Abstract
In tegenstelling tot zoogdieren, insecten zoals Drosophila hebben meerdere smaak organen. De chemosensory neuronen op de benen, slurf, vleugels en ovipositor van Drosophila uiten smaak receptoren 1,2, ionkanalen 3-6 en ionotrope receptoren 7 die betrokken zijn bij het opsporen van vluchtige en niet-vluchtige zintuiglijke signalen. Deze neuronen direct contact tastants zoals voedsel, schadelijke stoffen en feromonen en daardoor ook op vele complexe gedrag, zoals voeding, eieren leggen en paring. Elektrode opnames en calcium imaging zijn op grote schaal gebruikt bij insecten aan de neuronale reacties opgeroepen door deze tastants kwantificeren. Echter, elektrofysiologie vereist gespecialiseerde apparatuur en het uitvoeren van metingen van een enkele smaak sensillum kan technisch uitdagend zijn, afhankelijk van de cel-type, de grootte en positie. Bovendien kan enkel neuron resolutie in Drosophila moeilijk te bereiken, aangezien smaak sensilla house meer dan één type chemosensory neuron. De live calcium imaging hier beschreven methode maakt reacties van enkele smaak neuronen in levende vliegen te meten. Deze methode is vooral geschikt voor het afbeelden van neuronale reacties op lipide feromonen en andere ligand soorten die lage oplosbaarheid in water gebaseerde oplosmiddelen.
Introduction
Dieren vertrouwen op geur en smaak informatie om beslissingen essentieel voor de overleving en voortplanting bemiddelen. Begrijpen hoe chemosensory signalen worden gedetecteerd en verwerkt door het zenuwstelsel vereist identificatie van de sensorische receptor (en) en de overeenkomstige chemische liganden. Drosophila detecteren van een groot aantal vluchtige en niet-vluchtige verbindingen en zijn een uitstekend model waarin de fysiologische bestuderen mechanismen die ten grondslag liggen aan chemosensation. Terwijl de reukorganen waarnemen vluchtige moleculen, worden de smaak organen gespecialiseerd in het lage volatiliteit verbindingen te detecteren. Hier presenteren we een methode om neuronale antwoorden van de smaak organen van Drosophila melanogaster met lage vluchtigheid, lipofiele liganden direct te meten.
Smaak organen van de vlieg onder de voorpoten, slurf, en vleugels. Verspreid over het oppervlak van de smaak organen hair-achtige structuren bekend als sensilla die reageren op sugars, bitters, zouten, water en feromonen 8. De sensilla zijn morfologisch ingedeeld in smaak haren en smaak haringen 9. Er zijn ongeveer 31 smaak haren op de lip die zijn ingedeeld in de lange (l-type), korte (s-type) en tussenproduct (i-type) morfologie. De 'l' en 's' sensilla huis 4 sensorische neuronen die fysiologisch reageren op suiker (de S cel), zoutarm (de L1 cel), hoge zout en bitter verbindingen (de L2 cel) en water (de W-cel) 10 , 11. De 'i' sensilla huis 2 sensorische neuronen, waarvan er één reageert zowel laag zout en suiker, terwijl de andere reageert op een hoog zoutgehalte 12. Er zijn ongeveer 41 smaak sensilla bij mannen en 26 vrouwen in sensilla verdeeld zijn over de van de voorpoten. Voor zowel mannen als vrouwen, zijn er 21 sensilla de midleg, en ongeveer 22 sensilla het achterbeen 13. De smaak neuronen ingesloten door de smaak sensilla op de poten zijn ook classified in L1, L2, W en S vormen.
Een standaardwerkwijze voor het meten van elektrische activiteit van enkelvoudige neuronen gebruikt extracellulaire of intracellulaire elektroden ionenstroom nemen. Elektrode metingen laten neuronale functie in niet-model organismen te bestuderen zoals Drosophila species, motten, en de bijen die een uitgebreide genetische instrumenten voor neurale etikettering ontbreken. Echter, terwijl de elektrofysiologische methoden routinematig gebruikt om de activiteit meet van Drosophila smaak sensilla 4,13,14, de toepassing van deze aanpak biedt een aantal technische uitdagingen. Ten eerste, de smaak haren moeten worden geïdentificeerd op basis van de morfologie en de ruimtelijke locatie. Na identificatie, kan elektrofysiologische metingen worden belemmerd door de kleine omvang van de sensilla beperkt toegankelijk door het positie en moeilijkheden bij de toepassing van gecontroleerde hoeveelheden van een chemische stimulus om een smaak haren. Ook kunnen stimuleren sensilla signalen van meerdere genererenneuronale soort 15. Ten tweede kan de detectie van elektrische signalen worden verstoord door achtergrondgeluiden als gevolg van mechanische trillingen en het lawaai van elektronische apparatuur. Ten derde kan het gebruik van een scherp elektrode beschadigen vlieg preparaat, bij abnormaal 14 gebruikt. Tot slot, het samenstellen van een elektrofysiologie rig vereist gespecialiseerde elektronische componenten voor stimulus levering, signaal opname en data-analyse en kan kostbaar zijn.
In D. melanogaster, de beschikbaarheid van genetisch gecodeerde instrumenten heeft de ontwikkeling van beeldvormende technieken waarmee de reacties van kleine populaties van neuronen te bestuderen. Eén dergelijke benadering is het gebruik van de CaLexA reporter 16. In deze werkwijze worden gensequenties die coderen voor de LexA-VP16 transcriptiefactor en een calcium- gevoelig eiwit NFAT samengesmolten. Calcium activatie van het proteïne fosfatase calcineurine katalyseert het de fosforylering van NFAT en, op zijn beurt, FacilitaTES de invoer in de kern. In de kern, de LexA domein bindt aan een LexAOp-DNA-bindend motief dat de expressie van groen fluorescent eiwit (GFP) reporter verbindt, waardoor aanhoudende identificeren functioneel geactiveerde neuronen. De aanpak is met succes gebruikt om de reactie van specifieke olfactorische glomeruli in de antennaal kwab na blootstelling van levende vliegen een geurstof 16 meten. Onlangs, fysiologische reacties van IR52c smaak receptor neuronen werden gemeten tijdens live-vliegen met behulp van CaLexA 7. Voor deze studie was het noodzakelijk leeftijd vliegen tot 6 weken GFP transcriptie verhoogt. Terwijl immunokleuring met een anti-GFP antilichaam kan worden gebruikt om het signaal te versterken CaLexA zou deze methode fixatie van het weefsel vereisen, waardoor elke mogelijkheid van live cell imaging.
De genetisch gecodeerde eiwit calciumindicator GCaMP is ook uitgebreid gebruikt om neuronale respons studie in een aantal17 species. Het eiwit GCaMP fluoresceert met een lage intensiteit voorafgaand aan neuronale stimulatie. Toepassing van een stimulus veroorzaakt een actiepotentiaal in het neuron, waardoor de influx van Ca2 +. GCaMP, gebonden aan Ca2 +, ondergaat een conformationele verandering waardoor het fluoresceren met heldere intensiteit (Figuur 1). Een recent ontwikkelde één neuron calcium imaging aanpak werd toegepast om glucose identificeren als de ligand voor de voorpoot specifieke Gr61a smaak neuronen 18. In deze studie werden ontleed voorbenen uit transgene Drosophila expressie GCaMP in Gr61a smaak neuronen bedekt met een laag agarose vóór beeldvorming. Echter, kan het gebruik van ontleed weefsel uiteindelijke overzicht van GCaMP uitdrukking veroorzaken, waardoor het beperken van meettijd en detectie gevoeligheid. Bovendien kan agarose gevoeligheid tengevolge van de hoge achtergrondniveaus van fluorescentie en lichtverstrooiing eigenschappen.
To richten sommige van deze nadelen beschrijven we het gebruik van GCaMP gemedieerde calcium imaging fysiologische reacties van voorpoot en slurf smaak neuronen van intacte dieren nemen. We tonen de fysiologische reacties van Gr68a en ppk23 neuronen tot expressie genetisch gecodeerde GCaMP5G 19 een Drosophila lipide feromoon, (3R, 11 Z 19 Z) -3-acetoxy-11,19-octacosadien-1-ol (CH503) 20, 21. Neuronale responsen worden gemeten door het kwantificeren van de toename in fluorescentie van het signaal gedurende GCaMP5G feromoon stimulatie. In dit protocol wordt neuronen afgebeeld voor een totale duur van 120 seconden, wat voldoende is om patronen van neuronale activatie in individuele cellen differentiëren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Monstervoorbereiding
- Steek de Gal4 3,22 bestuurder lijn naar UAS-GCaMP5G 19 vliegt (w 1118; P {20XUAS-IVS-GCaMP5G} attP40). Laat het kruis te groeien bij 25 ° C.
Let op: Het genereren vliegt met meerdere kopieën van de Gal4 of UAS-GCaMP transgenen kan helpen om de fluorescentie intensiteit van het signaal te verbeteren. Een eerdere versie van de UAS-GCaMP transgen (UAS-GCaMP3) toonde zeer zwakke fluorescentie-intensiteit bij expressie onder de controle van de Gr68a-Gal4 driver.- Verzamelen en apart geslacht nieuw Bijlage In volwassen vliegen en te verhogen bij 25 ° C.
Let op: het basisniveau van GCaMP5G bloei is optimaal in vliegen tussen 14-28 dagen oud. Isoleren vliegen naar geslacht zich verzet tegen de mogelijkheid van sociale interacties die de neurale reacties kunnen beïnvloeden.
- Verzamelen en apart geslacht nieuw Bijlage In volwassen vliegen en te verhogen bij 25 ° C.
- Verdoven een vlieg onder een milde stroom van CO 2.
- Bevestig de fly om een glas dekglaasje door eerst het plaatsen van een kleine daling van nagellak in het centrum van een 0,17 mm dekglaasje. Plaats voorzichtig een vlieg op zijn kant op de daling van duidelijke nagellak en ervoor te zorgen dat de gehele daling wordt gedekt door de vlieg.
- Voer stap 1.5 en 1.6 onder een dissectie stereomicroscoop, gebruikt 8x vergroting.
- Gebruik een natte penseel om een voorpoot van de vlieg uit te breiden. Zet de voorpoot op zijn plaats door het plaatsen van twee dunne reepjes van tape over de eerste en de vijfde tarsal segmenten (Figuur 2A). Dit tarsale segmenten bloot T2-T4 imaging (figuur 2B).
- Om het beeld neuronen op de snuit, plaats een dunne strook van tape over de rostrum van de slurf naar de labellum (figuur 2C, D) bloot te leggen.
- Teken een hydrofobe barrière rond de vlieg met een PAP pen om te voorkomen dat oplossing uit stroomt over het dekglaasje oppervlak. Maak metingen binnen 30 minuten van de montage.
2. Voorbereiding van de StimulusOplossing
- Verdun lipofiele liganden (zoals CH503, in deze studie) in PBST oplossing: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2PO 4, 0,1% Triton X-100 (v / v ); pH 7,4.
- Maak een 1 mg / ml voorraadoplossing van de ligand via PBST. Bereid alle daaropvolgende verdunningen van de voorraad oplossing met behulp van PBST.
Opmerking: Afhankelijk van de oplosbaarheid van het ligand van belang kan verschillende oplosmiddelen nodig zijn om de ligand te lossen. De oplosbaarheid van CH503 in verschillende oplosmiddelen wordt beschreven in tabel 1. In tegenstelling tot andere oplosmiddelen leverde PBST niet tot een toename in fluorescentie.
- Maak een 1 mg / ml voorraadoplossing van de ligand via PBST. Bereid alle daaropvolgende verdunningen van de voorraad oplossing met behulp van PBST.
3. Stimuleren van Smaak neuronen en Image Acquisition
- Met behulp van een 10 ul pipet wordt 10 pl PBST op de tarsale segmenten.
Opmerking: Deze stap bevochtigt het been en voorkomt dat de tarsal segmenten afglijden. - Gebruik een optisch systeem dat een camera van su heeftfficient snelheid en gevoeligheid voor goede fluorescentie-signaal op de hoogste tijd resolutie te bereiken.
Opmerking: Voor deze studie gebruikten we een draaiende schijf confocale microscoop en een sCMOS camera (zie Materials List). - Kies de specifieke tarsal segment en neuronen af te beelden. Acquire drie pre-stimulatie confocale Z-stacks.
- In het ideale geval gebruik overname instellingen die zijn snel genoeg om maximale tijdsresolutie mogelijk maken, terwijl nog steeds de gehele cel volume vastleggen. Voorbeeld overname instellingen zijn: 200 msec blootstelling, binning 2 x 2 en 6 x 0,5 micrometer 2 optische secties, gevangen om de 2 sec.
Opmerking: Geïmmobiliseerde poten succes afgebeeld tot 10 minuten, bij 30 sec intervallen, zonder waarneembare bleking van de GCaMP signaal. Voor een langere opnameduur, ervoor te zorgen dat de poten zeer stevig worden gehouden in plaats op het dekglaasje. - Optimaliseren laservermogen voor de hoogste signaal-ruisverhouding worden bereikt met minimale fotobleken tijdens de gehele IMAGing regime. Voor de hier beschreven experimenten, gebruik maken van een 491 nm diodelaser (100 mW) bij 30% transmissie voor beeldvorming zowel Gr68a en ppk23 smaak neuronen op de benen en de slurf. Gebruik 2 x 2 binning om voor kortere belichtingstijden, terwijl nog steeds het bereiken van voldoende ruimtelijke resolutie.
Opmerking: Het laservermogen instellingen zijn geoptimaliseerd voor de detectie van fluorescerende verandering, variërend van een 1,2- tot 4,5-voudige toename mogelijk.
- In het ideale geval gebruik overname instellingen die zijn snel genoeg om maximale tijdsresolutie mogelijk maken, terwijl nog steeds de gehele cel volume vastleggen. Voorbeeld overname instellingen zijn: 200 msec blootstelling, binning 2 x 2 en 6 x 0,5 micrometer 2 optische secties, gevangen om de 2 sec.
- Pipetteer 10 ul van de oplossing op de stimulus tarsale segmenten. Voor controle-experimenten, voeg nog eens 10 pl PBST. Onmiddellijk verwerven 117 post-stimulatie beelden.
Opmerking: Het aantal post-stimulatie beelden die is gebaseerd op de hoeveelheid tijd waarin de maximale verandering in fluorescentie was bereikt (ongeveer 2 minuten).- Kritische stap: Terwijl pipetteren oplossing over de voorbereiding, niet om de vliegen te raken met de pipet tip, omdat dit zal leiden tot de voorpoot om uit positie te verplaatsen.
Let op: U kunt ook gebruik maken vaneen micromanipulator het nauwkeurig positioneren van een glazen capillair met stimulus dichtbij de tarsale segment af te beelden. Lever gecontroleerde hoeveelheden stimulus via een intracellulaire micro-injectie dispenser volgens de instructies van de fabrikant.
- Kritische stap: Terwijl pipetteren oplossing over de voorbereiding, niet om de vliegen te raken met de pipet tip, omdat dit zal leiden tot de voorpoot om uit positie te verplaatsen.
4. Beeldverwerking en Analyse: Kwantificering van de Response
- Open een reeks van confocale Z-stacks met behulp van Fiji ( http://fiji.sc/Fiji ) 23 of ImageJ ( http://imagej.nih.gov/ij/ ) image 24 analyse en verwerking software.
- Wordt sum intensiteit projectie van alle zes segmenten Z voor elk van de 120 tijdstippen.
- Selecteer de "Stack" optie onder "Beeld". Verder selecteert u de optie 'Z projectie "en voer" 1 "als het begin slice en" 4 "als stop slice. Voor projectie type selecteert R20; som plakken "uit het pull-down menu en kies" All time frames ".
- de regio van belang (ROI) te bepalen met behulp van de vrije hand selectie gereedschap om een grens rond een cel lichaam of neuronale projectie tekenen. Klik op de "Analyze" label en selecteer de "ROI manager" optie onder "Tools".
- Kwantificeren van de fluorescentie van de ROI door het selecteren van de optie 'Set metingen ", onder het menu' Analyseren 'en het controleren van de dozen voor geïntegreerde dichtheid, gebied, gemiddelde en maximale grijswaarde en label. Selecteer vervolgens de "More" optie onder het ROI manager menu, en verder de optie "Multi maatregel".
Opmerking: Dit zal een popup doos met waarden voor elk van de geselecteerde parameters te genereren. - Controleer de maximale grijswaarde te zorgen dat geen van de beeldpunten verzadiging bereikt (bijvoorbeeld 65.535 voor een 16-bits camera).
LET OP: Voor de experimenten getoond in tzijn, de antwoorden werden gemeten hetzij van neuronale cellichamen en uitsteeksels, afhankelijk van waar de maximale toename van AF / F waargenomen. - Bereken de maximale relatieve verandering in fluorescentie (AF / F) op tijdstip t is:
- Aftrekken achtergrond fluorescentie van elk F (cel) waarde. Achtergrondfluorescentie te kwantificeren, meten de integrale densiteit van een ROI van gelijkwaardige grootte en vorm van een gebied van de voorpoot (of zuigorganen) zonder detecteerbare neuronen.
- Te kwantificeren de post-stimulatie fluorescentie, F (cel) t, het meten van de geïntegreerde dichtheid van de ROI van de cel lichaam of het proces op tijdstip "t" na stimulatie.
- De pre-stimulatie fluorescentie te kwantificeren, F (cel) t = 0, analyseren pre-stimulus beelden van het cellichaam of werkwijze op dezelfde manier alshet post-stimulatie signaal. Gebruik de gemiddelde geïntegreerde dichtheid van 3 beelden naar F (cel) t = 0 te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De GCaMP calcium indicator werd genetisch uitgedrukt in Gr68a-Gal4 of ppk23-Gal4 chauffeurs. Verschillende populaties van voorpoot neuronen en niet-neurale steuncellen worden gelabeld door elke bestuurder (figuur 3A-C). Ligand-specifieke reacties op de lipofiele feromoon CH503 waargenomen in Gr68a-Gal4 en ppk23-cellen die Gal4 GCaMP (Figuur 3D). De relatieve verandering in fluorescentie-intensiteit van het signaal GCaMP5G (AF / F) en meer bij hogere concentraties CH503 (figuur 3E). Interessant kan de 5 ng van CH503 de neurale respons onderdrukken.
Gr68a en ppk23 neuronen vertoonden verschillende reactiepatronen. Gr68a neuronen toonde een tonic patroon van neuronale respons (Figuur 3F), terwijl ppk23 neuronen toonde een driefase, oscillerend respons (Figuur 3G). Reacties van ppk23 neuronen in de slurf waren eenLSO gemeten met behulp van deze voorbereiding en vertoonde een combinatie van fasische en oscillerende reacties (Figuur 3H).
Figuur 1:. Basisprincipe van de GCaMP calcium beeldvormende techniek GCaMP5G is genetisch uitgedrukt in Gal4 gelabelde cellen en fluoresceert met een lage intensiteit voorafgaand aan neuronale stimulatie. Toepassing van een stimulus veroorzaakt een actiepotentiaal in het neuron en veroorzaakt Ca2 + influx. GCaMP5G eenmaal gebonden aan Ca2 +, ondergaat een conformationele verandering, resulterend in verhoogde fluorescentie (AF), die veranderingen in de tijd. De basislijn fluorescentie (F) verwijst naar fluorescentiesignaal intensiteit vóór stimulatie.
Figuur 2: Montage van een live-vlieg voor beeldvorming van de voorpoot of proboscis neuronen.(A) Montage van de voorpoot: een 3,2X beeld van een levende mannelijke vliegen, met de voorpoten bevestigd aan de dekglaasje met tape. (B) Een 40X beeld van de vlieg, waarin elke van de tarsale segmenten (T1-5) en het plaatsen van tape boven de tarsale eerste segment en de vijfde tarsale segmenten. (C) Montage van de snuit: een stukje tape wordt geplaatst over het rostrum tot aan het uiteinde van de slurf bloot te leggen. (D) De pipet tip voor stimulus Daarnaast is licht gehouden boven de vlieg en heeft geen direct contact met de voorbereiding te maken.
Figuur 3:. Feromoon geïnduceerde neurale reacties in GCaMP-expressie neuronen (A) Schematische voorstelling van de mannelijke voorpoot van Drosophila die de ruimtelijke posities van Gr68a Gal4-gemerkte cellen op tarsale segmenten T2-4. Non-neurale cellen (geïdentificeerd op basis van grootte en vorm) zijn colored geel. (B) Raw fluorescerende beeld van de mannelijke voorbeen toont neurale en steuncellen gelabeld door de Gr68a-Gal4 driver. Schaal bar = 50 micrometer. (C) Schematische voorstelling van de mannelijke voorpoot van Drosophila die de ruimtelijke posities van ppk23 Gal4-gemerkte cellen op tarsale segmenten T2-4. (D) Reactie van Gr68a- en ppk23 uitdrukken T4 neuronen CH503 (chemische structuur hierboven afgebeeld). De gemiddelde AF / F reactie op CH503 werd vergeleken met de gemiddelde AF / F na toepassing van PBST alleen oplosmiddel; t-test van Student met ongelijke variantie (voor Gr68a) of Mann-Whitney-test (op ppk23): * p <0,05, *** p <0,001. Error bars verbeelden sem Statistische vermogen = 0,93. (E) een dosisafhankelijke verandering in Δ F / F waargenomen in Gr68a neuronen in T4. t-test van Student met ongelijke variantie: ** p <0,01, *** p <0,001. Statistische power = 0,86-0,96. (F (G) Een kleurcode tijdsverloop toont een oscillerende, fasische respons in GCaMP fluorescentie volgende CH503 stimulatie (500 ng) van ppk23 uitdrukken neuronen. De posities van de neuronen op de voorpoot wordt in de ruwe fluorescerende afbeelding (links). Schaal bar: 10 micrometer; tijdschaal: 0-96 sec. De begeleidende lijngrafiek toont een barst reactie van een ppk23 neuron op stimulatie door 500 ng van CH503. Rode pijl geeft het tijdstip van de stimulus werd toegevoegd. De piek RespoNSE treedt op 76 sec. (H) Een kleurcode tijdsverloop van-ppk23 uitdrukken neuronen op de snuit met een late-onset tonic reactie van de cel lichaam en een oscillerende reactie van een axonale projectie volgende CH503 stimulatie (500 ng). De posities van de cellen worden in de ruwe fluorescerende afbeelding (links). Schaal bar = 10 micrometer; tijdschaal: 0-96 sec. Overgenomen met toestemming van Shankar, S., et al. De neuropeptide tachykinine is essentieel voor het feromoon detectie in een smaak neuraal circuit. doi:. 10,7554 / eLife.06914 (2015) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| solvent 1,2 | Oplosbaarheid van CH 5 0 3 3 | Doet het oplosmiddel alleen trekker neuronale activiteit? 4 |
| 0,1% PBST | JA | NEE |
| 100% ethanol | JA | JA |
| 100% hexaan | JA | JA |
| 10% ethanol | NEE | (niet getest) |
| 10% hexaan | NEE | (niet getest) |
| 100% DMSO | JA | JA |
| 10% DMSO | JA | JA |
| 0,4% DMSO | JA | JA |
| 0,2% DMSO | JA | JA |
Tabel 1:. Oplosbaarheid van CH 5 0 3 in verschillende oplosmiddelen 1 DMSO. Dimethyl sulfoxide 2 Ethanol, hexaan en DMSO oplossingen werden verdund met dH 2 O (v / v) 3 Oplosbaarheid van CH503 in 0,2% DMSO werd beperkt. slechts 250 ng / ml. 4 Verhoging AF / F met oplosmiddel alleen overeenstemde met de opmer-ved na stimulatie met feromonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We beschrijven hier een werkwijze live calcium beeldvorming van Drosophila perifere neuronen uitvoeren 2 verschillende zintuigen. De Ca 2+ -evoked GCaMP fluorescerende reacties in Gr68a-neuronen geïnduceerd door het feromoon ligand CH503 waren dosis-afhankelijk en kwantitatief. Het was ook mogelijk om verschillende neurale respons patronen zoals fasische en tonische reacties onderscheiden.
Neuronen toont fasische respons wordt aangenomen dat een snelle aanpassing laten continue stimuli. Dit type reactie is geassocieerd met geurdetectieniveau 25 en het genereren van ritmische motoriek patronen 26. Daarentegen neurale oscillaties, die in vele zintuigen beschreven, wordt gedacht dat meerdere ingangen synchronisatie op één postsynaptische locatie en specifieke eigenschappen brengen de stimulus 27. De moleculaire basis van oscillaties gekoppeld aan ppk23 neuronen nog niet gerapporteerd, onze knowledge. In andere typen exciteerbare cellen tonen oscillerende reacties is de frequentie van de oscillaties aangetoond worden geregeld door een proces genaamd calcium geïnduceerde calciumafgifte 28. Hierbij wordt calcium vrij uit interne opslag onder controle van de secundaire boodschapper inositol trifosfaat en de frequentie van de afgifte afhankelijk is van de sterkte van de externe stimulus. Inzicht in de moleculaire basis van tonic neuronale reacties zijn opgedaan met studies aan de zuurstof sensing receptoren van C. 29 elegans. Een langdurige toename van het calciumgehalte in neuronen bleek te worden gemedieerd door het L-type spanningsafhankelijke calciumkanalen, ryanodine en inositol trifosfaat signaalwegen 29. Het zal belangrijk zijn om na te gaan of soortgelijke mechanismen een rol spelen in de reacties van ppk23 neuronen spelen.
Levende calcium beeldvorming kan worden aangepast op verschillende manieren voor de studie van andere populaties
Diverse technische ontrantsoenen zijn noodzakelijk om stabiele beelden te verkrijgen en om nauwkeurig te meten het tijdsverloop van fysiologische reacties. Ten eerste moet de voorpoot stevig gepositioneerd omdat de vlieg vertoont krachtige beweging na toevoeging van de oplossing, die een bron van variatie tussen preparaten kunnen worden. Hoewel bath toepassing van feromonen oplossing kan de ligand aan alle smaak sensilla op de blootgestelde segmenten tarsale bereiken, kan een deel van de oplossing stromen naar andere delen van de gemonteerde preparaat. Ook zou het voorbeen potentieel wegdrijven als oplossing toegevoegd. Anderzijds nauwkeurig beeld bijna onmiddellijke toename in fluorescentie, is het belangrijk om direct imaging hervatten na toevoeging van de stimulus aangezien sommige neuronen vertonen een snelle en maximale respons binnen 4 seconden stimulatie. Alternatief kan een continue tijdreeksen tot het toevoegen van de stimulus oplossing en het precieze tijdstip waarop de stimulus wordt toegediend kunnen worden gemarkeerd worden gestart.
lass = "jove_content"> Twee bronnen van vals positieve reacties waargenomen. Ten eerste kan het oplosmiddel zelf fluorescerende induceren, zelfs in afwezigheid van een ligand. De PBST oplosmiddel veroorzaakte een dergelijke reactie in sommige ppk23-Gal4 gelabelde cellen. Bovendien, DMSO, een algemeen gebruikte oplosmiddel voor polaire en apolaire moleculen, ook geleid tot een reactie in sommige Gr68a Gal4-gelabelde neuronen. Daarom is het essentieel om te bepalen of het oplosmiddel zelf veroorzaakt een fluorescentiesignaal en een oplosmiddelsysteem met lage achtergrondactiviteit selecteren. Ten tweede werd een sterke driefase-type respons in niet-neurale steuncellen alleen waargenomen dat het oplosmiddel PBST. De Gr68a-Gal4 driver wordt uitgedrukt in zowel neuronen en steuncellen die lijken enkele neuronen en in het algemeen rond, groter, amorf gevormd, en missen toegankelijk projecties. Het is daarom belangrijk om neurale van niet-neuronale respons differentiëren per Gal4 regel bij het kiezen ROI.
_content "> Een belangrijke beperking van deze werkwijze is dat dezelfde vlieg bereiding niet kan worden gebruikt voor opeenvolgende experimenten verschillende concentraties of typen liganden, tenzij de toegepaste stimulus eerst grondig verwijderd van het oppervlak van het dekglaasje testen. Daarnaast, deze werkwijze kan niet worden gebruikt voor high throughput beeldvorming van meerdere vliegen in een keer, als gevolg van de sterke vergroting nodig voor visualisatie van Drosophila neuronen, en de behoefte aan snelle acquisitie en hoge tijdsresolutie. tot slot vereist deze werkwijze de beschikbaarheid van genetische hulpmiddelen transgene genexpressie , waardoor de toepassing te beperken in de eerste plaats bij de belangrijkste model organismen.Al met al is deze werkwijze een eenvoudiger alternatief voor cellulaire opnamen gebruiken elektroden en geen gespecialiseerde instrumenten vereist. In tegenstelling tot andere genetisch gecodeerde reporters zoals CaLexA, het dier levend gehouden gedurende imaging waardoor fysiologische reacties te meten in real-tijd met een hoge gevoeligheid in vliegen van alle leeftijden. Deze functie zou kunnen zorgen voor screening van leeftijdsafhankelijke reacties op liganden of vergelijking van de neurale reacties volgende veranderingen in de sociale omstandigheden of reproductieve staat. Bovendien kan langdurige opnames worden uitgevoerd gedurende ten minste 10 minuten zonder duidelijke fotobleken of verlaging van GCaMP signaal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gr68a-Gal4 | Gift from H. Amrein (Texas A&M Health Science Center, TX, USA) and J. Carlson (Yale University, CT, USA) | ||
| ppk23-Gal4 | Gift from K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA) | ||
| UAS-GCaMP5 | 42037 | Bloomington Drosophila Stock Center | |
| 0.17 mm coverslip (Gold-Seal coverslip) | Electron Microscopy Services | 63790-10 | |
| Nail polish, "Hard as Nails Clear" | Sally Hansen | ||
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Paint brush | fine-tipped brush | ||
| Tape | Scotch brand | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 13021 | |
| Ethanol, lab grade | Merck | 10094 | |
| Hexane, HPLC grade | Sigma-Aldrich | H303SK-4 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| PBST | Recipe described in the protocol section | ||
| CH503 | Synthesis described in Mori et al., 2010 | ||
| sCMOS Camera (ORCA Flash4.0) | Hamamatsu | C11578-22U | |
| Microscope (Ti-Eclipse) | Nikon | Ni-E | |
| Spinning Disk Scan head | Yokogawa | CSU-X1-A1 | |
| Aquistion Software (MetaMorph Premier) | Molecular Devices | 40002 | |
| Fiji software | open source | http://fiji.sc/Fiji |
References
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287, 1830-1834 (2000).
- Dunipace, L., Meister, S., McNealy, C., Amrein, H. Spatially restricted expression of candidate taste receptors in the Drosophila gustatory system. Curr. Biol. 11, 822-835 (2001).
- Thistle, R., Cameron, P., Ghorayshi, A., Dennison, L., Scott, K. Contact chemoreceptors mediate male-male repulsion and male-female attraction during Drosophila courtship. Cell. 149, 1140-1151 (2012).
- Toda, H., Zhao, X., Dickson, B. J. The Drosophila female aphrodisiac pheromone activates ppk23(+) sensory neurons to elicit male courtship behavior. Cell Rep. 1, 599-607 (2012).
- Vijayan, V., Thistle, R., Liu, T., Starostina, E., Pikielny, C. W. Drosophila pheromone-sensing neurons expressing the ppk25 ion channel subunit stimulate male courtship and female receptivity. PLoS Genet. 10, 1004238 (2014).
- Lu, B., LaMora, A., Sun, Y., Welsh, M. J., Ben-Shahar, Y. ppk23-Dependent chemosensory functions contribute to courtship behavior in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 8, e1002587 (2012).
- Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a Clade of Ionotropic Receptors Are Candidate Taste and Pheromone Receptors. Neuron. 83, 850-865 (2014).
- Montell, C. A taste of the Drosophila gustatory receptors. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 345-353 (2009).
- Shanbhag, S. R., Park, S. K., Pikielny, C. W., Steinbrecht, R. A. Gustatory organs of Drosophila melanogaster: fine structure and expression of the putative odorant-binding protein PBPRP2. Cell Tissue Res. 304, 423-437 (2001).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. J. Neurobiol. 56, 139-152 (2003).
- Rodrigues, V., Siddiqi, O. A gustatory mutant of Drosophila defective in pyranose receptors. Mol. Genet. Genomics. 181, 406-408 (1981).
- Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. J. Neurobiol. 61, 333-342 (2004).
- Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of Drosophila. J. Neurosci. 34, 7148-7164 (2014).
- Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. J. Vis. Exp. , e51355 (2014).
- Meunier, N., Marion-Poll, F., Lansky, P., Rospars, J. P. Estimation of the individual firing frequencies of two neurons recorded with a single electrode. Chem. Senses. 28, 671-679 (2003).
- Masuyama, K., Zhang, Y., Rao, Y., Wang, J. W. Mapping neural circuits with activity-dependent nuclear import of a transcription factor. J. Neurogenet. 26, 89-102 (2012).
- Akerboom, J., et al. Crystal structures of the GCaMP calcium sensor reveal the mechanism of fluorescence signal change and aid rational design. J. Biol. Chem. 284, 6455-6464 (2009).
- Miyamoto, T., Chen, Y., Slone, J., Amrein, H. Identification of a Drosophila glucose receptor using Ca2+ imaging of single chemosensory neurons. PloS One. 8, e56304 (2013).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
- Shikichi, Y., et al. Pheromone synthesis. Part 250: Determination of the stereostructure of CH503 a sex pheromone of male Drosophila melanogaster, as (3R,11Z,19Z)-3-acetoxy-11,19-octacosadien-1-ol by synthesis and chromatographic analysis of its eight isomers. Tetrahedron. 68, 3750-3760 (2012).
- Yew, J. Y., et al. A new male sex pheromone and novel cuticular cues for chemical communication in Drosophila. Curr. Biol. 19, 1245-1254 (2009).
- Bray, S., Amrein, H. A putative Drosophila pheromone receptor expressed in male-specific taste neurons is required for efficient courtship. Neuron. 39, 1019-1029 (2003).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Kaissling, K. E., Zack Strausfeld, C., Rumbo, E. R. Adaptation processes in insect olfactory receptors. Mechanisms and behavioral significance. Ann. N. Y. Acad. Sci. 510, 104-112 (1987).
- Marder, E., Bucher, D. Central pattern generators and the control of rhythmic movements. Curr. Biol. 11, 986-996 (2001).
- Koepsell, K., Wang, X., Hirsch, J. A., Sommer, F. T. Exploring the function of neural oscillations in early sensory systems. Front Neurosci. 4, 53 (2010).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
- Busch, K. E., et al. Tonic signaling from O(2) sensors sets neural circuit activity and behavioral state. Nat Neurosci. 15, 581-591 (2012).
