Abstract
A diferencia de los mamíferos, insectos, tales como Drosophila tienen múltiples órganos del gusto. Las neuronas quimiosensriales en las piernas, trompa, las alas y ovipositor de Drosophila expresan receptores gustativos 1,2 canales iónicos, 3-6, y los receptores ionotrópicos 7 que están involucrados en la detección de señales sensoriales volátiles y no volátiles. Estas neuronas en contacto directamente con estimulantes del gusto tales como alimentos, sustancias nocivas y las feromonas y por lo tanto influyen muchos comportamientos complejos tales como la alimentación, la puesta de huevos y el apareamiento. grabaciones de electrodos y de imágenes de calcio se han usado ampliamente en los insectos para cuantificar las respuestas neuronales evocadas por estos estimulantes del gusto. Sin embargo, la electrofisiología requiere un equipo especializado y las mediciones de obtener de una sola sensillum sabor puede ser técnicamente difícil dependiendo del tipo de células, tamaño y posición. Además, la resolución de la neurona individual en Drosophila puede ser difícil de lograr ya que Hou sabor sensillase más de un tipo de neurona quimiosensorial. El método de formación de imágenes en vivo de calcio descrito aquí permite respuestas de las neuronas gustativas individuales en moscas vivas que han de medirse. Este método es especialmente adecuado para obtener imágenes de las respuestas neuronales a las feromonas de lípidos y otros tipos de ligandos que tienen baja solubilidad en disolventes a base de agua.
Introduction
Los animales dependen de la información olfativa y gustativa para mediar en las decisiones esenciales para la supervivencia y la reproducción. La comprensión de cómo las señales chemosensory se detectan y procesan por el sistema nervioso requiere la identificación del receptor (s) sensorial y los correspondientes ligandos químicos. Drosophila detectar una asombrosa variedad de compuestos volátiles y no volátiles y son un excelente modelo en el que estudiar la fisiológico mecanismos que subyacen chemosensation. Mientras que los órganos olfativos perciben moléculas volátiles, los órganos gustativos están especializados para detectar compuestos de baja volatilidad. A continuación, presentamos un método para medir directamente las respuestas neuronales a partir de los órganos del gusto de Drosophila melanogaster a baja volatilidad, los ligandos lipofílicos.
órganos gustativos de la marcha incluyen las patas delanteras, trompa, y las alas. Distribuida en la superficie de los órganos del gusto son estructuras similares a pelos conocidos como sensilla que responden a sugars, amargos, sales, agua y feromonas 8. El sensilla han sido clasificadas morfológicamente en cerdas de sabor y gusto clavijas 9. Hay alrededor de 31 cerdas gustativas en el labelo, que se clasifican en el (tipo L) de largo, corto (de tipo s) y morfologías intermedias (de tipo I). Sensilla casa 4 neuronas sensoriales de los 'l' y 's' que responden fisiológicamente al azúcar (la celda S), bajas en sal (la celda L1), alto contenido de sal y compuestos amargos (la celda L2) y agua (la célula W) 10 , 11. La "i" casa 2 neuronas sensoriales sensilla, uno de los cuales responde tanto a baja en sal y azúcar, mientras que el otro responde a alta concentración de sal 12. Hay aproximadamente 41 sensilla gusto en los hombres y 26 en las mujeres sensilla distribuidos en cada una de las patas delanteras. Por tanto machos como hembras, hay 21 sensilla en el midleg, y alrededor del 22 sensilla en la pata trasera 13. Las neuronas gustativas cerrados por la sensilla gusto en las piernas también son classified en tipos L1, L2, W y S.
Un método estándar para medir la actividad eléctrica de las neuronas individuales utiliza electrodos extracelulares o intracelulares para grabar el flujo de iones. Mediciones de electrodos permiten la función neuronal que se estudiará en organismos modelo tales como especies de Drosophila, polillas y abejas que carecen de amplias herramientas genéticas para el etiquetado de los nervios. Sin embargo, mientras que los métodos electrofisiológicos se han utilizado habitualmente para medir la actividad de Drosophila sabor sensilla 4,13,14, la aplicación de este enfoque presenta varios retos técnicos. En primer lugar, el sabor cerdas deben ser identificados en base a la morfología y ubicación espacial. Tras la identificación, las mediciones electrofisiológicas pueden verse limitadas por el pequeño tamaño de la sensilla, con acceso limitado debido a la posición, y la dificultad en la aplicación de volúmenes controlados de un estímulo químico de una muestra de cerdas. Además, la estimulación de sensilla puede generar señales de más de unaneuronal de tipo 15. En segundo lugar, la detección de señales eléctricas puede ser confundida por el ruido de fondo resultante de las vibraciones mecánicas y el ruido de los equipos electrónicos. En tercer lugar, el uso de un electrodo de afilado puede dañar la preparación mosca, si se usa incorrectamente 14. Por último, el montaje de una plataforma de electrofisiología requiere componentes electrónicos especializados para la entrega de estímulos, la grabación de la señal, y el análisis de datos y puede ser costoso.
En D. melanogaster, la disponibilidad de herramientas codificados genéticamente ha facilitado el desarrollo de técnicas de imagen que permiten estudiar las respuestas de pequeñas poblaciones de neuronas. Uno de estos métodos es el uso del reportero Calexa 16. En este método, las secuencias de genes que codifican el factor de transcripción LexA-VP16 y una sensible al calcio NFAT proteínas se fusionan juntos. la activación de calcio de la fosfatasa calcineurina cataliza la fosforilación de de-NFAT y, a su vez, faciTES su importación en el núcleo. Dentro del núcleo, el dominio LexA se une a un motivo de unión LexAop-DNA que dirige la expresión de un reportero de la proteína fluorescente verde (GFP), permitiendo así la identificación sostenida de las neuronas funcionalmente activados. El enfoque ha sido utilizado con éxito para medir la respuesta de los glomérulos olfativo específico en el lóbulo antenal después de la exposición de las moscas en vivo a un odorante 16. Recientemente, las respuestas fisiológicas de los receptores gustativos IR52c neuronas se miden a partir de moscas vivas utilizando Calexa 7. Sin embargo, para este estudio, fue necesario moscas de edad para un máximo de 6 semanas para mejorar la transcripción de GFP. Mientras inmunotinción con un anticuerpo anti-GFP se puede utilizar para aumentar la señal Calexa, este método requeriría la fijación del tejido, impidiendo así la posibilidad de formación de imágenes de células vivas.
El calcio GCaMP proteína indicador codificado genéticamente también se ha utilizado ampliamente para estudiar las respuestas neuronales en un número de17 especies. El GCaMP proteína fluorescente de baja intensidad antes de la estimulación neuronal. La aplicación de un estímulo desencadena un potencial de acción en la neurona, resultando en la afluencia de Ca2 +. GCaMP, unido a Ca 2 +, sufre un cambio conformacional, haciendo que se fluorescencia con una intensidad más brillante (Figura 1). Se utilizó un enfoque de imágenes de calcio de una sola neurona recientemente desarrollado para identificar la glucosa como el ligando para las neuronas gustativas Gr61a específicos pata delantera 18. En este estudio, las patas delanteras disecados de Drosophila transgénica que expresa GCaMP en las neuronas gustativas Gr61a se cubrieron con una capa de agarosa antes de la imagen. Sin embargo, el uso de tejido diseccionado puede causar eventual resumen de expresión GCaMP, limitando así el tiempo de medición y la sensibilidad de detección. Además, puede limitar la sensibilidad de agarosa debido a los altos niveles de fondo de fluorescencia y sus propiedades de dispersión de la luz.
To tratar algunos de estos inconvenientes, se describe el uso de imágenes de calcio mediada por GCaMP para registrar las respuestas fisiológicas de la pata delantera y el trompa neuronas gustativas de los animales intactos. Mostramos las respuestas fisiológicas de Gr68a y neuronas que expresan ppk23 codificado genéticamente GCaMP5G 19 a una feromona de lípidos Drosophila, (3 R, 11 Z, 19 Z) -3-acetoxi-11,19-octacosadien-1-ol (CH503) 20, 21. Las respuestas neuronales se miden mediante la cuantificación del aumento de la fluorescencia de la señal GCaMP5G durante la estimulación de feromonas. En este protocolo, las neuronas se crean imágenes para una duración total de 120 seg, que es suficiente para diferenciar los patrones de activación neuronal en células individuales.
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Protocol
1. Preparación de muestras
- Cruzar la línea Gal4 3,22 controlador de UAS-GCaMP5G 19 moscas (1118 w; P {20XUAS-IVS-GCaMP5G} attP40). Deje que la cruz de crecer a 25 ° C.
Nota: Generación vuela con múltiples copias de los transgenes o Gal4 UAS-GCaMP puede ayudar a aumentar la intensidad de la señal fluorescente. Una versión anterior del transgén UAS-GCaMP (UAS-GCaMP3) mostró intensidad de fluorescencia muy débil cuando se expresa bajo el control del controlador de Gr68a-Gal4.- Recoger y separada por sexo recién eclosed moscas adultas y elevar a 25 ° C.
Nota: El nivel básico de GCaMP5G florescencia es óptima en las moscas de edades comprendidas entre los 14-28 días. El aislamiento de las moscas por sexo se opone a la posibilidad de interacciones sociales que pueden influir en las respuestas neuronales.
- Recoger y separada por sexo recién eclosed moscas adultas y elevar a 25 ° C.
- Anestesiar a una mosca en una corriente suave de CO 2.
- Una el fLy a un cubreobjetos de vidrio colocando primero una pequeña gota de esmalte de uñas en el centro de un 0,17 mm cubreobjetos. Con cuidado, coloque una mosca en su lado de la gota de esmalte de uñas transparente y asegurar que toda la gota está cubierto por la mosca.
- Realice los pasos 1.5 y 1.6 bajo un microscopio estereoscópico de disección, que se utiliza con una ampliación de 8X.
- Utilice una brocha húmeda para extender una pata delantera de la mosca. Asegure la pata delantera en su posición mediante la colocación de dos finas tiras de cinta adhesiva sobre la primera y quinta segmentos tarsales (Figura 2A). Esto expondrá segmentos tarsales T2-T4 para formación de imágenes (Figura 2B).
- Para neuronas imagen de la trompa, coloque una tira delgada de cinta adhesiva sobre la tribuna de la trompa para exponer el labelo (Figura 2 C, D).
- Dibuje una barrera hidrofóbica alrededor de la mosca con un bolígrafo PAP para evitar que la solución fluya sobre la superficie del cubreobjetos. Hacer mediciones dentro de los 30 minutos de montaje.
2. Preparación de EstímuloSolución
- Diluir ligandos lipófilos (como CH503, utilizado en este estudio) en una solución PBST: NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4, 0,1% de Triton X-100 (v / v ); pH 7,4.
- Hacer una solución madre de 1 mg / ml del ligando usando PBST. Preparar todas las diluciones posteriores de la solución madre usando PBST.
Nota: Dependiendo de la solubilidad del ligando de interés, pueden ser necesarias diferentes disolventes para disolver el ligando. La solubilidad de CH503 en diversos disolventes se describe en la Tabla 1. A diferencia de otros disolventes, PBST no produjo un aumento en la fluorescencia.
- Hacer una solución madre de 1 mg / ml del ligando usando PBST. Preparar todas las diluciones posteriores de la solución madre usando PBST.
3. La estimulación de las neuronas y gustativa Adquisición de imágenes
- Usando una pipeta de 10 l, colocar 10 l de PBST en los segmentos tarsales.
Nota: Este paso humedece la pierna y evita que los segmentos tarsales a la deriva. - Utilice un sistema óptico que tiene una cámara de suficiente velocidad y sensibilidad para lograr una buena señal de fluorescencia a alta resolución en el tiempo.
NOTA: Para este estudio se utilizó un microscopio confocal de disco giratorio y una cámara sCMOS (ver Lista de Materiales). - Elija el segmento tarsal específico y neuronas para formar una imagen. Adquirir tres pre-estimulación confocal Z-pilas.
- Idealmente, los ajustes de adquisición de uso que son lo suficientemente rápido como para permitir la resolución tiempo máximo sin dejar de reflejar la totalidad del volumen celular. Ejemplo ajustes de adquisición son los siguientes: 200 mseg exposición, binning 2 x 2 y 6 x 0,5 m 2 secciones ópticas, capturados cada 2 s.
Nota: las piernas inmovilizadas han sido fotografiadas con éxito durante un máximo de 10 minutos, a intervalos de 30 seg, sin blanqueo discernible de la señal GCaMP. Para tiempos de grabación más largos, asegúrese de que las piernas se mantienen firmemente en su lugar en el cubreobjetos. - Optimizar la potencia del láser para la más alta relación señal-ruido alcanzable con photobleaching mínima durante toda la imabio de régimen. Para los experimentos descritos aquí, utilizar un diodo de láser 491 nm (100 mW) a la transmisión de 30% para obtener imágenes de las neuronas Gr68a y gustativas ppk23 en las piernas y proboscis. Utilice 2 x 2 binning para permitir tiempos de exposición más cortos sin dejar de lograr la suficiente resolución espacial.
Nota: Los ajustes de potencia láser fueron optimizados para permitir la detección del cambio de fluorescencia que van desde un aumento de 1.2 a 4.5 veces.
- Idealmente, los ajustes de adquisición de uso que son lo suficientemente rápido como para permitir la resolución tiempo máximo sin dejar de reflejar la totalidad del volumen celular. Ejemplo ajustes de adquisición son los siguientes: 200 mseg exposición, binning 2 x 2 y 6 x 0,5 m 2 secciones ópticas, capturados cada 2 s.
- Pipetear 10 l de la solución de estímulo en el segmentos tarsales. Para los experimentos de control, añadir otros 10 l de PBST. Inmediatamente adquirir 117 imágenes post-estimulación.
Nota: El número de imágenes post-estimulación adquiridos se basa en la cantidad de tiempo en el que se alcanzó el máximo cambio en la fluorescencia (aproximadamente 2 min).- Paso crítico: Mientras que la solución pipeteando en la preparación, no tocar la marcha con la punta de la pipeta ya que esto hará que la extremidad un movimiento fuera de posición.
Nota: Como alternativa, utiliceun micromanipulador para posicionar con precisión un capilar de vidrio que contiene estímulo cerca del segmento tarsal a explorar. Entregar volúmenes controlados de estímulo usando un dispensador de microinyección intracelular de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Paso crítico: Mientras que la solución pipeteando en la preparación, no tocar la marcha con la punta de la pipeta ya que esto hará que la extremidad un movimiento fuera de posición.
4. Procesamiento y Análisis de Imágenes: Cuantificación de la respuesta
- Abrir una serie de confocal Z-pilas utilizando Fiji ( http://fiji.sc/Fiji ) 23 o ImageJ ( http://imagej.nih.gov/ij/ ) análisis y procesamiento de imágenes de software 24.
- Hacer una proyección suma de intensidad de todos los seis rebanadas Z para cada uno de los 120 puntos de tiempo.
- Seleccionar la opción "Pila" en "Imagen". Además, seleccione la opción "proyección Z" e introduzca "1" como el segmento de inicio y "4" como rebanada de parada. Para el tipo de proyección, seleccione R20; suma rebanadas "en el menú desplegable y seleccione" Todos los marcos de tiempo ".
- Definir la región de interés (ROI) mediante el uso de la herramienta de selección a mano alzada para dibujar un límite alrededor de un cuerpo celular neuronal o proyección. Haga clic en la etiqueta "Analizar" y seleccione la opción "Administrador de retorno de la inversión" en "Herramientas".
- Cuantificar la fluorescencia del retorno de la inversión mediante la selección de la opción "Establecer mediciones", en el menú "Analizar" y marcando las casillas para la densidad integrada, área, media y máxima y valor de gris etiqueta. A continuación, seleccione la opción "Más" en el menú de gestor de retorno de la inversión, y además seleccionar la opción "Multi medida".
Nota: Esto generará un cuadro emergente con valores para cada uno de los parámetros seleccionados. - Compruebe los valores máximos de grises para asegurar que ninguno de los píxeles han alcanzado la saturación (por ejemplo, 65 535 para una cámara de 16 bits).
NOTA: Para los experimentos se muestra en tsus papel, las respuestas se midieron ya sea desde los cuerpos celulares neuronales o proyecciones, dependiendo de donde se observó el aumento máximo en Delta F / F. - Calcular el cambio relativo máximo en la fluorescencia (Delta F / F) en el punto de tiempo t es el siguiente:
- Restar el fondo de fluorescencia de cada valor F (celular). Para cuantificar la fluorescencia de fondo, medir la densidad integrada de una ROI de tamaño y la forma equivalente de una superficie de la pata delantera (o proboscis) desprovista de neuronas detectables.
- Para cuantificar la fluorescencia después de la estimulación, F (celular) t, medir la densidad integrada del retorno de la inversión del cuerpo celular o proceso en el punto de tiempo "t" después de la estimulación.
- Para cuantificar la fluorescencia pre-estimulación, F (celular) t = 0, analizar las imágenes pre-estímulo del cuerpo de la célula o proceso de la misma manera comola señal post-estimulación. Utilice la densidad integrada media de 3 imágenes para determinar F (celular) t = 0.
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Representative Results
El indicador de calcio GCaMP se expresó genéticamente utilizando conductores ppk23-Gal4 Gr68a-Gal4 o. Poblaciones distintas de neuronas pata delantera y células de apoyo no neuronales son etiquetados por cada conductor (Figura 3A-C). Se observaron respuestas-ligando específico a la feromona CH503 lipofílica en Gr68a-Gal4 y las células que expresan Gal4-ppk23 GCaMP (Figura 3D). El cambio relativo en la intensidad de fluorescencia de la señal GCaMP5G (Delta F / F) y aumentó con concentraciones más altas de CH503 (Figura 3E). Curiosamente, la dosis de 5 ng de CH503 puede suprimir la respuesta neural.
Gr68a y neuronas ppk23 mostraron diferentes patrones de respuesta. Gr68a neuronas mostraron un patrón tónico de la respuesta neuronal (Figura 3F), mientras que ppk23 neuronas mostraron una fásica, la respuesta oscilatoria (Figura 3G). Las respuestas de las neuronas ppk23 en la trompa eran unalso midió usando esta preparación y exhibió una combinación de fásicas y oscilatorios respuestas (Figura 3H).
Figura 1:. Principio básico de la técnica de imagen de calcio GCaMP GCaMP5G se expresa genéticamente en células Gal4 marcado con fluorescencia y con baja intensidad antes de la estimulación neuronal. La aplicación de un estímulo desencadena un potencial de acción en la neurona y hace que Ca 2 + afluencia. GCaMP5G, una vez unido a Ca 2 +, sufre un cambio conformacional, que resulta en aumento de fluorescencia (Df), que cambia con el tiempo. La fluorescencia de línea de base (F) se refiere a la intensidad de señal fluorescente antes de la estimulación.
Figura 2: Montaje de una mosca en directo para la imagen de la pata delantera o probóscide neuronas.(A) Montaje de la pata delantera: una imagen 3.2X de una mosca macho vivo, mostrando las patas delanteras atadas a la cubreobjetos con cinta adhesiva. A imagen de 40X de la mosca (B), mostrando cada uno de los segmentos del tarso (T1-5) y la colocación de la cinta por encima del primer segmento tarsal y en el quinto segmentos tarsales. (C) Montaje de la trompa: un trozo de cinta se coloca sobre la tribuna para exponer la punta de la trompa. (D) La punta de la pipeta para la adición de estímulo se mantiene ligeramente por encima de la marcha y no hace contacto directo con la preparación.
Figura 3:. Respuestas neuronales de feromonas inducida en las neuronas que expresan GCaMP (A) Esquema de la pata delantera macho de Drosophila que muestra las posiciones espaciales de Gr68a-Gal4 etiquetados células en los segmentos tarsales T2-4. Las células no neuronales (identificados en base al tamaño y forma) son colored amarilla. (B) Imagen de fluorescencia en bruto de la pata delantera de sexo masculino que muestra células neuronales y de apoyo marcadas por el conductor Gr68a-Gal4. Barra de escala = 50 micras. (C) Esquema de la pata delantera macho de Drosophila que muestra las posiciones espaciales de ppk23-Gal4 células marcadas en los segmentos tarsales T2-4. (D) Respuesta de Gr68a- y las neuronas que expresan T4 ppk23 a CH503 (estructura química se muestra arriba). El Delta F promedio / F en respuesta a CH503 se comparó con la media Delta F / F después de la aplicación de PBST disolvente solo; La prueba t de Student con una varianza desigual (por Gr68a) o la prueba de Mann-Whitney (para ppk23): * p <0,05, *** p <0,001. Las barras de error representan el poder estadístico sem = 0,93. (E) Un cambio dependiente de la dosis en Δ F / F se observó en las neuronas Gr68a en T4. La prueba t de Student con una varianza desigual: ** p <0,01, *** p <0,001. Potencia estadística = 0,86-0,96. (F (G) A lo largo del tiempo un código de colores que muestra un oscilatoria, respuesta fásica de la fluorescencia después de la estimulación GCaMP CH503 (500 ng) de las neuronas que expresan ppk23. Las posiciones de las neuronas en la pata delantera se muestran en la imagen fluorescente en bruto (izquierda). Barra de escala: 10 micras; escala de tiempo: 0-96 seg. El gráfico de líneas de la derecha muestra una respuesta estallido de una neurona ppk23 a la estimulación por 500 ng de CH503. La flecha roja indica la hora a la que se añadió el estímulo. El pico RESPONSE se produce a los 76 seg. (H) un curso de tiempo con código de color de las neuronas que expresan ppk23 en la trompa que muestran una respuesta tónica de inicio tardío desde el cuerpo celular y una respuesta oscilatoria de una proyección axonal después de la estimulación CH503 (500 ng). Las posiciones de las células se muestran en la imagen fluorescente en bruto (izquierda). Barra de escala = 10 micras; escala de tiempo: 0-96 seg. Reproducido con permiso de Shankar, S., et al. El neuropéptido taquiquinina es esencial para la detección de feromonas en un circuito neural gustativa. doi:. 10.7554 / eLife.06914 (2015) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| 1,2 disolvente | Solubilidad de CH 5 0 3 3 | ¿Tiene la actividad neuronal solo gatillo disolvente? 4 |
| 0,1% PBST | SÍ | NO |
| 100% Etanol | SÍ | SÍ |
| 100% de hexano | SÍ | SÍ |
| 10% Etanol | NO | (no probado) |
| 10% de hexano | NO | (no probado) |
| 100% de DMSO | SÍ | SÍ |
| 10% de DMSO | SÍ | SÍ |
| 0,4% de DMSO | SÍ | SÍ |
| 0,2% de DMSO | SÍ | SÍ |
Tabla 1:. Solubilidad de CH 5 0 3 en diversos disolventes 1 DMSO:. Dimetil sulfóxido 2 etanol, hexano, y soluciones de DMSO fueron en diluyó con dH 2 O (v / v) 3 Solubilidad de CH503 en 0,2% de DMSO se limitó. sólo para 250 ng / ml. 4 Aumento de Delta F / F con disolvente solo era equivalente a la observed a la estimulación con feromona.
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Discussion
Se describe aquí un método para realizar las imágenes en vivo de calcio de las neuronas periféricas de Drosophila en 2 órganos sensoriales diferentes. El Ca2 + -evoked respuestas fluorescentes GCaMP en Gr68a-neuronas inducidos por el ligando feromona CH503 eran dependientes de la dosis y cuantitativa. También era posible discernir diferentes patrones de respuesta neural tales como fásica y respuestas tónicas.
Se cree que las neuronas que muestran respuestas fásicas para permitir una rápida adaptación a los estímulos continuos. Este tipo de respuesta se ha asociado con detección de olor 25 y la generación de los patrones de actividad de motor rítmica 26. En contraste, se cree que las oscilaciones neuronales, que se han descrito en muchos sistemas sensoriales para sincronizar múltiples entradas en un único sitio postsináptica y para transmitir características específicas sobre el estímulo 27. La base molecular de las oscilaciones asociadas con las neuronas ppk23 aún no se ha informado, a nuestro knowledge. En otros tipos de células excitables que muestran respuestas oscilatorias, la frecuencia de las oscilaciones se ha demostrado ser regulado por un proceso llamado la liberación de calcio inducida por calcio 28. En este proceso, el calcio es liberado de los almacenes internos bajo el control del trifosfato de inositol mensajero secundario, y la frecuencia de su liberación depende de la fuerza del estímulo externo. Miradas en torno a las bases moleculares de las respuestas neuronales tónicas se han obtenido de los estudios sobre los receptores sensores de oxígeno de C. elegans 29. Se encontró un aumento prolongado de los niveles de calcio dentro de las neuronas estar mediada por voltaje de tipo L canales cerrados de calcio, de rianodina, y vías de señalización inositol trifosfato 29. Será importante para determinar si los mecanismos similares desempeñan un papel en las respuestas de las neuronas ppk23.
Imagen de calcio en vivo puede ser adaptada de varias maneras para el estudio de otras poblaciones de
Varios conside técnicaraciones son imprescindibles para obtener imágenes estables y para medir con precisión la evolución en el tiempo de respuestas fisiológicas. En primer lugar, la pata delantera se debe colocar de forma segura desde la marcha exhibe movimiento vigoroso tras la adición de la solución, que puede ser una fuente de variación entre las preparaciones. Aunque la aplicación de la solución de baño de feromona permite que el ligando para llegar a todos los sensilla gustativa en los segmentos tarsales expuestos, algo de la solución puede fluir hacia otras partes de la preparación montado. Además, la pata delantera potencialmente podría alejarse cuando se añade solución. En segundo lugar, con precisión la imagen casi instantáneas aumentos en la fluorescencia, es importante para reanudar la formación de imágenes inmediatamente después de la adición del estímulo ya que algunas neuronas muestran una respuesta rápida y máxima dentro de 4 segundos de estimulación. Alternativamente, una serie de tiempo continuo puede ser iniciada antes de añadir la solución de estímulo, y el punto de tiempo preciso en el que se administra el estímulo puede ser marcado.
lass = "jove_content"> Se observaron dos fuentes de respuestas positivas falsas. En primer lugar, el propio disolvente puede inducir respuestas fluorescentes, incluso en ausencia de un ligando. El disolvente PBST provocó una respuesta tan en algunas células ppk23-Gal4 etiquetados. Además, DMSO, un disolvente usado comúnmente para moléculas polares y apolares, también indujo una respuesta en algunas neuronas Gr68a-Gal4 etiquetados. Por tanto, es esencial para determinar si el propio disolvente induce una señal fluorescente y para seleccionar un sistema de disolventes con una baja actividad de fondo. En segundo lugar, se observó una fuerte respuesta de tipo fásica en las células de apoyo no neurales para el PBST disolvente solo. El conductor Gr68a-Gal4 se expresa tanto en las neuronas y células de soporte que aparecen para rodear algunas de las neuronas y, en general, son más grandes, en forma amorfa, y carecen de salientes visibles. Por tanto, es importante diferenciar neural de las respuestas no neuronales para cada línea Gal4 al elegir ROIs.
_content "> Una importante limitación de este método es que la misma preparación mosca no se puede utilizar para experimentos sucesivos para probar diferentes concentraciones o tipos de ligandos, a menos que el estímulo aplicado está primero remueve por completo de la superficie del cubreobjetos. Además, este método no se puede utilizar para obtener imágenes de alto rendimiento de varias moscas a la vez, debido a la alta ampliación necesaria para la visualización de las neuronas de Drosophila, y la necesidad de una rápida adquisición y resolución de tiempo alto. por último, este método requiere la disponibilidad de herramientas genéticas para la expresión del gen transgénico , lo que limita la aplicación principalmente a los grandes organismos modelo.En total, este método es una alternativa más fácil a las grabaciones celulares utilizando electrodos y no requiere instrumentación especializada. Además, a diferencia de otros reporteros genéticamente codificados como Calexa, el animal se mantiene viva a través de imágenes que permite respuestas fisiológicas que medirse en reAl tiempo con alta sensibilidad en las moscas de todas las edades. Esta característica podría potencialmente permitir la detección de las respuestas dependientes de la edad a ligandos o comparación de las respuestas neuronales siguientes cambios en las condiciones sociales o estado reproductivo. Por otra parte, las grabaciones se pueden realizar sostenidos durante al menos 10 minutos sin photobleaching o resumen de la señal GCaMP obvia.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gr68a-Gal4 | Gift from H. Amrein (Texas A&M Health Science Center, TX, USA) and J. Carlson (Yale University, CT, USA) | ||
| ppk23-Gal4 | Gift from K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA) | ||
| UAS-GCaMP5 | 42037 | Bloomington Drosophila Stock Center | |
| 0.17 mm coverslip (Gold-Seal coverslip) | Electron Microscopy Services | 63790-10 | |
| Nail polish, "Hard as Nails Clear" | Sally Hansen | ||
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Paint brush | fine-tipped brush | ||
| Tape | Scotch brand | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 13021 | |
| Ethanol, lab grade | Merck | 10094 | |
| Hexane, HPLC grade | Sigma-Aldrich | H303SK-4 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| PBST | Recipe described in the protocol section | ||
| CH503 | Synthesis described in Mori et al., 2010 | ||
| sCMOS Camera (ORCA Flash4.0) | Hamamatsu | C11578-22U | |
| Microscope (Ti-Eclipse) | Nikon | Ni-E | |
| Spinning Disk Scan head | Yokogawa | CSU-X1-A1 | |
| Aquistion Software (MetaMorph Premier) | Molecular Devices | 40002 | |
| Fiji software | open source | http://fiji.sc/Fiji |
References
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