Bir Kanseri Hücre Sfero Testi 3D ortamda Invasion Değerlendirmek için
Summary
This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.
Abstract
The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.
Introduction
Kanser hücre hareketi gibi davranışlar dolaşım sistemi 1 içine bazal membran ve giriş yoluyla işgali kolaylaştırır göz önüne alındığında, metastatik potansiyelin belirleyici olduğu bilinmektedir. Motilite üzerinde en çok araştırma yaygın bir üç boyutlu (3D) matris içinde hücrelerin hareketi olacak aslında nasıl bu aynı hücrelerin daha fazla temsilcisi olduğunu olma yolunda hızla ilerliyor olsa hücreler, iki boyutlu (2D) ayarında nasıl davrandığını odaklanmıştır vivo 2 davranır. 3D kültür sistemleri giderek büyüme kinetikleri ve ilaç duyarlılık 3, hücre morfolojisi değişir hücresel davranışları incelemek için kullanılır. 3D ortamın kapsamında kanser hücre işgali izlemek için arzu 3D hücre dışı içine bu parçacıklarının gömerek ardından asılı damla kültür yöntemiyle 4 aracılığıyla 3D hücre agrega (sferoidler) üretimini kapsayan daha önce kurulmuş tekniklerin sentezine yol açmıştır Matris (ECM) kolajen ve bazal membran malzemelerinin 5 oluşur. Bu yöntem, kolaylıkla deneysel koşullar altında çeşitli işgali karşılaştırma için kullanılabilir akıcı bir yaklaşım sağlayarak bu, daha önce bilinen teknikler geliştirmek için çalışmaktadır.
In vitro hücre motilitesini değerlendirmek için daha geleneksel yolları çizilmeye yara tahlil ve transwell tahlil 6 bulunmaktadır. Eski deney 2B ortamda hücre motilitesini tasvir ve in vivo işgali için kritik çeşitli özellikler, örneğin, bir proteaz aktivitesi 7 bağımsızdır. Transwell tahlil de ekler ters membran yüzeyinde hücre görünümü, yani ECM yüzeylerde ancak, yalnızca tek bir parametre ile daha iyi bir model hücre işgali kaplanır zaman ölçülen ve hücre işgali birçok nüanslar böylece kolaylıkla gözlemlenebilir değildirler. Bu teknikler, kanser hücresi sferoid yayılması deneyinin (Şekil 1 <aksine/ strong>) Sadece fizyolojik ilgili olmayan bir ortamda hücre işgali gerçek zamanlı izleme sağlar, fakat aynı zamanda kolektif vs bireysel hücre göçü 8 olarak görüntülenebilir önemli hücre çizgisi özgü özellikleri, izin verir. Bu yöntem aynı zamanda, standart 3D kültürü büyüme tahlilleri fazla avantaj elde edilir. Hücreler bu kısıtlama kaldırdı sonra işgal etmeye teşvik edilecektir böylece asılı damla yöntemi ile hücresel agrega üretimi başlangıçta hücre hareketi kısıtlar. Bu kısıtlama kaldırdı kez Dahası, hücre çıkış sonra uygun quantitated edilebilir bir üniforma yönde devam edecektir.
Kanser hücresi sferoidler deneyleri için kullanılan en popüler ECM malzeme Matrigel ve bu bileşenlerin her biri metastatik davranışını etkileyen önemli ve farklı rolleri vardır burada tip I, hücre oranında yerleştirilmiştir. Matrigel Engelbreth-Holm Swarm fare sarkoma hücreleri tarafından üretilen proteinlerin salgılanan karışımıdır ve baseme içinde zenginleştirilmiş olanBöyle laminin, Entactin ve tip IV kollajen 9 olarak nt zar proteinleri. Bu nedenle, Matrigel bundan böyle adlandırılır "bazal membran malzemeler". Bu bazal zar malzemeleri hücre davranışı 11 üzerindeki etkileri bir dizi gösterirler sayıdaki başka protein ek olarak, kanser hücresi yayılımını tamamen 10 boyunca yapışma integrin için gerekli temel ligandı sunar. Buna karşılık, genellikle tendon ve diğer yoğun kollajen yapılar 12 asit sindirimleri hazırlanabilir I kolajen türü, vücut bağ dokusu ve stromanın destekleyici dokuların ve organların büyük bir yapısal elemanı olarak hizmet eden daha basit bir dolgu maddesi. Bu kollajen fiziksel özellikleri, hücre motilitesinin bir dizi özellik düzenleyen ortaya konmuştur; örneğin tümör-stroma arayüzünde kolajen fibrilleri hizalama stroma 13 içine işgalci, sonradan bu fibriller boyunca geçirmek için kanser hücrelerinin izin verir. Burada yer alan deneyinde, hem tip I kolajen ve bazal zar malzemeleri 3D kanser hücresi-stroma etkileşimleri incelemek için bir araç olarak kullanılır.
Hücreler 3 boyutlu bir matris içine gömülü edildikten sonra işgal izlenebilir kontrol yollarının engellenmesi veya stimülasyon etkisi. Hücreler, asılı damla ya da uzun bir işleme işgali modüle etmek için gerekli olacaktır bağlı olarak 3D kültür, transfer üzerine büyüme sırasında ön muameleye tabi tutulabilir. Kısa tedaviler için, ilacın alımından sonra küremsi süspansiyon, hem de hücrelere yeterli ilaç maruziyeti kolaylaştırmak için, 3D kültürleri saracak ortamı ile karıştırılabilir önerilir. Daha sonra, normal veya tümör bağlantılı stromal hücreleri, tümör hücresi istilasını modüle edilmesinde rolünü değerlendirmek için, ya da ne kadar parakrin ve otokrin sinyal etkiler, hücre davranışını tespit etmek matris malzemesi ile karıştırılabilmektedir. Bu fikir bir çalışmada gösterilmiştir nerede col Coculturekanser ve asılı damla endotelyal hücreler üzerinde sferoidler 14 içinde damar ağı yol açtı. Kanser hücre istilası farklı alt-tabaka 15 tarafından temas edilmesinin Son olarak, ECM bileşenleri, aynı zamanda, değiştirilebilir. Aşağıda sunulan durumda, yöntem, çeşitli koşullar altında kanser hücresi invazyonunu değerlendirilmesi için bir çerçeve sağlar. Genel olarak, tüm hücre kuşakları asılı damla parçacıklarının yaratacak ve epitel dönük hücre hatları genellikle, normal küre formunda olduğu belirlendi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışma, bir küremsi yayılması deneyinin (Tablo 1) kanser hücre soylarının bir paneli performansını değerlendirildi. Genel olarak, sferoid oluşumu hücre-hücre birleşme varlığı küremsi benzeri mimari oluşumunu teşvik fazla epitelyal dönük hücre hatları, gelişmiş olduğunu fark. MDA-MB-231 hücreleri gibi, bir epitelyal mezenkimal geçiş geçirmiş bilinen hücre hatları, dolayı azaltılmış E-, N- ve P-kadherin ifadesi 16 büyük olasılıkla Asılı damla k?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH hibe P30 CA051008 ve T32 CA009686 (ATR) tarafından desteklenir.
Materials
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | CB-40234 | |
| Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg | Millipore | 08-115 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| 100mm TC-treated Dishes | Corning Incorporated | 430167 | |
| 24-well TC-treated Plates | NEST Biotechnlology | 702001 | |
| Olympus IX-71 Inverted Microscope | |||
| Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and LNCaP cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS. | |||
References
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Metastasis: Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev. Cancer. 2 (8), (2002).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J Cell Sci. 116 (12), 2377-2388 (2003).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), (2007).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J Vis Exp. 51, (2011).
- Del Duca, ., Werbowetski, D., T, ., Del Maestro, R., F, Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion. J Neuro-Oncol. 67 (3), (2004).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. J Vis Exp. 88, (2014).
- Ramos-DeSimone, N., Hahn-Dantona, E., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. Activation of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) via a converging plasmin/stromelysin-1 cascade enhances tumor cell invasion. J Bio Chem. 274 (19), .
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Rev. Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).
- Shaw, L. M., Chao, C., Wewer, U. M., Mercurio, A. M. Function of the integrin α6β1 in metastatic breast carcinoma cells assessed by expression of a dominant-negative receptor. Cancer Res. 56 (5), 959-963 (1996).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), (2010).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat Protoc. 1 (6), (2006).
- Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Campbell, J. M. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4 (1), (2006).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol Med. 140, 141-151 (2007).
- Brenner, W., Groß, S., Steinbach, F., Horn, S., Hohenfellner, R., Thüroff, J. W. Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin. Cancer Lett. 155, 199-205 (2000).
- Nieman, M. T., Prudoff, R. S., Johnson, K. R., Wheelock, M. J. N-cadherin promotes motility in human breast cancer cells regardless of their E-cadherin expression. J Cell Biol. 147 (3), .
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), (2013).
- Sodek, K. L., Brown, T. J., Ringuette, M. J. Collagen I but not Matrigel matrices provide an MMP-dependent barrier to ovarian cancer cell penetration. BMC Cancer. 8 (1), 223-2210 (2008).
- Nguyen-Ngoc, K. V., Ewald, A. J. Mammary ductal elongation and myoepithelial migration are regulated by the composition of the extracellular matrix. J Microsc. 251 (3), 212-223 (2013).
- Glinskii, A. B., Smith, B. A., Jiang, P., Li, X., Yang, M., Hoffman, R. M., Glinsky, G. V. Viable circulating metastatic cells produced in orthotopic but not ectopic prostate cancer models. Cancer Res. 63 (14), 4239-4243 (2003).
