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Immunology and Infection

मापने की शारीरिक प्रतिक्रियाओं Published: April 29, 2016 doi: 10.3791/53392
Automatic Translation
1,2, 3,4, 1,2,5
1Temasek Life Sciences Laboratory, 2Department of Biological Science, National University of Singapore, 3Bioimaging and Biocomputing Facility, Temasek Life Sciences Laboratory, 4Histology and Light Microscopy Core, Gladstone Institutes, 5Pacific Biosciences Research Center, University of Hawai'i at Mānoa

Abstract

स्तनधारियों के विपरीत, इस तरह के ड्रोसोफिला के रूप में कीड़े कई स्वाद अंग होते हैं। पैर, सूंड, पंख और ड्रोसोफिला के अंडनिधानांग पर chemosensory न्यूरॉन्स स्वाद रिसेप्टर्स 1,2, आयन चैनल को 3-6, और ionotropic रिसेप्टर्स 7 कि अस्थिर और गैर वाष्पशील संवेदी संकेतों का पता लगाने में शामिल कर रहे हैं व्यक्त करते हैं। इन न्यूरॉन्स सीधे जैसे भोजन, हानिकारक पदार्थों और फेरोमोन के रूप में tastants संपर्क और इसलिए इस तरह खिला, अंडे बिछाने और संभोग के रूप में कई जटिल व्यवहार को प्रभावित करती है। इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग और कैल्शियम इमेजिंग व्यापक रूप से कीड़ों में इस्तेमाल किया गया है इन tastants द्वारा पैदा न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं यों की। हालांकि, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी विशेष उपकरणों और एक भी स्वाद sensillum से माप प्राप्त करने की आवश्यकता है सेल प्रकार, आकार और स्थिति के आधार पर तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इसके अलावा, ड्रोसोफिला में एक न्यूरॉन संकल्प के बाद से स्वाद sensilla Hou प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो सकता हैएसई chemosensory न्यूरॉन के एक से अधिक प्रकार। लाइव कैल्शियम इमेजिंग विधि यहाँ वर्णित लाइव मक्खियों में एकल स्वाद न्यूरॉन्स की प्रतिक्रियाओं को मापा जा सकता है। इस विधि लिपिड फेरोमोन और अन्य ligand प्रकार पानी आधारित सॉल्वैंट्स में कम घुलनशीलता है कि करने के लिए neuronal प्रतिक्रियाओं इमेजिंग के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है।

Introduction

पशु घ्राण और स्वाद जानकारी पर भरोसा अस्तित्व और प्रजनन के लिए आवश्यक निर्णय मध्यस्थता करने के लिए। समझ कैसे chemosensory संकेतों का पता चला और तंत्रिका तंत्र द्वारा कार्रवाई की जाती है संवेदी रिसेप्टर (एस) और इसी रासायनिक ligands की पहचान की आवश्यकता है। ड्रोसोफिला अस्थिर और गैर अस्थिर यौगिकों का एक चौंका देने वाला किस्म का पता लगाने और जिसमें शारीरिक अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल हैं तंत्र chemosensation अंतर्निहित। घ्राण अंगों अस्थिर अणुओं में देखती है, वहीं स्वाद अंगों कम अस्थिरता यौगिकों का पता लगाने के लिए विशेष कर रहे हैं। यहाँ, हम एक विधि सीधे कम अस्थिरता, lipophilic ligands के लिए ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर का स्वाद अंगों से न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए उपस्थित थे।

मक्खी के स्वाद अंगों forelegs, सूंड, और पंखों में शामिल हैं। स्वाद अंगों की सतह पर वितरित बाल की तरह sensilla रूप में जाना जाता संरचनाओं कि एस का जवाब हैंugars, कड़वाहट, लवण, पानी और फेरोमोन 8। Sensilla स्वाद जगमग में आकृति विज्ञान में वर्गीकृत किया गया है और स्वाद 9 खूंटे। वहाँ labellum है कि लंबे समय (एल प्रकार) के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं पर के बारे में 31 स्वाद जगमग, लघु (एस प्रकार) और मध्यवर्ती (i-प्रकार) morphologies हैं। 'एल' और 'एस' sensilla घर 4 संवेदी न्यूरॉन्स कि चीनी को physiologically प्रतिक्रिया (सेल), कम नमक (एल 1 सेल), उच्च नमक और कड़वा यौगिकों (एल 2 सेल) और पानी (डब्ल्यू सेल) 10 11। 'मैं' sensilla घर 2 संवेदी न्यूरॉन्स, कम नमक और चीनी के लिए दोनों का जवाब जिनमें से एक है, जबकि अन्य प्रतिक्रिया उच्च नमक से 12। पुरुषों में लगभग 41 स्वाद sensilla और forelegs में से प्रत्येक पर वितरित महिलाओं में 26 sensilla रहे हैं। पुरुषों और महिलाओं दोनों के लिए, वहाँ midleg पर 21 sensilla, और hindleg 13 पर के बारे में 22 sensilla हैं। स्वाद पैरों पर स्वाद sensilla से घिरा न्यूरॉन्स भी ग रहे हैंएल 1, एल 2, डब्ल्यू एस प्रकार में lassified।

एकल न्यूरॉन्स से बिजली की गतिविधि को मापने के लिए एक मानक विधि बाह्य या intracellular इलेक्ट्रोड का उपयोग करता आयन प्रवाह रिकॉर्ड करने के लिए। इलेक्ट्रोड माप न्यूरोनल समारोह में इस तरह ड्रोसोफिला प्रजातियों, पतिंगे, और मधुमक्खियों जो तंत्रिका लेबलिंग के लिए व्यापक आनुवंशिक उपकरणों की कमी के रूप में गैर-मॉडल जीवों में अध्ययन किया जा करने के लिए अनुमति देते हैं। हालांकि, जबकि electrophysiological तरीकों को नियमित 4,13,14 sensilla ड्रोसोफिला स्वाद से गतिविधि को मापने के लिए, इस दृष्टिकोण को लागू करने में इस्तेमाल किया गया है कई तकनीकी चुनौतियों प्रस्तुत करता है। सबसे पहले, जगमग आकृति विज्ञान और स्थानिक स्थान के आधार पर पहचान किए जाने की जरूरत स्वाद। पहचान पर, electrophysiological माप, sensilla के छोटे आकार के द्वारा बाधा जा सकता है स्थिति के कारण सीमित पहुंच, और एक स्वाद के लिए एक रासायनिक प्रोत्साहन की नियंत्रित मात्रा में लागू करने में कठिनाई बाल खड़े। इसके अलावा, sensilla की उत्तेजना से अधिक से संकेत उत्पन्न हो सकता हैन्यूरोनल प्रकार 15। दूसरा, विद्युत संकेतों का पता लगाने पृष्ठभूमि इलेक्ट्रॉनिक उपकरणों से यांत्रिक कंपन और शोर से उत्पन्न शोर से चकित किया जा सकता है। तीसरा, एक तेज इलेक्ट्रोड का उपयोग करते हैं, मक्खी तैयारी नुकसान पहुंचा सकता है अगर गलत तरीके से 14 का इस्तेमाल किया। अंत में, एक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिग कोडांतरण प्रोत्साहन वितरण, संकेत रिकॉर्डिंग, और डेटा विश्लेषण के लिए विशेष इलेक्ट्रॉनिक उपकरणों की आवश्यकता है और महंगा हो सकता है।

डी में मेलानोगास्टर, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग उपकरणों की उपलब्धता इमेजिंग तकनीक है कि न्यूरॉन्स की छोटी आबादी की प्रतिक्रियाओं का अध्ययन किया जा करने की अनुमति के विकास में मदद की है। ऐसा ही एक दृष्टिकोण CaLexA रिपोर्टर 16 का इस्तेमाल होता है। इस विधि में, LexA-VP16 प्रतिलेखन कारक है और एक कैल्शियम संवेदनशील प्रोटीन NFAT एन्कोडिंग जीन दृश्यों को एक साथ जुड़े हुए हैं। प्रोटीन फॉस्फेट calcineurin की कैल्शियम सक्रियण NFAT के डी-फोस्फोराइलेशन उत्प्रेरित और बदले, facilita में,नाभिक में इसके आयात टीईएस। नाभिक के अंदर, LexA डोमेन एक LexAop डीएनए बाध्यकारी मूल भाव है जो एक हरे रंग का फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) रिपोर्टर की अभिव्यक्ति का निर्देशन, इस प्रकार कार्यात्मक सक्रिय न्यूरॉन्स की निरंतर पहचान की अनुमति को बांधता है। दृष्टिकोण सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है एक odorant 16 को लाइव मक्खियों के प्रदर्शन के बाद antennal पालि में विशिष्ट घ्राण केशिकागुच्छ की प्रतिक्रिया को मापने के लिए। हाल ही में, IR52c स्वाद रिसेप्टर न्यूरॉन्स की शारीरिक प्रतिक्रियाओं CaLexA 7 का उपयोग कर लाइव मक्खियों से मापा गया। हालांकि, इस अध्ययन के लिए, यह उम्र मक्खियों के लिए आवश्यक ऊपर से 6 सप्ताह GFP प्रतिलेखन बढ़ाने के लिए किया गया था। एक विरोधी GFP एंटीबॉडी के साथ immunostaining CaLexA सिग्नल को बढ़ावा देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, इस विधि ऊतक निर्धारण की आवश्यकता होगी, इस प्रकार रहते सेल इमेजिंग के लिए संभावना precluding।

आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम सूचक प्रोटीन GCaMP भी बड़े पैमाने पर की एक संख्या में neuronal प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैप्रजातियों 17। प्रोटीन GCaMP न्यूरोनल उत्तेजना से पहले कम तीव्रता के साथ fluoresces। एक प्रोत्साहन के अनुप्रयोग, न्यूरॉन में एक संभावित कार्रवाई हो सके सीए 2 की आमद हो जाती है। GCaMP, सीए 2 के लिए बाध्य है, एक गठनात्मक बदलाव आए, यह चमक तीव्रता (चित्रा 1) के साथ प्रतिदीप्ति के कारण। हाल ही में विकसित एकल न्यूरॉन कैल्शियम इमेजिंग दृष्टिकोण अगली टांग विशिष्ट स्वाद Gr61a न्यूरॉन्स 18 के लिए ligand के रूप में ग्लूकोज की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस अध्ययन में, Gr61a स्वाद न्यूरॉन्स में GCaMP व्यक्त ट्रांसजेनिक ड्रोसोफिला से विच्छेदित forelegs agarose इमेजिंग के लिए पहले की एक परत के साथ कवर किया गया। हालांकि, विच्छेदित ऊतक का उपयोग GCaMP अभिव्यक्ति की अंतिम ठहरनेवाला पैदा कर सकता है, इस प्रकार माप समय और संवेदनशीलता का पता लगाने सीमित। इसके अलावा, agarose प्रतिदीप्ति के उच्च स्तर पृष्ठभूमि और इसकी रोशनी बिखरने गुणों के कारण संवेदनशीलता सीमित कर सकते हैं।

टीओ इन कमियों के कुछ पता है, हम GCaMP की मध्यस्थता कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग अगली टांग और सूंड बरकरार जानवरों का स्वाद न्यूरॉन्स से शारीरिक प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करने का वर्णन है। हम शारीरिक एक ड्रोसोफिला लिपिड फेरोमोन के लिए आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग GCaMP5G 19 व्यक्त (3 आर, 11 जेड, 19 जेड) Gr68a की प्रतिक्रियाओं और ppk23 न्यूरॉन्स, -3-acetoxy-11,19-octacosadien-1-राजभाषा (CH503) 20 दिखाने के लिए, 21। Neuronal प्रतिक्रियाओं फेरोमोन उत्तेजना के दौरान GCaMP5G संकेत के प्रतिदीप्ति में वृद्धि बढ़ाता द्वारा मापा जाता है। इस प्रोटोकॉल में, न्यूरॉन्स 120 सेकंड है, जो व्यक्ति की कोशिकाओं में neuronal सक्रियण के पैटर्न को अलग करने के लिए पर्याप्त है की कुल अवधि के लिए imaged हैं।

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Protocol

1. नमूना तैयार

  1. यूएएस GCaMP5G 19 मक्खियों को Gal4 3,22 चालक लाइन (; P {20XUAS-IVS-GCaMP5G} attP40 डब्ल्यू 1118) को पार। पार 25 डिग्री सेल्सियस पर विकसित करने के लिए अनुमति दें।
    नोट: जनरेटिंग Gal4 या यूएएस GCaMP transgenes की कई प्रतियां साथ मक्खियों फ्लोरोसेंट संकेत तीव्रता को बढ़ाने में मदद कर सकते हैं। यूएएस GCaMP ट्रांस्जीन (यूएएस GCaMP3) के पुराने संस्करण जब Gr68a-Gal4 चालक के नियंत्रण में व्यक्त बहुत कमजोर प्रतिदीप्ति तीव्रता दिखाया।
    1. लीजिए और सेक्स नव eclosed वयस्क मक्खियों से अलग और 25 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ा।
      नोट: GCaMP5G पुष्पन के आधारभूत स्तर 14-28 दिनों के बीच आयु वर्ग मक्खियों में इष्टतम है। सेक्स से मक्खियों अलग सामाजिक संबंधों कि तंत्रिका प्रतिक्रियाओं प्रभावित कर सकते हैं की संभावना के अलग करता है।
  2. सीओ 2 के एक हल्के धारा के तहत एक मक्खी anesthetize।
  3. एफ संलग्नLy पहले एक 0.17 मिमी coverslip के केंद्र में नेल पॉलिश की एक छोटी सी बूंद रखकर एक गिलास coverslip करने के लिए। धीरे स्पष्ट नेल पॉलिश की बूंद पर अपने पक्ष पर एक मक्खी जगह है और यह सुनिश्चित करें कि पूरे बूंद मक्खी द्वारा कवर किया जाता है।
  4. एक विदारक stereomicroscope, 8X बढ़ाई इस्तेमाल किया तहत कदम 1.5 और 1.6 प्रदर्शन करना।
  5. मक्खी की एक अगली टांग विस्तार करने के लिए एक गीला तूलिका का प्रयोग करें। पहले और पांचवें टखने की हड्डियों खंडों (2A चित्रा) पर टेप की दो पतली स्ट्रिप्स रखकर स्थिति में अगली टांग सुरक्षित। इस टखने की हड्डियों खंडों इमेजिंग (चित्रा 2 बी) के लिए टी 2-टी -4 का खुलासा होगा।
  6. सूंड पर छवि न्यूरॉन्स के लिए, सूंड labellum (चित्रा -2 सी, डी) को बेनकाब करने के व्याख्यान चबूतरा पर टेप की एक पतली पट्टी जगह है।
  7. एक पैप कलम coverslip सतह पर बहने से रोकने के लिए समाधान के साथ चारों ओर उड़ान भरने के लिए एक हाइड्रोफोबिक बाधा ड्रा। बढ़ते के 30 मिनट के भीतर मापन करने।

2. प्रोत्साहन की तैयारीउपाय

  1. Lipophilic ligands पतला एक PBST समाधान में (जैसे CH503, इस अध्ययन में इस्तेमाल के रूप में): 137 मिमी NaCl, 2.7 मिमी KCl, 10 मिमी ना 2 HPO 4, 1.8 मिमी के.एच. 2 4 पीओ, 0.1% ट्राइटन X-100 (वी / वी ); 7.4 पीएच।
    1. ligand PBST उपयोग करने का एक 1 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान करें। PBST का उपयोग कर शेयर समाधान के बाद के सभी dilutions तैयार करें।
      नोट: ब्याज की ligand की घुलनशीलता पर निर्भर करता है, विभिन्न सॉल्वैंट्स ligand भंग करने की जरूरत हो सकती है। विभिन्न सॉल्वैंट्स में CH503 की घुलनशीलता तालिका 1 में वर्णित है। अन्य सॉल्वैंट्स के विपरीत, PBST प्रतिदीप्ति में वृद्धि का उत्पादन नहीं किया था।

3. स्वाद न्यूरॉन्स और छवि के अधिग्रहण की उत्तेजना

  1. एक 10 μl pipettor का प्रयोग, टखने की हड्डियों खंडों पर PBST के 10 μl जगह है।
    नोट: यह कदम पैर बल्लेबाज और बहती से टखने की हड्डियों खंडों से बचाता है।
  2. एक ऑप्टिकल प्रणाली सु का एक कैमरा का उपयोग करेंfficient की गति और संवेदनशीलता उच्च समय संकल्प पर अच्छा प्रतिदीप्ति संकेत प्राप्त करने के लिए।
    नोट: इस अध्ययन के लिए हम एक कताई डिस्क confocal खुर्दबीन और एक sCMOS कैमरा (देखें माल की सूची) का इस्तेमाल किया।
  3. विशिष्ट टखने की हड्डियों खंड और न्यूरॉन्स चुनें imaged किया जाना है। तीन पूर्व उत्तेजना confocal जेड ढेर मोल।
    1. आदर्श रूप में, उपयोग अधिग्रहण सेटिंग्स है कि काफी तेजी से अधिक से अधिक समय संकल्प अनुमति देने के लिए, जबकि अभी भी पूरे सेल की मात्रा पर कब्जा कर रहे हैं। उदाहरण अधिग्रहण सेटिंग्स हैं: 200 मिसे जोखिम, binning 2 एक्स 2 और 6 x 0.5 माइक्रोन 2 ऑप्टिकल वर्गों, हर 2 सेकंड पर कब्जा कर लिया।
      नोट: Immobilized पैर GCaMP संकेत के साथ कोई प्रत्यक्ष विरंजन, अप करने के लिए 10 मिनट के लिए सफलतापूर्वक imaged किया गया है 30 सेकंड के अंतराल पर। अब रिकॉर्डिंग समय के लिए, यह सुनिश्चित करें कि पैर coverslip पर बहुत मजबूती से आयोजित कर रहे हैं जगह में।
    2. उच्चतम संकेत करने वाली शोर पूरे आईएमए के दौरान कम से कम photobleaching के साथ प्राप्त करने के लिए लेजर शक्ति का अनुकूलनशासन ging। यहाँ वर्णित प्रयोगों के लिए, पैर और सूंड पर दोनों Gr68a और ppk23 स्वाद न्यूरॉन्स इमेजिंग के लिए 30% संचरण में एक 491 एनएम लेजर डायोड (100 मेगावाट) का उपयोग करें। 2 एक्स 2 binning का प्रयोग करें, जबकि अभी भी पर्याप्त स्थानिक संकल्प को प्राप्त करने के लिए कम जोखिम बार की अनुमति है।
      नोट: लेजर शक्ति सेटिंग्स फ्लोरोसेंट एक 1.2 के लिए 4.5 गुना वृद्धि से लेकर परिवर्तन का पता लगाने की अनुमति के लिए अनुकूलित किया गया।
  4. पिपेट टखने की हड्डियों खंडों पर प्रोत्साहन समाधान के 10 μl। नियंत्रण प्रयोगों के लिए, PBST की एक और 10 μl जोड़ें। इसके तत्काल बाद 117 पोस्ट-उत्तेजना छवियों का अधिग्रहण।
    नोट: का अधिग्रहण के बाद उत्तेजना छवियों की संख्या समय की राशि है, जिसमें प्रतिदीप्ति में अधिक से अधिक परिवर्तन पहुँच गया था (लगभग 2 मिनट) पर आधारित है।
    1. महत्वपूर्ण कदम: तैयारी पर समाधान pipetting नदीम, के बाद से इस अगली टांग स्थिति से बाहर स्थानांतरित करने के लिए कारण होगा विंदुक टिप के साथ उड़ छूने के लिए नहीं है।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, का उपयोगएक micromanipulator सही टखने की हड्डियों का एक गिलास क्षेत्र के लिए राहत पैकेज बंद युक्त केशिका की स्थिति के लिए imaged किया जाना है। निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक intracellular microinjection निकालने की मशीन का उपयोग कर प्रोत्साहन की नियंत्रित मात्रा में वितरित।

4. इमेज प्रोसेसिंग और विश्लेषण: प्रतिक्रिया की मात्रा

  1. फिजी (का उपयोग confocal जेड के ढेर की एक श्रृंखला खोलें http://fiji.sc/Fiji ) 23 या ImageJ ( http://imagej.nih.gov/ij/ ) 24 छवि विश्लेषण और संसाधन सॉफ्टवेयर।
  2. 120 समय बिंदुओं में से प्रत्येक के लिए सभी छह जेड स्लाइस की राशि तीव्रता प्रक्षेपण बनाओ।
    1. "छवि" के तहत "ढेर" विकल्प का चयन करें। इसके अलावा, "Z प्रक्षेपण" विकल्प का चयन करें और "1" में प्रवेश प्रारंभ टुकड़ा और "4" बंद करो टुकड़ा के रूप में के रूप में। प्रक्षेपण प्रकार के लिए, आर चयन20; योग स्लाइस सभी समय फ्रेम "पुल डाउन मेनू से, और चुन" "।
  3. मुक्तहस्त चयन उपकरण का उपयोग कर एक सेल शरीर या न्यूरोनल प्रक्षेपण के चारों ओर एक सीमा आकर्षित करने के लिए ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र को परिभाषित करें। "विश्लेषण" लेबल पर क्लिक करें और "उपकरण" के तहत "रॉय प्रबंधक" विकल्प का चयन करें।
  4. , "विश्लेषण" मेनू के तहत "सेट माप" विकल्प का चयन, और एकीकृत घनत्व, क्षेत्र के लिए बक्से की जाँच करके रॉय के प्रतिदीप्ति यों मतलब है और अधिक से अधिक ग्रे मूल्य और लेबल। फिर, रॉय प्रबंधक मेनू के तहत "अधिक" विकल्प का चयन करें, और आगे "मल्टी उपाय है" विकल्प का चयन करें।
    नोट: यह चुने गए मापदंडों के प्रत्येक के लिए मूल्यों के साथ एक पॉपअप बॉक्स उत्पन्न होगा।
  5. अधिकतम ग्रे मूल्यों की जाँच करें सुनिश्चित करने के लिए पिक्सल की है कि कोई संतृप्ति तक पहुँच चुके हैं (जैसे, एक 16-बिट कैमरे के लिए 65,535)।
    नोट: प्रयोगों के लिए टी में दिखाया गया हैअपने पत्र, प्रतिक्रियाओं या तो सेल निकायों या न्यूरोनल अनुमानों, जहां ΔF / एफ में अधिक से अधिक वृद्धि मनाया गया पर निर्भर करता है से मापा गया।
  6. समय बिंदु टी में प्रतिदीप्ति (ΔF / एफ) में अधिकतम सापेक्ष परिवर्तन की गणना इस प्रकार है:
    1 समीकरण
    1. प्रत्येक एफ (सेल) मूल्य से घटाना पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति। पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति यों, अगली टांग (या सूंड) detectable न्यूरॉन्स से रहित के एक क्षेत्र से बराबर आकार और आकार की एक रॉय के एकीकृत घनत्व को मापने।
    2. पोस्ट-उत्तेजना प्रतिदीप्ति, एफ (सेल) टी यों, समय बिंदु उत्तेजना के बाद "टी" पर सेल शरीर या प्रक्रिया की लागत पर लाभ के एकीकृत घनत्व को मापने।
    3. पूर्व उत्तेजना प्रतिदीप्ति यों, एफ (सेल) = 0 टी, उसी तरह के रूप में सेल शरीर या प्रक्रिया की पूर्व प्रोत्साहन छवियों का विश्लेषणपोस्ट-उत्तेजना संकेत। एफ (सेल) = 0 टी निर्धारित करने के लिए 3 छवियों का मतलब एकीकृत घनत्व का प्रयोग करें।

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Representative Results

GCaMP कैल्शियम सूचक आनुवंशिक रूप से Gr68a-Gal4 या ppk23-Gal4 ड्राइवरों का उपयोग व्यक्त की गई थी। अगली टांग न्यूरॉन्स और गैर तंत्रिका कोशिकाओं के समर्थन अलग आबादी प्रत्येक चालक (चित्रा 3 ए सी) द्वारा चिह्नित कर रहे हैं। Lipophilic फेरोमोन CH503 ligand-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं Gr68a-Gal4 में मनाया गया और ppk23-Gal4 कोशिकाओं GCaMP (चित्रा 3 डी) व्यक्त। GCaMP5G संकेत (ΔF / एफ) के प्रतिदीप्ति तीव्रता में रिश्तेदार परिवर्तन और CH503 (चित्रा 3E) की उच्च सांद्रता के साथ वृद्धि हुई है। दिलचस्प बात यह है CH503 के 5 एनजी खुराक तंत्रिका प्रतिक्रिया को दबा सकते हैं।

Gr68a और ppk23 न्यूरॉन्स अलग प्रतिक्रिया पैटर्न का प्रदर्शन किया। Gr68a न्यूरॉन्स, न्यूरोनल प्रतिक्रिया का एक टॉनिक पैटर्न (चित्रा 3F) से पता चला है, जबकि ppk23 न्यूरॉन्स एक phasic, oscillatory प्रतिक्रिया (चित्रा 3 जी) से पता चला है। एक सूंड में ppk23 न्यूरॉन्स से प्रतिक्रियाओं थेLSO इस तैयारी का उपयोग करके मापा और phasic और oscillatory प्रतिक्रियाओं (चित्रा 3H) का एक संयोजन का प्रदर्शन किया।

आकृति 1
चित्रा 1:। GCaMP कैल्शियम इमेजिंग तकनीक के बुनियादी सिद्धांत GCaMP5G आनुवंशिक रूप से Gal4 में व्यक्त किया जाता है कोशिकाओं -labeled और neuronal उत्तेजना से पहले कम तीव्रता के साथ fluoresces। एक प्रोत्साहन के आवेदन न्यूरॉन में एक संभावित कार्रवाई से चलाता है और सीए 2 बाढ़ का कारण बनता है। GCaMP5G, एक बार सीए 2 के लिए बाध्य है, एक गठनात्मक बदलाव आए, बढ़ प्रतिदीप्ति (ΔF), जो समय के साथ परिवर्तन के परिणामस्वरूप। आधारभूत प्रतिदीप्ति (एफ) उत्तेजना से पहले फ्लोरोसेंट संकेत तीव्रता को दर्शाता है।

चित्र 2
चित्रा 2: अगली टांग या सूंड न्यूरॉन्स की इमेजिंग के लिए एक जीवित मक्खी बढ़ते।(ए) अगली टांग बढ़ते: एक जीवित नर मक्खी की एक 3.2x छवि, forelegs टेप के साथ coverslip को बांधा दिखा। (बी) मक्खी की एक 40X छवि, टखने की हड्डियों खंडों (T1-5) और पहली टखने की हड्डियों खंड ऊपर और पांचवें टखने की हड्डियों खंडों पर टेप की नियुक्ति की प्रत्येक दिखा। (सी) सूंड बढ़ते: टेप का एक टुकड़ा मंच पर रखा गया है सूंड की नोक बेनकाब करने के लिए। (डी) प्रोत्साहन इसके लिए विंदुक टिप मक्खी से थोड़ा ऊपर आयोजित किया जाता है और तैयारी के साथ सीधा संपर्क नहीं है।

चित्र तीन
चित्रा 3:। GCaMP व्यक्त न्यूरॉन्स में Pheromone प्रेरित तंत्रिका प्रतिक्रियाओं (ए) ड्रोसोफिला के पुरुष अगली टांग Gr68a-Gal4 के स्थानिक पदों दिखाने का योजनाबद्ध पर टखने की हड्डियों खंडों T2-4 कोशिकाओं लेबल। गैर-तंत्रिका कोशिकाओं (आकार और आकार के आधार पर पहचान) सह रहे हैंपीले lored। (बी) पुरुष Gr68a-Gal4 चालक द्वारा लेबल तंत्रिका कोशिकाओं और समर्थन दिखा अगली टांग कच्चा फ्लोरोसेंट छवि। स्केल बार 50 माइक्रोन =। (सी) ड्रोसोफिला के पुरुष अगली टांग के स्थानिक पदों दिखा योजनाबद्ध ppk23-Gal4 पर टखने की हड्डियों खंडों T2-4 लेबल की कोशिकाओं। (डी) CH503 के लिए Gr68a- और ppk23 व्यक्त टी -4 न्यूरॉन्स की प्रतिक्रिया (रासायनिक संरचना से ऊपर दिखाया गया है)। औसत ΔF CH503 के जवाब में / एफ औसत ΔF की तुलना में था / PBST की एफ निम्नलिखित आवेदन अकेले विलायक; (Gr68a के लिए) असमान विचरण या मान व्हिटनी परीक्षण (ppk23 के लिए) के साथ छात्र के टी परीक्षण: * पी <0.05, *** पी <0.001। त्रुटि सलाखों SEM सांख्यिकीय शक्ति को दर्शाती = 0.93। (ई) Δ एफ / एफ में एक खुराक पर निर्भर परिवर्तन टी -4 में Gr68a न्यूरॉन्स में मनाया जाता है। असमान विचरण के साथ छात्र के टी परीक्षण: ** पी <0.01, *** पी <0.001। सांख्यिकीय शक्ति = 0.86-0.96। (एफ (G) एक रंग कोडित समय एक oscillatory दिखा बेशक, ppk23 व्यक्त न्यूरॉन्स की CH503 उत्तेजना (500 एनजी) निम्नलिखित GCaMP प्रतिदीप्ति में phasic प्रतिक्रिया। अगली टांग पर न्यूरॉन्स के पदों पर कच्चे फ्लोरोसेंट छवि (बाएं) में दिखाया जाता है। स्केल पट्टी: 10 माइक्रोन; समय के पैमाने: 0-96 सेकंड। साथ लाइन ग्राफ एक फोड़ CH503 के 500 एनजी द्वारा उत्तेजना के लिए एक ppk23 न्यूरॉन से प्रतिक्रिया से पता चलता। लाल तीर जो समय पर प्रोत्साहन जोड़ा गया है इंगित करता है। शिखर respoएनएसई 76 सेकंड पर होता है। (एच) सेल शरीर से एक देर शुरुआत टॉनिक प्रतिक्रिया और CH503 उत्तेजना (500 एनजी) के बाद एक axonal प्रक्षेपण से एक oscillatory प्रतिक्रिया दिखा सूंड पर ppk23 व्यक्त न्यूरॉन्स की एक कलर-कोडेड समय बेशक। कोशिकाओं के पदों पर कच्चे फ्लोरोसेंट छवि (बाएं) में दिखाया जाता है। स्केल बार = 10 माइक्रोन; समय के पैमाने: 0-96 सेकंड। शंकर, एस, एट अल से अनुमति के साथ Reproduced। neuropeptide tachykinin एक स्वाद तंत्रिका सर्किट में फेरोमोन का पता लगाने के लिए आवश्यक है। डोई:। 10.7554 / eLife.06914 (2015) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

विलायक 1,2 सीएच 5 की घुलनशीलता 0 3 3 विलायक अकेले ट्रिगर neuronal गतिविधि करता है? 4
0.1% PBST हाँ नहीं
100% इथेनॉल हाँ हाँ
100% हेक्सेन हाँ हाँ
10% इथेनॉल नहीं (टेस्ट नहीं हुआ)
10% हेक्सेन नहीं (टेस्ट नहीं हुआ)
100% DMSO हाँ हाँ
10% DMSO हाँ हाँ
0.4% DMSO हाँ हाँ
0.2% DMSO हाँ हाँ

तालिका 1:। विभिन्न सॉल्वैंट्स में सीएच 5 0 3 की घुलनशीलता 1 DMSO:। डाइमिथाइल sulfoxide 2 इथेनॉल, हेक्सेन, और DMSO समाधान में DH 2 से पतला हे (वी / वी) 0.2% DMSO में CH503 के 3 घुलनशीलता सीमित था रहे थे। केवल 250 एनजी / एमएल। अकेले विलायक के साथ ΔF / एफ में 4 वृद्धि हुई है कि obser के बराबर थाफेरोमोन के साथ उत्तेजना पर वेद।

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Discussion

हम यहाँ 2 अलग संवेदी अंगों में ड्रोसोफिला परिधीय न्यूरॉन्स की कैल्शियम इमेजिंग लाइव प्रदर्शन करने के लिए एक विधि का वर्णन। सीए 2 Gr68a-न्यूरॉन्स फेरोमोन ligand CH503 खुराक पर निर्भर है और मात्रात्मक थे द्वारा प्रेरित में GCaMP फ्लोरोसेंट प्रतिक्रियाओं -evoked। यह भी ऐसी phasic और टॉनिक प्रतिक्रियाओं के रूप में अलग तंत्रिका प्रतिक्रिया पैटर्न विचार करने के लिए संभव था।

phasic प्रतिक्रियाओं दिखा न्यूरॉन्स निरंतर उत्तेजनाओं को तेजी से अनुकूलन के लिए अनुमति देने के लिए माना जाता है। प्रतिक्रिया इस प्रकार की गंध का पता लगाने के 25 और लयबद्ध मोटर गतिविधि पैटर्न 26 की पीढ़ी के साथ संबद्ध किया गया है। इसके विपरीत, तंत्रिका दोलनों है, जो कई संवेदी प्रणाली में वर्णित किया गया है, एक भी पोस्टअन्तर्ग्रथनी साइट पर कई आदानों सिंक्रनाइज़ करने के लिए और प्रोत्साहन के बारे में 27 विशिष्ट सुविधाओं संप्रेषित करने के लिए लगा रहे हैं। ppk23 न्यूरॉन्स के साथ जुड़े दोलनों के आणविक आधार अभी तक नहीं बताया गया है, हमारे के.एन.owledge। Oscillatory प्रतिक्रियाओं दिखा उत्तेजनीय कोशिकाओं के अन्य प्रकार में, दोलनों की आवृत्ति एक प्रक्रिया कैल्शियम प्रेरित कैल्शियम रिहाई 28 को बुलाया द्वारा विनियमित किया जा करने के लिए दिखाया गया है। इस प्रक्रिया में, कैल्शियम माध्यमिक दूत inositol triphosphate के नियंत्रण में आंतरिक दुकानों से जारी है, और अपनी रिहाई की आवृत्ति बाह्य प्रेरणा की शक्ति पर निर्भर है। टॉनिक न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं के आणविक आधार में इनसाइट्स सी की ऑक्सीजन संवेदन रिसेप्टर्स पर अध्ययन से प्राप्त की गई है एलिगेंस 29। न्यूरॉन्स के भीतर कैल्शियम के स्तर में एक लंबे समय तक वृद्धि एल प्रकार वोल्टेज gated कैल्शियम चैनल, ryanodine, और inositol triphosphate संकेत दे रास्ते 29 द्वारा मध्यस्थता हो पाया था। यह पता लगाने के लिए इसी तरह के तंत्र ppk23 न्यूरॉन्स की प्रतिक्रिया में एक भूमिका निभाते हैं कि क्या महत्वपूर्ण होगा।

लाइव कैल्शियम इमेजिंग के अन्य आबादी के अध्ययन के लिए कई मायनों में अनुकूलित किया जा सकता यूएएस TRPA1 या यूएएस Shibire टीएस जैसे तापमान के प्रति संवेदनशील transgenes का उपयोग कर neuronal गतिविधि मुंह बंद करने, और उत्तेजना 4 पर इन न्यूरॉन्स में प्रतिदीप्ति में इसी परिवर्तन को मापने के लिए आदर्श होगा। चौथा, छवि संग्रह के लिए एक सतत समय श्रृंखला का उपयोग तेजी से जवाब कोशिकाओं का पता लगाने की सुविधा कर सकते हैं। अंत में, लक्षित लेजर रोशनी के अलावा के साथ, इस पद्धति ऐसी FRAP और झल्लाहट के रूप में अन्य उन्नत लाइव सेल इमेजिंग तरीकों के साथ प्रयोग के लिए विस्तारित किया जा सकता है।

कई तकनीकी विचार केराशन स्थिर छवियों को प्राप्त करने के लिए है और इसे सही शारीरिक प्रतिक्रियाओं के समय पाठ्यक्रम को मापने के लिए जरूरी हैं। सबसे पहले, अगली टांग सुरक्षित रूप से तैनात किया जाना चाहिए के बाद से मक्खी समाधान है, जो की तैयारियों के बीच भिन्नता का एक स्रोत हो सकता है के अलावा पर जोरदार आंदोलन को दर्शाती है। हालांकि फेरोमोन समाधान के स्नान आवेदन ligand उजागर टखने की हड्डियों खंडों पर स्वाद sensilla के सभी तक पहुँचने के लिए अनुमति देता है, समाधान के कुछ मुहिम शुरू की तैयारी के अन्य भागों की ओर प्रवाह कर सकते हैं। इसके अलावा, अगली टांग संभावित दूर बहाव सकता है जब समाधान जोड़ा जाता है। दूसरा, सही छवि के पास तात्कालिक प्रतिदीप्ति में बढ़ जाती है, यह महत्वपूर्ण प्रोत्साहन के अलावा के बाद तुरंत इमेजिंग फिर से शुरू करने के बाद से कुछ न्यूरॉन्स उत्तेजना के 4 सेकंड के भीतर एक तेजी से और अधिक से अधिक प्रतिक्रिया दिखाने के लिए है। वैकल्पिक रूप से, एक सतत समय श्रृंखला प्रोत्साहन समाधान है, और सटीक समय बिंदु है जिस पर प्रोत्साहन प्रशासित किया जाता है चिह्नित किया जा सकता जोड़ने से पहले शुरू किया जा सकता है।

लड़की = "jove_content"> झूठी सकारात्मक प्रतिक्रियाओं के दो सूत्रों मनाया गया। सबसे पहले, विलायक खुद भी एक ligand के अभाव में फ्लोरोसेंट प्रतिक्रियाओं पैदा कर सकते हैं। PBST विलायक कुछ ppk23-Gal4 लेबल की कोशिकाओं में ऐसी प्रतिक्रिया का कारण बना। इसके अलावा, DMSO, ध्रुवीय और ध्रुवहीन अणुओं के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया विलायक, यह भी कुछ Gr68a-Gal4 लेबल न्यूरॉन्स में एक प्रतिक्रिया प्रेरित किया। यह निर्धारित करने के लिए विलायक अपने आप में एक फ्लोरोसेंट संकेत लाती है कि क्या और कम पृष्ठभूमि गतिविधि के साथ एक विलायक प्रणाली का चयन करने के लिए इसलिए आवश्यक है। दूसरा, गैर तंत्रिका कोशिकाओं समर्थन में एक मजबूत phasic प्रकार प्रतिक्रिया अकेले विलायक PBST को मनाया गया। Gr68a-Gal4 चालक दोनों न्यूरॉन्स और समर्थन कोशिकाओं है कि न्यूरॉन्स की और सामान्य रूप से कुछ को चारों ओर दिखाई में व्यक्त किया जाता है, बड़ा, amorphously आकार के हैं, और दृश्य के अनुमानों की कमी है। यह प्रत्येक Gal4 लाइन के लिए गैर-न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं से तंत्रिका अंतर करने के लिए जब ROIs का चयन इसलिए महत्वपूर्ण है।

_content "> इस विधि से एक प्रमुख सीमा है कि एक ही मक्खी तैयारी क्रमिक प्रयोग विभिन्न सांद्रता या ligands के प्रकार, जब तक लागू किया प्रोत्साहन पहले अच्छी तरह से coverslip की सतह से हटा दिया जाता है का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है, यह विधि है। इसके अलावा उच्च बढ़ाई ड्रोसोफिला न्यूरॉन्स के दृश्य के लिए की जरूरत है, और तेजी से अधिग्रहण और उच्च समय संकल्प के लिए आवश्यकता के कारण एक बार में कई मक्खियों के उच्च throughput इमेजिंग के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। अंत में, इस विधि ट्रांसजेनिक जीन अभिव्यक्ति के लिए आनुवंशिक उपकरणों की उपलब्धता की आवश्यकता है , इस प्रकार मुख्य रूप से प्रमुख मॉडल जीवों के लिए आवेदन सीमित।

कुल मिलाकर, इस विधि इलेक्ट्रोड का उपयोग सेलुलर रिकॉर्डिंग करने के लिए एक आसान विकल्प है और विशेष इंस्ट्रूमेंटेशन की आवश्यकता नहीं है। इसके अलावा, इस तरह के CaLexA के रूप में अन्य आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग संवाददाताओं के विपरीत, पशु जिंदा इमेजिंग शारीरिक प्रतिक्रियाओं की इजाजत देने भर रखा है पुनः में मापा जानासभी उम्र की मक्खियों में उच्च संवेदनशीलता के साथ अल-समय। यह सुविधा संभावित ligands या सामाजिक स्थिति या प्रजनन राज्य में परिवर्तन के बाद तंत्रिका प्रतिक्रियाओं की तुलना करने के लिए उम्र पर निर्भर प्रतिक्रियाओं की स्क्रीनिंग के लिए अनुमति दे सकता है। इसके अलावा, निरंतर रिकॉर्डिंग स्पष्ट photobleaching या GCaMP संकेत के ठहरनेवाला बिना कम से कम 10 मिनट के लिए किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gr68a-Gal4 Gift from H. Amrein (Texas A&M Health Science Center, TX, USA) and J. Carlson (Yale University, CT, USA)
ppk23-Gal4 Gift from K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA)
UAS-GCaMP5  42037 Bloomington Drosophila  Stock Center
0.17 mm coverslip (Gold-Seal coverslip) Electron Microscopy Services 63790-10
Nail polish, "Hard as Nails Clear"  Sally Hansen
PAP pen Sigma-Aldrich  Z377821
Paint brush fine-tipped brush
Tape  Scotch brand
Triton X-100 Sigma-Aldrich  13021
Ethanol, lab grade Merck 10094
Hexane, HPLC grade Sigma-Aldrich  H303SK-4
DMSO Sigma-Aldrich  472301
PBST Recipe described in the protocol section
CH503 Synthesis described in Mori et al., 2010
sCMOS Camera (ORCA Flash4.0) Hamamatsu  C11578-22U
Microscope (Ti-Eclipse) Nikon Ni-E
Spinning Disk Scan head  Yokogawa CSU-X1-A1
Aquistion Software (MetaMorph Premier) Molecular Devices 40002
Fiji software open source http://fiji.sc/Fiji

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 110, फेरोमोन स्वाद जीना अगली टांग सूंड कैल्शियम इमेजिंग GCaMP लिपिड रिसेप्टर
मापने की शारीरिक प्रतिक्रियाओं<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; लिपिड फेरोमोंस के लिए संवेदी न्यूरॉन्स लाइव कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग
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Shankar, S., Calvert, M. E. K., Yew, … More

Shankar, S., Calvert, M. E. K., Yew, J. Y. Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging. J. Vis. Exp. (110), e53392, doi:10.3791/53392 (2016).

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