Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

מדידת תגובות פיזיולוגיות של Published: April 29, 2016 doi: 10.3791/53392
Automatic Translation
1,2, 3,4, 1,2,5
1Temasek Life Sciences Laboratory, 2Department of Biological Science, National University of Singapore, 3Bioimaging and Biocomputing Facility, Temasek Life Sciences Laboratory, 4Histology and Light Microscopy Core, Gladstone Institutes, 5Pacific Biosciences Research Center, University of Hawai'i at Mānoa

Abstract

בניגוד ליונקים, חרקים כגון תסיסנית יש איברי טעם מרובים. הנוירונים chemosensory על הרגליים, חוטם, כנפיים צינור ההטלה של תסיסנית לבטא קולטנים gustatory 1,2, תעלות יונים 3-6, ו ionotropic קולטנים 7 כי מעורבים זיהוי של אותות חושיים תנודתי בלתי נדיף. נוירונים אלה קשר ישיר עם tastants כגון מזון, חומרים רעילים פרומונים ולכן להשפיע התנהגויות מורכבות רבות כגון האכלה, הטלה והזדווגות. קלטות אלקטרודה והדמית סידן כבר בשימוש נרחב חרקים לכמת את התגובות העצביות עוררו על ידי tastants אלה. עם זאת, אלקטרופיזיולוגיה דורש ציוד מיוחד ומדידות קבלה מתוך sensillum טעם יחיד יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית כתלות בתא-הסוג, הגודל, ואת המיקום. בנוסף, ברזולוציה נוירון בודד תסיסנית יכול להיות קשה להשיג מאז טעם sensilla house יותר מסוג אחד של נוירון chemosensory. שיטת הדמית סידן לחיות המתוארת כאן מאפשרת תגובות של נוירונים gustatory היחידים בזבובים חיים כדי להימדד. שיטה זו מתאימה במיוחד עבור הדמית תגובות עצביות פרומונים שומנים וסוגים ליגנד אחרים שיש להם מסיסות נמוכה ממס על בסיס מים.

Introduction

בעלי חיים להסתמך על מידע חוש הריח gustatory לתווך החלטות חיוניות להישרדות ולרבייה. הבנה כיצד רמזי chemosensory מזוהים ועובד על מערכת העצבים דורשת זיהוי של קולטן החישה (S) ואת הליגנדים הכימיים המתאימים. תסיסנית לזהות מגוון מדהים של תרכובות נדיפות ו בלתי נדיף מהווה מודל מצוין בו כדי ללמוד את פיזיולוגיים מנגנוני chemosensation. בעוד איברי ההרחה תופסים מולקולות נדיפות, איברי gustatory מתמחים לזהות תרכובות תנודתיות נמוכות. כאן, אנו מציגים שיטה למדוד תגובות עצביות ישירות מאיברי הטעם של תסיסנית אל תנודתיות נמוכה, הליגנדים lipophilic.

איברי Gustatory של הזבוב כוללים את הרגליים הקדמיות, חוטם, וכנפיים. מבוזרת על פני השטח של אברי טעם הם מבנים דמויי שיער המכונה sensilla המגיבים sugars, ביטר, מלחים, מים פרומונים 8. Sensilla סווג מורפולוגית לתוך זיפי טעם וטעם יתדות 9. ישנם כ 31 זיפי טעם על השפית כי המסווגים (L-type) הארוך, קצר (s-type) ביניים (i-סוג) מורפולוגיות. עצב סנסורי 'l' ו 's' sensilla בית 4 מגיבים פיסיולוגיים לסוכר (תא S), מלח נמוך (תא L1), מלח גבוה ותרכובות מרירות (תא L2) ומים (תא W) 10 , 11. ה'אני 'עצב סנסורי בית 2 sensilla, שאחד מהם מגיב הן מלח נמוך וסוכר, בעוד מגיב אחרת מלח גבוה 12. ישנם כ 41 טעם sensilla בזכרים ו -26 sensilla אצל נקבות מופצות על כל אחד הרגליים הקדמיות. עבור גברים ונשים כאחד, יש 21 sensilla על midleg, וכ -22 sensilla על hindleg 13. הנוירונים gustatory מוקפים הטעם sensilla על הרגליים גם גlassified לתוך L1, L2, W ו- S סוגים.

שיטה סטנדרטית אחת למדידת פעילות חשמלית מתא עצב יחיד בעזרת אלקטרודות תאיות או תאי להקליט זרימת יונים. מדידות אלקטרודה לאפשר תפקוד עצבי להיחקר באורגניזמים שאינם מודל כגון מינים תסיסנית, עש, ודבורים אשר חסרים כלים גנטיים נרחבים עבור תיוג עצבי. עם זאת, בעוד שיטות אלקטרו שימשו באופן שגרתי כדי למדוד את פעילות מן הטעם תסיסנית sensilla 4,13,14, החלת גישה זו מציגה מספר אתגרים טכניים. ראשית, לטעום זיפים צריכים להיות מזוהים המבוססים על מורפולוגיה ומיקום מרחבים. עם זיהוי, מדידות אלקטרו יכולות להתעכב על ידי גודלו הקטן של sensilla, מוגבל נגישות בשל מיקום, וקושי ביישום כרכים מבוקרים של גירוי כימי טעם זיפים. כמו כן, גירוי של sensilla עלול ליצור אותות יותר מאחדסוג עצבי 15. שנית, זיהוי של אותות חשמליים ניתן בתוהו בשל רעשי רקע נובעות תנודות מכאניות ורעש מציוד אלקטרוני. שלישית, השימוש של אלקטרודה חידד יכול לפגוע בהכנת לטוס, אם משתמשים בו בצורה לא נכונה 14. לבסוף, הרכבת אסדת אלקטרופיזיולוגיה דורשת רכיבים אלקטרוניים מיוחדים למסירת גירוי, אות הקלטה, וניתוח נתונים ויכול להיות יקר.

ב ד melanogaster, הזמינות של כלי הגנטי בקידוד יש להקל את הפיתוח של טכניקות הדמיה המאפשרות התגובות של אוכלוסיות קטנות של נוירונים להיחקר. גישה אחת כזו היא שימוש כתב CaLexA 16. בשיטה זו, רצפים הגן המקודד את גורם שעתוק LexA-VP16 לבין NFAT חלבון רגיש סידן הם התמזגו יחד. הפעלת סידן של calcineurin phosphatase חלבון מזרז את זרחון-דה של NFAT, בתורו, facilitaTES היבוא שלה לתוך הגרעין. בתוך הגרעין, תחום LexA נקשר מוטיב מחייב LexAop-DNA המכוון את הביטוי של החלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) כתב, ובכך מאפשר זיהוי מתמשך של נוירונים מופעלים מבחינה תפקודית. הגישה נוצלה בהצלחה כדי למדוד את התגובה של glomeruli חוש ריח הספציפי באונת המחושים בעקבות חשיפת זבובים לחיות עד odorant 16. לאחרונה, התגובות הפיזיולוגיות של נוירונים קולטן gustatory IR52c נמדדו מפני זבובים חיים באמצעות CaLexA 7. עם זאת, במחקר זה, היה צורך זבובי גיל עד 6 שבועות כדי לשפר שעתוק GFP. בעוד immunostaining עם נוגדן אנטי GFP ניתן להשתמש כדי להגביר את האות CaLexA, שיטה זו תחייב קיבעון רקמות, ובכך נמנעה האפשרות אפשרות דימות תאים חיים.

GCaMP חלבון מחוון סידן המקודד גנטי כמו כן נעשה שימוש נרחב כדי ללמוד תגובות עצביות מספרמינים 17. החלבון GCaMP מאיר בעוצמה נמוכה לפני גירוי עצבי. יישום של גירוי מעורר פוטנציאל פעולה של נוירון, וכתוצאה מכך הזרם של Ca 2 +. GCaMP, חייב Ca 2 +, עובר שינוי קונפורמציה, גורם לו לזהור בעצמה בהירה (איור 1). גישת הדמיה שפותחה לאחרונה יחיד נוירון סידן שמשה לזיהוי גלוקוז ליגנד עבור נוירונים gustatory Gr61a הספציפיים הרגל הקדמי 18. במחקר זה, הרגליים הקדמיות גזור מן מהונדס תסיסנית להביע GCaMP בנוירונים gustatory Gr61a כוסו בשכבת agarose לפני הדמיה. עם זאת, השימוש ברקמה גזורה יכול לגרום מוזנח סופי ביטוי GCaMP, ובכך להגביל זמן מדידה רגיש זיהוי. בנוסף, agarose יכול להגביל רגישות בשל רמות רקע גבוהות של קרינה ומאפייני פיזור אור שלה.

To לטפל בכמה חסרונות אלה, אנו מתארים את השימוש של הדמיה סידן בתיווך GCaMP להקליט בתגובות הפיזיולוגיות רגל קדמית ו חוטם נוירונים gustatory של בבעלי חיים שלמים. אנו מציגים את התגובות הפיזיולוגיות של Gr68a ונוירונים ppk23 להביע מקודדים גנטית GCaMP5G 19 עד פרומון השומנים תסיסנית, (3 R, 11 Z, 19 Z) -3-acetoxy-11,19-octacosadien-1-ol (CH503) 20, 21. תגובות עצביות נמדדות על ידי כימותי גידול הקרינה של אות GCaMP5G במהלך גירוי פרומון. בפרוטוקול זה, נוירונים הם צילמו למשך כולל של 120 שניות, וזה מספיק כדי להבחין בדפוסי ההפעלה העצבית תאים בודדים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

לדוגמא הכנה 1.

  1. לחצות את קו הנהג 3,22 Gal4 כדי כטב"מ-GCaMP5G 19 זבובים (w 1118; P {20XUAS-IVS-GCaMP5G} attP40). לאפשר לצלב לגדול ב 25 מעלות צלזיוס.
    הערה: יצירת טס עם מספר עותקים של transgenes Gal4 או כטב"מ-GCaMP יכול לעזור כדי לשפר את עוצמת האות ניאון. גירסה קודמת של transgene כטב"מ-GCaMP (כטב"מ-GCaMP3) הראה עוצמת הקרינה חלשה מאוד כאשר הביע בשליטת הנהג Gr68a-Gal4.
    1. איסוף נפרד על ידי זבובים בוגרים eclosed החדש סקס ולהעלות על 25 מעלות צלזיוס.
      הערה: רמת הבסיס של בתפרחת GCaMP5G היא אופטימלית אצל זבובים בגילאי 14-28 ימים. בידוד זבובים לפי מין מונע את האפשרות של אינטראקציות חברתיות שעלולים להשפיע על התגובות העצביות.
  2. להרדים זבוב תחת זרם עדין של CO 2.
  3. צרף את fly כדי coverslip זכוכית על ידי הנחת הראשון טיפה קטנה של לק במרכז של coverslip 0.17 מ"מ. הנח בעדינות זבוב על צידו על טיפת לק ברור ולהבטיח כי הירידה כולו מכוסה על ידי זבוב.
  4. בצע שלבים 1.5 ו -1.6 תחת סטראו לנתח, להשתמש בהגדלה 8X.
  5. שימוש במכחול רטוב להאריך רגל קדמית של הזבוב. אבטח את רגלו הקדמית בעמדה על ידי הצבת שתי רצועות דקות של סרט על המגזרים tarsal הראשון והחמישי (איור 2 א). זה יחשוף מגזרים tarsal-T4 T2 הדמיה (איור 2 ב).
  6. כדי נוירונים תמונה על החוטם, במקום רצועה דקה של סרט על הדוכן של החוטם לחשוף את השפית (איור 2 ג, ד).
  7. צייר מחסום הידרופובי סביב לטוס עם עט PAP כדי למנוע פתרון לזרום על פני השטח coverslip. לבצע מדידות תוך 30 דקות של הרכבה.

2. הכנת Stimulusפִּתָרוֹן

  1. לדלל הליגנדים lipophilic (כגון CH503, השתמשו במחקר זה) בתמיסה PBST: 137 mM NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מ Na 2 4 HPO, 1.8 מ"מ KH 2 4 PO, 0.1% Triton X-100 (V / V ); pH 7.4.
    1. בצע פתרון המניה 1 מ"ג / מ"ל ​​של ליגנד באמצעות PBST. הכן את כל הדילולים הבאים של פתרון המניות באמצעות PBST.
      הערה: בהתאם המסיסות של ליגנד של עניין, ממסים שונים עשויים להיות נחוצים כדי לפזר את ליגנד. המסיסות של CH503 בממסים שונים מתוארת בטבלת 1. בניגוד ממסים אחרים, PBST לא לייצר גידול הקרינה.

3. גירוי של נוירונים Gustatory ורכישת תמונה

  1. שימוש pipettor 10 μl, מקום 10 μl של PBST על מגזרים tarsal.
    הערה: שלב זה מרטיב את הרגל ומונע מגזרי tarsal נסחף.
  2. השתמש במערכת אופטית שיש לו מצלמה של suמהירויות ורגישות fficient להשיג אות קרינה טובה ברזולוציה גבוהה בזמן.
    הערה: במחקר זה אנו השתמשנו במיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב ומצלמת sCMOS (ראה רשימת חומרים).
  3. בחר את המגזר נוירונים הספציפיים tarsal להיות צלם. רוכש שלוש Z- ערימות confocal מראש גירוי.
    1. באופן אידיאלי, הגדרות רכישת השימוש כי הם מהירים מספיק כדי לאפשר ברזולוצית זמן מקסימלי, תוך עדיין לכיד נפח התא כולו. דוגמא הגדרות רכישה הן: 200 חשיפה msec, binning 2 x 2 ו -6 x 0.5 מיקרומטר 2 חלקים אופטיים, כבשו כל sec 2.
      הערה: רגליות ללא יכולת לזוז כבר צילמו בהצלחה עד 10 דקות, ב 30 מרווחי שניות, ללא הלבנה ניכרת של האות GCaMP. עבור הקלטה פעמים כבר, להבטיח כי הרגליים בחוזקה מאוד במקום על coverslip.
    2. מטב כוח לייזר עבור אות לרעש הכי גבוהות שניתן עם photobleaching מינימלית במהלך הר"י כולוגינג המשטר. עבור הניסויים שתוארו כאן, להשתמש דיודת לייזר 491 ננומטר (100 mW) בשעה שידור 30% הדמיה הן Gr68a ו gustatory ppk23 נוירונים על הרגליים חוטם. השתמש 2 X 2 binning כדי לאפשר פעמים חשיפה קצרה תוך השגת רזולוציה מרחבית מספיק.
      הערה: הגדרות צריכת החשמל לייזר היו אופטימיזציה כדי לאפשר זיהוי של שינוי ניאון החל גידול 1.2- ל -4.5 פי.
  4. פיפטה 10 μl של פתרון הגירוי על מגזרי tarsal. בניסויים שליטים, להוסיף עוד 10 μl של PBST. מיד לרכוש 117 תמונות שלאחר גירוי.
    הערה: מספר התמונות שלאחר גירוי רכשה מבוסס על משך הזמן שבו שינוי מרבי קרינה הושג (כ 2 דקות).
    1. שלב קריטי: בעוד pipetting פתרון הכנה, לא לגעת לטוס עם קצה פיפטה מאז זה יגרום הרגל הקדמית לזוז ממקומן.
      הערה: לחילופין, להשתמשעל micromanipulator למצב כוס נימים המכילות גירוי קרוב במדויק למגזר tarsal להיות צלם. לספק כמויות מבוקרות של גירוי באמצעות מתקן microinjection תאי על פי הוראות היצרן.

עיבוד תמונה 4. וניתוח: כימות של התגובה

  1. פתח סדרה של ערימות-Z confocal באמצעות פיג'י ( http://fiji.sc/Fiji ) 23 או ImageJ ( http://imagej.nih.gov/ij/ ) 24 תמונות תוכנה לניתוח ועיבוד.
  2. ערוך הקרנת עצמת הסכום של כל שש פרוסות Z עבור כל אחת מן הנקודות 120 זמן.
    1. בחר באפשרות "סטאק" תחת "תמונה". יתר על כן, ובחר באפשרות "הקרנת Z" וזן "1" כמו פרוסת ההתחלה "4" כמו פרוסה להפסיק. עבור סוג הקרנה, בחר R20; פרוסות סכום "מהתפריט לנתץ, ובחר באפשרות" הכל מסגרות זמן ".
  3. הגדר באזור (ROI) ריבית על ידי שימוש באפשרות הבחירה ביד חופשית לצייר גבול סביב גוף התא או השלכה העצבית. לחץ על התווית "נתח" ובחר באפשרות "מנהל החזר על השקעה" תחת "כלים".
  4. לכמת את הקרינה של ROI על ידי בחירה באפשרות "מדידות גדר", תחת תפריט "נתח" סימון התיבות עבור משולבים בצפיפות, אזור, אומר וערך אפור מקסימלית תווית. לאחר מכן, בחר באפשרות "עוד" תחת תפריט מנהל ROI, ובהמשך לבחור באפשרות "מידה רבה".
    הערה: זה יפיק תיבה קופץ עם ערכים עבור כל אחד הפרמטרים שנבחרו.
  5. בדוק את ערכי האפור מקסימלית כדי להבטיח שאף אחד פיקסלים הגיעו לרוויה (למשל, 65,535 עבור מצלמה 16-bit).
    הערה: לקבלת הניסויים מוצג tהנייר, התגובות שלו נמדדו או מגופי תא או תחזיות עצביות, תלוי איפה הגידול המקסימאלי ΔF / F נצפה.
  6. חשב את השינוי היחסי מקסימום הקרינה (ΔF / F) בזמן t נקודת זמן הוא כדלקמן:
    משוואה 1
    1. קרינת רקע פחת מכל ערך F (תא). כדי לכמת קרינת רקע, למדוד את הצפיפות המשולבת של החזר השקעה בשיעור של גודל וצורה מקבילים שטח של הרגל הקדמית (או החוטם) נטולת נוירונים לזיהוי.
    2. כדי לכמת את קרינת גירוי פוסט, F (תא) t, למדוד את הצפיפות המשולבת של ROI של גוף התא או תהליך בנקודת זמן "t" לאחר גירוי.
    3. כדי לכמת את הקרינה מראש גירוי, F (תא) t = 0, לנתח תמונות גירוי מראש של הגוף או תהליך התא באותו אופן כפיהאות שלאחר הגירוי. השתמש משולבים בצפיפות ממוצעת של 3 תמונות כדי לקבוע F (תא) t = 0.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מחוון סידן GCaMP התבטא גנטי באמצעות Gr68a-Gal4 או נהגי ppk23-Gal4. אוכלוסיות נפרדות של נוירונים רגל קדמיים ותאי תמיכה הלא עצביים מסומנות על ידי כל נהג (איור 3A-C). ליגנד ספציפי התגובות CH503 פרומון lipophilic נצפו Gr68a-Gal4 ותאי ppk23-Gal4 להביע GCaMP (איור 3D). השינוי היחסי בעוצמת הקרינה של האות GCaMP5G (ΔF / F) והגדילה עם ריכוזים גבוהים יותר של CH503 (איור 3E). מעניין לציין, כי המינון של 5 ng של CH503 עשוי לדכא את התגובה העצבית.

Gr68a ונוירונים ppk23 הציגו דפוסי תגובה שונים. נוירונים Gr68a הראו דפוס טוניק של התגובה העצבית (איור 3F), ואילו ppk23 נוירונים הראו פאזית, בתגובה תנודתית (איור 3G). תגובות מתא עצב ppk23 ב החוטם היוסימפוני נמדד שימוש בתכשיר והציג שילוב של תגובות phasic ו תנודתית (3H איור).

איור 1
איור 1:. יסוד העיקרון של טכניקת הדמיה סידן GCaMP GCaMP5G מתבטא גנטית Gal4 -labeled תאים מאיר בעוצמה נמוכה לפני גירוי עצבי. יישום של גירוי מעורר פוטנציאל פעולה של נוירון וגורם זרם 2+ Ca. GCaMP5G, פעם חייב Ca 2 +, עובר שינוי קונפורמציה, וכתוצאה מכך הקרינה מוגברת (ΔF), אשר משתנה במשך הזמן. קרינת הבסיס (F) מתייחסת עוצמת אות ניאון לפני הגירוי.

איור 2
איור 2: הרכבת זבוב חי הדמיה של נוירונים הרגל הקדמיים או חוטם.(א) הרכבת הרגל הקדמית: תמונת 3.2X של זבוב זכר חי, מראה את הרגליים הקדמיות המהודק אל coverslip עם קלטת. (ב) 40X תמונה של הזבוב, מראה אחד ממגזרי tarsal (T1-5) ואת המיקום של קלטת מעל קטע tarsal הראשון על מגזרי tarsal החמישי. (ג) הרכבת החוטם: חתיכת הסרט ממוקמת מעל הדוכן לחשוף את קצה החוטם. (ד) קצה פיפטה לתוספת גירוי מוחזק מעט מעל לטוס ואינו ליצור קשר ישיר עם התכשיר.

איור 3
איור 3:. תגובות עצביות-induced פרומון ב GCaMP-להביע עצב (א) סכמטי של רגל קדמית זכר תסיסנית מראה את עמדות המרחבי של Gr68a-Gal4 שכותרתו תאים על מגזרים tarsal T2-4. תאים שאינם עצביים (לזהות המבוססת על גודל וצורה) הם שיתוףlored צהוב. (ב) תמונת ניאון גלם של הרגל קדמי הזכר מראה תאים עצביים ותמיכה שכותרתו ידי נהג Gr68a-Gal4. בר סולם = 50 מיקרומטר. (ג) סכמטי של הרגל הקדמית זכר תסיסנית מראה את העמדות המרחבי של ppk23-Gal4 שכותרתו תא על מגזרי tarsal T2-4. (ד) תגובת Gr68a- ונוירונים T4 להביע ppk23 כדי CH503 (המבנה הכימי המוצג לעיל). ΔF הממוצע / F בתגובת CH503 הושווה ΔF הממוצע / היישום הבא F של PBST ממס לבד; מבחן t עם שונות שוויוניות של סטודנטים (עבור Gr68a) או מאן-וויטני בדיקה (עבור ppk23): * p <0.05, *** p <0.001. ברי שגיאה מתארים כוח סטטיסטי SEM = 0.93. (ה) שינוי תלוי-מינון Δ F / F הוא ציין בנוירונים Gr68a ב T4. מבחן t עם שונות שוויוניות של סטודנט: ** p <0.01, *** p <0.001. כוח סטטיסטי = 0.86-0.96. (F (G) קורס בצבעים זמן מציג תנודתית, תגובת phasic קרינת GCaMP בעקבות גירוי CH503 (500 ng) של נוירונים להביע ppk23. העמדות של הנוירונים על הרגל הקדמית מוצגות בתמונת פלורסנט הגלם (משמאל). סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר; ציר זמן: 0-96 שניות. גרף הקו שלפניך תגובה הפורצת מן נוירון ppk23 לגירוי על ידי 500 ננוגרם של CH503. חץ אדום מציין את הזמן שבו הגירוי נוסף. Respo השיאNSE מתרחשת בגיל 76 שניות. (H) קורס בצבעים זמן של נוירונים להביע ppk23 על חוטם מראה תגובה טוניק מאוחרת מגוף התא ומענה תנודתית מתוך הקרנת axonal בעקבות גירוי CH503 (500 ng). העמדות של התאים מוצגים בתמונה פלורסנט גלם (משמאל). בר סולם = 10 מיקרומטר; ציר זמן: 0-96 שניות. לשכפל באישור שנקר, S., et al. ונוירופפטידים tachykinin חיוני לגילוי פרומון בתוך מעגל עצבי התעורר אצלם. doi:. 10.7554 / eLife.06914 (2015) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

1,2 מרכך מסיסות של CH 5 0 3 3 האם הפעילות העצבית לבד ההדק ממס? 4
0.1% PBST כן לא
100% אתנול כן כן
100% הקסאן כן כן
10% אתנול לא (לא נבדק)
10% הקסאן לא (לא נבדק)
100% DMSO כן כן
10% DMSO כן כן
0.4% DMSO כן כן
0.2% DMSO כן כן

טבלה 1:. מסיסות של CH 5 0 3 בממסים שונים DMSO 1:. דימתיל sulfoxide 2 אתנול, הקסאן, ופתרונות DMSO ב דוללו עם DH 2 O (v / v) 3 מסיסות של CH503 ב -0.2% DMSO הוגבל. רק 250 ng / ml. 4 גידול ΔF / F עם ממס בלבד הוא כבר בבחינת obser כיved על גירוי עם פרומון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אנו מתארים כאן שיטה יש לבצע הדמית סידן חיה של נוירונים היקפיים לתסיסנית 2 אברי חישה שונים. Ca 2 + -evoked תגובות פלורסנט GCaMP ב Gr68a-נוירונים המושרים על ידי ליגנד פרומון CH503 היה תלוי מינון וכמותיים. זה היה גם ניתן להבחין דפוסי תגובה עצבית שונים כגון phasic ותגובות טוניק.

נוירונים מראים תגובות phasic הם האמינו לאפשר הסתגלות מהירה לגירויים רציפים. סוג של תגובה זו נקשר עם זיהוי ריח 25 והדור של דפוסי פעילות מוטוריים קצבי 26. לעומת זאת, תנודות עצביות, אשר תוארו מערכות חישה רבות, נחשבות לסנכרן כניסות מרובות על גבי אתר postsynaptic יחיד להעביר תכונות ספציפיות על הגירוי 27. הבסיס המולקולרי של תנודות הקשורות נוירונים ppk23 טרם דווח, כדי kn שלנוowledge. בשאר סוגי תאים להתרגש מראים תגובות תנודתית, התדירות של התנודות הוכחה להיות מוסדרת באמצעות תהליך הנקרא לשחרור סידן-induced סידן 28. בתהליך זה, סידן הוא שוחרר מחנויות פנימיות תחת השליטה של ​​אדנוזין אינוזיטול שליח המשני, ואת התדירות של השקתו תלויה בעוצמת הגירוי החיצוני. תובנה לתוך הבסיס המולקולרי של תגובות עצביות טוניק כבר צברו ממחקרים על קולטני חישת חמצן של ג elegans 29. עלייה מתמשכת ברמות סידן בתוך הנוירונים נמצאה בתיווכה ערוצי סידן מתח המגודר L- סוג, ryanodine, ו אדנוזין אינוזיטול מסלולי איתות 29. זה יהיה חשוב לבדוק אם מנגנונים דומים ממלאים תפקיד בתגובות של נוירונים ppk23.

הדמית סידן חי יכולה להיות מותאמת בכמה דרכים לחקר אוכלוסיות אחרות של כטב"מ-TrpA1 או כטב"מ-Shibire ts, ומדידת השינויים המתאימים קרינה בנוירונים אלה על גירוי 4. רביעית, השימוש של סדרה עתית רציפה לאיסוף התמונה יכולה להקל זיהוי של תאים להגיב מהר. לבסוף, עם תוספת של תאורת לייזר ממוקד, שיטה זו יכולה להיות מורחבת לשימוש עם שיטות הדמיה לחיות תאים מתקדמות אחרות כגון FRAP ו סריג.

conside טכני מספר מנות הם הכרח כדי להשיג תמונות יציבות למדוד את מהלך הזמן במדויק תגובות פיסיולוגיות. ראשית, הרגל הקדמית חייבת להיות ממוקמת באופן מאובטח מאז לטוס מפגין תנועה נמרצת על תוספת של הפתרון, אשר יכול להיות מקור של וריאציה בין הכנות. למרות יישום אמבט של תמיסת פרומון מאפשר ליגנד להגיע כל sensilla התעורר אצלם על מגזרי tarsal החשופים, כמה הפתרון יכול לזרום כלפי חלקים אחרים של התכשיר הרכוב. כמו כן, הרגל הקדמית עלולה להיסחף כאשר הפתרון הוא הוסיף. שנית, לתדמית במדויק כמעט מיידי עליות הקרינה, חשוב לחדש הדמיה מיד לאחר תוספת של הגירוי מאז נוירונים מסוימים להראות תגובה מהירה מקסימאלית בתוך 4 שניות של גירוי. לחלופין, סדרה עתית מתמשכת יכולה להיות יזם לפני הוספת פתרון הגירוי, ונקודת הזמן המדויקת שבה הגירוי מנוהל ניתן לסמן.

= ילדה "jove_content"> שני מקורות של תגובות חיוביות כוזבות נצפו. ראשית, הממס עצמו יכול לגרום לתגובות ניאון גם בהיעדר של ליגנד. ממס PBST נגרם תגובה כזו בחלק תאי שכותרתו ppk23-Gal4. בנוסף, DMSO, ממס נפוץ מולקולות קוטב אי-קוטביות, הנגרם גם הד בכמה נוירונים שכותרתו Gr68a-Gal4. לכן זה חיוני כדי לקבוע אם הממס עצמו גורם אות ניאון וכדי לבחור מערכת ממס עם פעילות רקע נמוכה. שנית, תגובה מסוג phasic חזקה בתאי תמיכה הלא עצביים נצפתה אל PBST ממס לבד. נהג Gr68a-Gal4 מתבטא בשני נוירונים ותאי תמיכה שנראים מקיפים חלק של נוירונים בכלל, הם גדולים, בצורה בלא צורה, וחסרי תחזיות גלויות. לכן חשוב להבדיל עצבי מן התגובות הלא עצביות עבור כל קו Gal4 בעת בחירת ROIs.

_content "> מגבלה עיקרית אחת של שיטה זו היא כי אותה הכנת זבוב לא יכולה לשמש בניסויים המשך כדי לבדוק ריכוזים או סוגים שונים של הליגנדים, אלא אם הגירוי להחיל מוסר לעומק קודם מפני השטח של coverslip. בנוסף, שיטה זו לא ניתן להשתמש עבור הדמית קצב העברת נתונים גבוהות של כמה זבובים בבת אחת, בשל וההגברה הגדולה הדרושה להדמיה של נוירונים תסיסנית, והצורך לרכישה מהירה ברזולוציה גבוהה בזמן. לבסוף, שיטה זו דורשת את הזמינות של כלים גנטיים עבור ביטוי גנים מהונדס , הגבלת יישום בעיקר אורגניזמים מודל מרכזיים ובכך.

בסך הכל, בשיטה זו מהווה חלופה קלה להקלטות הסלולר באמצעות אלקטרודות ואינה דורשת מכשור מיוחד. בנוסף, בניגוד לכתבים מקודד גנטית אחרים כגון CaLexA, החיה נשמרת בחיים לאורך הדמיה לאפשר תגובות פיזיולוגיות להימדד מחדשאל-זמן עם רגישות גבוהה בזבובים בכל הגילים. תכונה זו עלולה לאפשר הקרנת תגובות תלוית גיל הליגנדים או השוואה של תגובות עצביות בעקבות שינוי תנאים חברתיים או מדינת רבייה. יתר על כן, הקלטות מתמשכות יכולות להתבצע עבור 10 דקות לפחות בלי photobleaching ברור או מוזנח של אות GCaMP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gr68a-Gal4 Gift from H. Amrein (Texas A&M Health Science Center, TX, USA) and J. Carlson (Yale University, CT, USA)
ppk23-Gal4 Gift from K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA)
UAS-GCaMP5  42037 Bloomington Drosophila  Stock Center
0.17 mm coverslip (Gold-Seal coverslip) Electron Microscopy Services 63790-10
Nail polish, "Hard as Nails Clear"  Sally Hansen
PAP pen Sigma-Aldrich  Z377821
Paint brush fine-tipped brush
Tape  Scotch brand
Triton X-100 Sigma-Aldrich  13021
Ethanol, lab grade Merck 10094
Hexane, HPLC grade Sigma-Aldrich  H303SK-4
DMSO Sigma-Aldrich  472301
PBST Recipe described in the protocol section
CH503 Synthesis described in Mori et al., 2010
sCMOS Camera (ORCA Flash4.0) Hamamatsu  C11578-22U
Microscope (Ti-Eclipse) Nikon Ni-E
Spinning Disk Scan head  Yokogawa CSU-X1-A1
Aquistion Software (MetaMorph Premier) Molecular Devices 40002
Fiji software open source http://fiji.sc/Fiji

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287, 1830-1834 (2000).
  2. Dunipace, L., Meister, S., McNealy, C., Amrein, H. Spatially restricted expression of candidate taste receptors in the Drosophila gustatory system. Curr. Biol. 11, 822-835 (2001).
  3. Thistle, R., Cameron, P., Ghorayshi, A., Dennison, L., Scott, K. Contact chemoreceptors mediate male-male repulsion and male-female attraction during Drosophila courtship. Cell. 149, 1140-1151 (2012).
  4. Toda, H., Zhao, X., Dickson, B. J. The Drosophila female aphrodisiac pheromone activates ppk23(+) sensory neurons to elicit male courtship behavior. Cell Rep. 1, 599-607 (2012).
  5. Vijayan, V., Thistle, R., Liu, T., Starostina, E., Pikielny, C. W. Drosophila pheromone-sensing neurons expressing the ppk25 ion channel subunit stimulate male courtship and female receptivity. PLoS Genet. 10, 1004238 (2014).
  6. Lu, B., LaMora, A., Sun, Y., Welsh, M. J., Ben-Shahar, Y. ppk23-Dependent chemosensory functions contribute to courtship behavior in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 8, e1002587 (2012).
  7. Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a Clade of Ionotropic Receptors Are Candidate Taste and Pheromone Receptors. Neuron. 83, 850-865 (2014).
  8. Montell, C. A taste of the Drosophila gustatory receptors. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 345-353 (2009).
  9. Shanbhag, S. R., Park, S. K., Pikielny, C. W., Steinbrecht, R. A. Gustatory organs of Drosophila melanogaster: fine structure and expression of the putative odorant-binding protein PBPRP2. Cell Tissue Res. 304, 423-437 (2001).
  10. Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. J. Neurobiol. 56, 139-152 (2003).
  11. Rodrigues, V., Siddiqi, O. A gustatory mutant of Drosophila defective in pyranose receptors. Mol. Genet. Genomics. 181, 406-408 (1981).
  12. Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. J. Neurobiol. 61, 333-342 (2004).
  13. Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of Drosophila. J. Neurosci. 34, 7148-7164 (2014).
  14. Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. J. Vis. Exp. , e51355 (2014).
  15. Meunier, N., Marion-Poll, F., Lansky, P., Rospars, J. P. Estimation of the individual firing frequencies of two neurons recorded with a single electrode. Chem. Senses. 28, 671-679 (2003).
  16. Masuyama, K., Zhang, Y., Rao, Y., Wang, J. W. Mapping neural circuits with activity-dependent nuclear import of a transcription factor. J. Neurogenet. 26, 89-102 (2012).
  17. Akerboom, J., et al. Crystal structures of the GCaMP calcium sensor reveal the mechanism of fluorescence signal change and aid rational design. J. Biol. Chem. 284, 6455-6464 (2009).
  18. Miyamoto, T., Chen, Y., Slone, J., Amrein, H. Identification of a Drosophila glucose receptor using Ca2+ imaging of single chemosensory neurons. PloS One. 8, e56304 (2013).
  19. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
  20. Shikichi, Y., et al. Pheromone synthesis. Part 250: Determination of the stereostructure of CH503 a sex pheromone of male Drosophila melanogaster, as (3R,11Z,19Z)-3-acetoxy-11,19-octacosadien-1-ol by synthesis and chromatographic analysis of its eight isomers. Tetrahedron. 68, 3750-3760 (2012).
  21. Yew, J. Y., et al. A new male sex pheromone and novel cuticular cues for chemical communication in Drosophila. Curr. Biol. 19, 1245-1254 (2009).
  22. Bray, S., Amrein, H. A putative Drosophila pheromone receptor expressed in male-specific taste neurons is required for efficient courtship. Neuron. 39, 1019-1029 (2003).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
  24. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  25. Kaissling, K. E., Zack Strausfeld, C., Rumbo, E. R. Adaptation processes in insect olfactory receptors. Mechanisms and behavioral significance. Ann. N. Y. Acad. Sci. 510, 104-112 (1987).
  26. Marder, E., Bucher, D. Central pattern generators and the control of rhythmic movements. Curr. Biol. 11, 986-996 (2001).
  27. Koepsell, K., Wang, X., Hirsch, J. A., Sommer, F. T. Exploring the function of neural oscillations in early sensory systems. Front Neurosci. 4, 53 (2010).
  28. Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
  29. Busch, K. E., et al. Tonic signaling from O(2) sensors sets neural circuit activity and behavioral state. Nat Neurosci. 15, 581-591 (2012).

Tags

אימונולוגיה גיליון 110, פרומון התעורר אצלם לחיות רגל קדמית חוטם הדמיה סידן GCaMP שומנים בדם קולטן
מדידת תגובות פיזיולוגיות של<em&gt; תסיסנית</em&gt; עצב סנסורי כדי ליפידים פרומונים שימוש סידן הדמיה חיה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shankar, S., Calvert, M. E. K., Yew, … More

Shankar, S., Calvert, M. E. K., Yew, J. Y. Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging. J. Vis. Exp. (110), e53392, doi:10.3791/53392 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter