En Cancer Cell spheroid analysen å vurdere Invasion i en 3D-innstilling

Summary

This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.

Abstract

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.

Introduction

Det er fastslått at kreftcelle motilitet er prediktiv for metastatisk potensial, gitt at en slik oppførsel muliggjør invasjon gjennom basalmembranen, og komme inn i sirkulasjonssystemet ^1. Mesteparten av forskningen på motiliteten har fokusert på hvordan cellene oppfører seg på en to-dimensjonal (2D) innstilling, selv om det er å bli anerkjent at bevegelsen av celler i en tre-dimensjonal (3D) matrise er mer representativt for hvordan de samme cellene faktisk vil oppføre in vivo ^to. 3D-kultur-systemer blir stadig mer brukt til å studere cellulære atferd som spenner fra cellemorfologi, til vekstkinetikk og narkotika følsomhet ^tre. Ønsket om å overvåke cancercelle invasjon innenfor rammen av en 3D-miljø har ført til syntese av tidligere etablerte teknikker som involverer dannelsen av 3D-celleaggregater (sfæroider) via den hengende dråpe dyrkningsmetode ^4, etterfulgt av nedgraving av disse kuler inn i et 3D-ekstracellulære matrise (ECM) består av kollagen og kjeller membranmaterialer ^5. Denne metoden søker å bedre på disse tidligere etablerte teknikker ved å tilveiebringe en strømlinjeformet måte som enkelt kan benyttes til å sammenligne invasjon under forskjellige eksperimentelle betingelser.

Mer tradisjonelle måter å vurdere cellemotilitet in vitro er ripe sår analyse og transwell analysen ^6. Den tidligere analysen viser celle motilitet i et 2D-innstilling, og er derfor uavhengig av en rekke funksjoner kritiske for in vivo invasjon, f.eks proteaseaktivitet ^7. Transwell Analysen kan bedre modell celle invasjon når brønn innsatsene er belagt med ECM-substrater, men, bare en enkelt parameter, dvs. opptreden av celler på den motsatte membranoverflaten blir målt, og mange nyanser av celle invasjon er således ikke lett observerbar. I motsetning til disse teknikker, kreftcellen sfæroide invasjon analysen (figur 1 </ strong>) åpner for sanntids overvåking av celle invasjon i en setting som ikke bare er fysiologisk relevant, men også tillater viktige cellelinje-spesifikke funksjoner som skal visualiseres, for eksempel individuell vs kollektiv celle migrasjon ^8. Denne metoden gir også fordeler i forhold til vanlige 3D-kultur vekst analyser. Generering av cellulære aggregater via hengende slipp-metoden i utgangspunktet begrenser celle bevegelse, slik at cellene vil bli incentivised å invadere etter denne begrensningen er opphevet. Videre, når denne begrensningen er løftet, vil celle utgang gå frem på en uniform retning som deretter kan hensiktsmessig kvantifiseres.

De mest populære ECM materialer som brukes for kreftcelle sfæroider analyser er Matrigel og type I kollagen, hvor hver av disse komponentene har viktige og distinkte roller i å påvirke metastatiske adferd. Matrigel er et utskilt blanding av proteiner som produseres av Engelbreth-Holm sverm mus sarkomceller, og er anriket på basement membranproteiner slik som laminin, entactin, og type IV kollagen ^9. Av denne grunn Matrigel blir heretter referert til som "basalmembranmaterialer." Disse basalmembranmaterialer gi viktige ligandene som trengs for integrin adhesjon i løpet av kreftcelle invasjon ^{10 i} tillegg til mange andre proteiner som utøver en rekke effekter på celle-adferd ^11. Til sammenligning, type I kollagen, som vanligvis fremstilles fra syre oppsummeringer av sener og andre tette kollagenstrukturer ^12, er en mye enklere matrisemateriale som fungerer som en viktig strukturelement av bindevev og stromaceller støtte vev og organer i kroppen. Det har vist seg at de fysikalske egenskapene til kollagen kan regulere en rekke funksjoner i celle motilitet; for eksempel justering av kollagen fibriller ved tumor-stromal grensesnitt tillater kreftceller til senere å migrere langs disse fibriller når invadere inn i stroma ¹³. I analysen som presenteres her, både type I kollagen og basalmembran materialer er brukt som verktøy for å studere 3D kreftcelle-stroma interaksjoner.

Virkningen av inhibering eller stimulering av baner som kontrollerer invasjon kan overvåkes etter at cellene er blitt innleiret i 3D-matrisen. Celler kan være forbehandlet under vekst i de hengende dråper eller ved overføring til 3D-kultur, avhengig av om en langvarig behandling vil være nødvendig for å modulere invasjon. For kortere behandlinger, er det anbefalt at medikamentet blandes med den sfæroide suspensjonen etter innsamling, samt medier som vil omgi 3D-kulturer, for å legge til rette for tilstrekkelig eksponering for legemidlet til cellene. Deretter kan normal eller tumorassosierte stromale celler blandes med grunnmassematerialet for å evaluere deres rolle ved modulering av tumorcelle invasjon, eller for å avgjøre hvordan parakrine og autokrine signale påvirker celleadferd. Denne ideen ble vist i en studie hvor coculture av colpå kreft og endotelceller i hengende dråper førte til en vaskulær nettverk innen sfæroidene ^14. Endelig kan ECM bestanddeler også bli endret, som kreftcelle-invasjon påvirket av forskjellige underlag ^15. Fremgangsmåten som presenteres nedenfor vil således gi en ramme for vurdering av kreftcelle invasjon under en rekke forskjellige forhold. Generelt ble det funnet at ikke alle cellelinjer vil skape kuler i de hengende dråper og epiteliale utseende cellelinjer vanligvis danne vanlige kuler.

Protocol

1. generasjon Spheroids Forbered enkeltcellesuspensjon for hengende dråpe kulturer ved å koble kreft adherente cellekulturer fra ~ 70% konfluens ved hjelp av en PBS-vask, etterfulgt av eksponering til 0,05% trypsin-EDTA-oppløsning. Nøytralisere trypsin-løsning med cellekulturmedium og tell cellene ved hjelp av en alikvot av cellesuspensjonen. Merk: Den spesifikke cellekulturmedier vil være avhengig av cellelinjen som skal testes. Følg ATCC anbefalinger medier, der cellekulturmedium er typisk D…

Representative Results

Ved hjelp av den sfæroide invasjon analysen (figur 1), et panel av kreftcellelinjer ble testet for deres evne til å danne kulene, så vel som for mengden av cellen utgå oppviste etter implantering i en 3D-matrise bestående av basalmembranmaterialer og type I-kollagen (tabell 1). Disse resultatene viser at ikke alle cancercellelinje vil skape velformede kuler, hvor cellelinjer som innehar en epitelial morfologi in vitro hadde tendens til å produsere jevne og glatte aggregat…

Discussion

Denne studien evaluerte ytelsen til et panel av kreftcellelinjer i en sfæroide invasjon analysen (tabell 1). Generelt finner vi at sfæroid dannelsen forsterkes i de mer epiteliale utseende cellelinjer, hvor tilstedeværelsen av celle-celle kryss fremmer dannelsen av en sfæroide-lignende arkitektur. Kjente cellelinjer som har gjennomgått en epitelial-mesenchymale overgang, som MDA-MB-231-celler danner ikke sfæroidene i hengende dråpe kulturen mest sannsynlig på grunn av deres reduserte E-, N- og P…

Materials

Matrigel Growth Factor Reduced	Corning	CB-40234
Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg	Millipore	08-115
DMEM	Life Technologies	11995-065
RPMI 1640 Medium	Life Technologies	11875-093
PBS	Life Technologies	10010-023
0.05% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated	Omega Scientific	FB-12
100mm TC-treated Dishes	Corning Incorporated	430167
24-well TC-treated Plates	NEST Biotechnlology	702001
Olympus IX-71 Inverted Microscope
Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and LNCaP cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS.