per la massima segnale-rumore ottenibile con il minimo photobleaching durante l'intero imaging regime. Per gli esperimenti descritti qui, utilizzare un 491 nm diodo laser (100 mW) al cambio del 30% per l'imaging sia i neuroni Gr68a e ppk23 gustative sulle gambe e proboscide. Utilizzare 2 x 2 binning per consentire tempi di esposizione più brevi, pur ottenendo una risoluzione spaziale sufficiente.
Nota: Le impostazioni di potenza laser sono stati ottimizzati per consentire il rilevamento di cambiamento fluorescente che vanno da un aumento 1.2- a 4,5 volte.
- Idealmente, le impostazioni di acquisizione uso che sono abbastanza veloce per consentire la risoluzione tempo massimo, mentre ancora catturare l'intero volume delle cellule. Impostazioni di acquisizione esempio sono: 200 msec esposizione, binning 2 x 2 e 6 x 0,5 micron 2 sezioni ottiche, catturate ogni 2 secondi.
- Pipettare 10 ml di soluzione di stimolo sul segmenti del tarso. Per gli esperimenti di controllo, aggiungere altri 10 ml di PBST. acquisire subito 117 immagini post-stimolazione.
Nota: Il numero di immagini post-stimolazione acquisiti si basa sulla quantità di tempo in cui si è raggiunto variazione massima della fluorescenza (circa 2 min).- PUNTO CRITICO: Mentre pipettando soluzione sulla preparazione, non toccare il volo con la punta della pipetta dal momento che questo farà sì che la zampa anteriore per spostare fuori posizione.
Nota: In alternativa, utilizzareun micromanipolatore per posizionare con precisione un capillare di vetro contenente stimolo vicino al segmento tarsale da acquisire. Fornire volumi controllati di stimolo utilizzando un distributore microiniezione intracellulare secondo le istruzioni del produttore.
- PUNTO CRITICO: Mentre pipettando soluzione sulla preparazione, non toccare il volo con la punta della pipetta dal momento che questo farà sì che la zampa anteriore per spostare fuori posizione.
4. Image Processing and Analysis: quantificazione della risposta
- Aprire una serie di confocale Z-stack con Fiji ( http://fiji.sc/Fiji ) 23 o ImageJ ( http://imagej.nih.gov/ij/ software) analisi ed elaborazione di immagini 24.
- Effettuare una proiezione somma intensità di tutti i sei fette Z per ciascuno dei 120 punti temporali.
- Selezionare l'opzione "stack" sotto "Immagine". Inoltre, selezionare l'opzione "proiezione Z" e inserire "1" come la fetta di inizio e "4" come fetta di arresto. Per il tipo di proiezione, selezionare R20; fette somma "dal menu a tendina e selezionare" Tutte le strutture di tempo ".
- Definire la regione di interesse (ROI) utilizzando lo strumento di selezione a mano libera per disegnare un confine intorno a un corpo cellulare o una proiezione neuronale. Fare clic sull'etichetta "Analizza" e selezionare l'opzione "ROI manager" sotto "Strumenti".
- Quantificare la fluorescenza della ROI selezionando l'opzione "Set misurazioni", sotto il menu "Analizza" e selezionando le caselle per la densità integrata, zona, media e massima valore di grigio e l'etichetta. Quindi, selezionare l'opzione "Altro" sotto il menu Gestione ROI e selezionare ulteriormente l'opzione "Multi misura".
Nota: Questo genererà una scatola a finestra con valori per ciascuno dei parametri selezionati. - Controllare i valori massimi di grigio per assicurare che nessuno dei pixel hanno raggiunto la saturazione (ad esempio, 65.535 per una camera 16-bit).
NOTA: Per gli esperimenti mostrato in tsuoi carta, le risposte sono state misurate sia da corpi cellulari neuronali o sporgenze, a seconda di dove è stato osservato l'aumento massimo della Af / F. - Calcolare la variazione relativa massima della fluorescenza (Af / F) al punto di tempo t è il seguente:
- Sottrarre sfondo di fluorescenza da ogni valore F (cella). Per quantificare fluorescenza di fondo, misurare la densità integrata di una ROI di forma e dimensioni equivalenti da un'area dell'arto anteriore (o proboscide) privo di neuroni rilevabili.
- Per quantificare la post-stimolazione di fluorescenza, F (cella) t, misurare la densità integrata della ROI del corpo cellulare o di processo nel tempo punto "t" dopo la stimolazione.
- Per quantificare la fluorescenza pre-stimolazione, F (cella) t = 0, analizzare immagini pre-stimolo del corpo cellulare o il processo nello stesso modo comeil segnale post-stimolazione. Utilizzare la densità media integrato di 3 immagini per determinare F (cella) t = 0.
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Representative Results
L'indicatore di calcio GCaMP è stata geneticamente espressa utilizzando i driver ppk23-GAL4 Gr68a-GAL4 o. Distinte popolazioni di neuroni e cellule zampa anteriore di supporto non-neurali sono etichettati da ogni driver (Figura 3A-C). Risposte specifiche-ligando al CH503 feromone lipofila sono stati osservati in Gr68a-GAL4 e le cellule ppk23-GAL4 espressione GCaMP (Figura 3D). La variazione relativa di intensità di fluorescenza del segnale GCaMP5G (Af / F) e aumenta con concentrazioni più elevate di CH503 (Figura 3E). È interessante notare che la dose di 5 ng di CH503 può sopprimere la risposta neurale.
Gr68a e neuroni ppk23 esposti diversi modelli di risposta. Neuroni Gr68a hanno mostrato un andamento tonico di risposta neuronale (Figura 3F), mentre ppk23 i neuroni hanno mostrato una fasica, risposta oscillatoria (Figura 3G). Le risposte dei neuroni ppk23 nelle proboscide erano unLSO misurata usando questa preparazione e mostrava una combinazione di fasiche e oscillatori risposte (Figura 3H).
Figura 1:. Principio fondamentale della tecnica di imaging del calcio GCaMP GCaMP5G è geneticamente espresso in GAL4 -labeled cellule e reagisce con bassa intensità prima di stimolazione neuronale. L'applicazione di uno stimolo innesca un potenziale d'azione nel neurone e provoca Ca 2+ afflusso. GCaMP5G, una volta legato al Ca 2+, subisce un cambiamento conformazionale, con conseguente aumento della fluorescenza (Af), che cambia nel tempo. La fluorescenza basale (F) si riferisce alla intensità del segnale fluorescente prima stimolazione.
Figura 2: Montaggio una mosca dal vivo per l'imaging dei neuroni zampa anteriore o proboscide.(A) Montaggio del zampa anteriore: un'immagine 3,2X di un moscerino maschio dal vivo, mostrando le zampe anteriori fissati al vetrino con nastro adesivo. (B) immagine A 40X della mosca, mostrando ciascuno dei segmenti del tarso (T1-5) e il posizionamento del nastro sopra il primo segmento tarsica e sui segmenti tarso quinto. (C) Montaggio proboscide: un pezzo di nastro è posto sopra la tribuna per esporre la punta della proboscide. (D) La punta della pipetta per aggiunta stimolo è tenuta leggermente sopra al volo e non fa contatto diretto con la preparazione.
Figura 3:. Feromoni indotta risposte neurali in neuroni GCaMP-esprimono (A) Schema della zampa anteriore maschio della Drosophila che mostra le posizioni spaziali di Gr68a-GAL4 etichettato cellule sui segmenti tarsali T2-4. cellule non neuronali (individuati in base alle dimensioni e forma) sono colored giallo. (B) immagine Raw fluorescente della zampa anteriore maschio che mostra le cellule neurali e di supporto etichettati da parte del conducente Gr68a-GAL4. Barra di scala = 50 micron. (C) Schema della zampa anteriore maschio della Drosophila che mostra le posizioni spaziali di ppk23-GAL4 etichettato cellule sui segmenti tarsali T2-4. (D) Risposta di Gr68a- e neuroni T4 ppk23 esprimono a CH503 (struttura chimica mostrato sopra). La Af medio / F in risposta a CH503 è stata confrontata con la media Af / F dopo l'applicazione di PBST solo solvente; test t di varianza disuguale (per Gr68a) o il test di Mann-Whitney (per ppk23): * p <0.05, *** p <0.001. Le barre di errore rappresentano la potenza statistica sem = 0.93. (E) Un cambiamento dose-dipendente in Δ F / F è osservata nei neuroni Gr68a in T4. test t di varianza diseguale: ** p <0.01, *** p <0.001. potenza statistica = 0,86-0,96. (F (G) un corso a tempo con codifica a colori che mostra un oscillatorio, risposta fasica in GCaMP fluorescenza dopo stimolazione CH503 (500 ng) di neuroni ppk23 esprimono. Le posizioni dei neuroni sulla zampa anteriore sono mostrati nell'immagine fluorescenti prima (a sinistra). barra della scala: 10 micron; scala di tempo: 0-96 sec. Il grafico a linee di accompagnamento mostra una risposta scoppio da un neurone ppk23 alla stimolazione da 500 ng di CH503. freccia rossa indica l'ora in cui è stato aggiunto lo stimolo. Il picco di RESPONSE avviene a 76 sec. (H) un corso a tempo color-coded di neuroni che esprimono ppk23 sui proboscide che mostrano una risposta tonico esordio tardivo dal corpo cellulare e una risposta oscillatoria da una proiezione assonale dopo stimolazione CH503 (500 ng). Le posizioni delle celle sono mostrati nell'immagine fluorescenti prima (a sinistra). Barra di scala = 10 micron; scala di tempo: 0-96 sec. Riprodotto con il permesso di Shankar, S., et al. Il tachichinine neuropeptide è essenziale per il rilevamento feromone in un circuito neurale gustativa. doi:. 10,7554 / eLife.06914 (2015) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| 1,2 solvente | Solubilità di CH 5 0 3 3 | Fa il solo solvente grilletto attività neuronale? 4 |
| 0,1% PBST | SÌ | NO |
| 100% di etanolo | SÌ | SÌ |
| 100% esano | SÌ | SÌ |
| 10% etanolo | NO | (non testato) |
| 10% esano | NO | (non testato) |
| 100% DMSO | SÌ | SÌ |
| 10% DMSO | SÌ | SÌ |
| 0,4% DMSO | SÌ | SÌ |
| 0,2% DMSO | SÌ | SÌ |
Tabella 1:. Solubilità di CH 5 0 3 in vari solventi 1 DMSO:. Dimetilsolfossido 2 etanolo, esano e soluzioni DMSO sono stati in diluiti con dH 2 O (v / v) 3 Solubilità di CH503 a 0,2% DMSO è stato limitato. solo a 250 ng / ml. 4 Aumento Af / F con solo solvente era equivalente a quella osserved dopo stimolazione con feromone.
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Discussion
Descriviamo qui un metodo per eseguire l'imaging del calcio live di Drosophila neuroni periferici in 2 diversi organi sensoriali. Il Ca 2+ -evoked risposte fluorescenti GCaMP in Gr68a-neuroni indotte dal ligando feromone CH503 erano dose-dipendente e quantitativa. E 'stato anche possibile distinguere diversi modelli di risposta neurale come la fasica e le risposte tonico.
I neuroni che mostrano le risposte fasiche si ritiene di consentire un rapido adattamento agli stimoli continui. Questo tipo di risposta è stata associata con rilevamento dell'odore 25 e la generazione del motore ritmico modelli di attività 26. Al contrario, onde cerebrali, che sono stati descritti in molti sistemi sensoriali, sono pensati per sincronizzare ingressi multipli su un singolo sito postsinaptica e di trasmettere le caratteristiche specifiche circa lo stimolo 27. La base molecolare delle oscillazioni associati neuroni ppk23 non è ancora stato segnalato, al nostro knowledge. In altri tipi di cellule eccitabili mostrano risposte oscillatorie, ha dimostrato di essere regolata da un processo chiamato rilascio di calcio di calcio indotta 28 la frequenza delle oscillazioni. In questo processo, il calcio viene rilasciato dai depositi interni sotto il controllo del secondario trifosfato messenger inositolo, e la frequenza della sua uscita dipende dalla forza dello stimolo esterno. Uno sguardo le basi molecolari delle risposte neuronali toniche sono stati ottenuti da studi sui recettori di rilevamento dell'ossigeno di C. elegans 29. Un aumento prolungato dei livelli di calcio all'interno dei neuroni è risultata essere mediata da canali di tensione L-tipo gated calcio, ryanodine e vie di segnalazione inositolo trifosfato 29. Sarà importante accertare se meccanismi simili hanno un ruolo nelle risposte dei neuroni ppk23.
Imaging diretta calcio può essere adattato in vari modi per lo studio di altre popolazioni di
Diversi conside tecnicorazioni sono indispensabili per ottenere immagini stabili e di misurare con precisione l'andamento nel tempo delle risposte fisiologiche. Innanzitutto, la zampa anteriore deve essere posizionata in modo sicuro poiché la mosca presenta vigoroso movimento dopo l'aggiunta della soluzione, che può essere una fonte di variazione tra preparazioni. Sebbene applicazione bagno di soluzione feromone permette il ligando di raggiungere tutti i sensilli gustativa sui segmenti tarso esposti, parte della soluzione può fluire verso altre parti della preparazione montato. Inoltre, la zampa anteriore potrebbe potenzialmente allontanarsi quando viene aggiunto soluzione. In secondo luogo, con precisione l'immagine quasi istantanee aumento nella fluorescenza, è importante riprendere immediatamente immagini dopo l'aggiunta dello stimolo poiché alcuni neuroni mostrano una risposta rapida e massima entro 4 secondi di stimolazione. In alternativa, una serie temporale continuo può essere iniziata prima di aggiungere la soluzione di stimolo, e il punto di tempo preciso in cui lo stimolo viene somministrato può essere marcato.
lass = "jove_content"> sono stati osservati due fonti di risposte falsi positivi. Innanzitutto, il solvente stesso può indurre risposte fluorescenti anche in assenza di un ligando. Il solvente PBST causato una tale risposta in alcune cellule ppk23-GAL4 etichettati. Inoltre, DMSO, un solvente comunemente usato per le molecole polari e apolari, indotto anche una risposta in alcuni neuroni Gr68a-GAL4 etichettati. E 'quindi essenziale per determinare se il solvente stesso induce un segnale fluorescente e per selezionare un sistema solvente con bassa attività di sfondo. In secondo luogo, una forte risposta fasica-type in cellule di supporto non-neuronali è stata osservata al PBST solo solvente. Il driver Gr68a-GAL4 è espresso in entrambi neuroni e cellule di supporto che sembrano circondare alcuni dei neuroni e, in generale, sono più grandi, a forma amorfo, e la mancanza di proiezioni visibili. È quindi importante differenziare neurale dalle risposte non neuronali per ciascuna linea GAL4 nella scelta ROI.
_content "> Una limitazione importante di questo metodo è che la stessa preparazione mosca non può essere utilizzato per esperimenti successivi per testare concentrazioni differenti o tipi di ligandi, a meno che lo stimolo applicato viene dapprima accuratamente rimosso dalla superficie del vetrino. Inoltre, questo metodo non può essere utilizzata per l'imaging high throughput di molte mosche contemporaneamente, a causa della forte ingrandimento necessaria per la visualizzazione dei neuroni Drosophila, e la necessità di aquisizione e risoluzione temporale. Infine, questo metodo richiede la disponibilità di strumenti genetici per l'espressione genica transgenica , limitando così l'applicazione in primo luogo ai principali organismi modello.Complessivamente, questo metodo è un'alternativa più facile registrazioni cellulari utilizzando elettrodi e non richiede strumentazione specializzata. Inoltre, a differenza di altri reporter geneticamente codificati come CaLexA, l'animale viene mantenuto vivo tutto l'imaging consentendo risposte fisiologiche da misurare in reAl tempo ad alta sensibilità in mosche di tutte le età. Questa caratteristica potrebbe potenzialmente consentire la proiezione di risposte età-dipendente a ligandi o confronto delle risposte neurali seguenti cambiamenti nelle condizioni sociali o lo stato riproduttivo. Inoltre, le registrazioni sostenuti possono essere eseguite per almeno 10 minuti senza evidenti photobleaching o riduzione di attività di segnale GCaMP.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gr68a-Gal4 | Gift from H. Amrein (Texas A&M Health Science Center, TX, USA) and J. Carlson (Yale University, CT, USA) | ||
| ppk23-Gal4 | Gift from K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA) | ||
| UAS-GCaMP5 | 42037 | Bloomington Drosophila Stock Center | |
| 0.17 mm coverslip (Gold-Seal coverslip) | Electron Microscopy Services | 63790-10 | |
| Nail polish, "Hard as Nails Clear" | Sally Hansen | ||
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Paint brush | fine-tipped brush | ||
| Tape | Scotch brand | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 13021 | |
| Ethanol, lab grade | Merck | 10094 | |
| Hexane, HPLC grade | Sigma-Aldrich | H303SK-4 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| PBST | Recipe described in the protocol section | ||
| CH503 | Synthesis described in Mori et al., 2010 | ||
| sCMOS Camera (ORCA Flash4.0) | Hamamatsu | C11578-22U | |
| Microscope (Ti-Eclipse) | Nikon | Ni-E | |
| Spinning Disk Scan head | Yokogawa | CSU-X1-A1 | |
| Aquistion Software (MetaMorph Premier) | Molecular Devices | 40002 | |
| Fiji software | open source | http://fiji.sc/Fiji |
References
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