Summary
Het doel van dit protocol is om te demonstreren hoe fluorescent-gelabelde eiwit dynamiek op plantencel oppervlakken met een variabele hoek epifluorescentiemicroscopie, waaruit blijkt knipperende stippen van GFP-gelabeld PATROL1, een membraan mensenhandel eiwit te controleren, in de cel cortex van de stomatale complex in Arabidopsis thaliana.
Protocol
1. Bereiding van Zaailingen
- Steriliseren van de zaden.
- Bereid de sterilisatie door toevoeging van 500 pi NaClO (chloor: 5,0%) en 1 ui 10% Triton X-100 om 500 pi steriel water.
- Plaats ca. 10 transgene A. thaliana zaden dragen GFP-PATROL1 8 in een 1,5 ml buis.
- Voeg 1 ml 70% ethanol-oplossing en meng goed door het omkeren vijfmaal. Laat gedurende 1 min.
- Observeer de zaden zinken naar de bodem van de buis. In een schone laminaire stroming kast, verwijder voorzichtig de 70% ethanol met behulp van een micropipet, en voeg 1 ml sterilisatie oplossing. Meng goed door omkeren vijfmaal en laat gedurende 5 min.
- Was de zaden. Nog steeds onder aseptische omstandigheden op een schone bank, verwijder voorzichtig de oplossing met behulp van een micropipet, en voeg 1 ml steriel water. Herhaal dit vijf keer. De gesteriliseerde zaden worden bewaard in steriel water bij 4 ° C gedurende 2 dagen.
- Zow de gesteriliseerde zaden op een 0,5% gellan-gom gestold 1/2 Murashige en Skoog medium plaat (pH 5,8) 9. Tape het deksel op de plaat met behulp van twee lagen van chirurgische tape.
- Incubeer de plaat in het donker bij 4 ° C met een koude opslagkamer, O / N.
- Breng de plaat in een groeikamer ingesteld op 23,5 ° C met een 12-uur / 12-uur licht-donker cyclus met 100 umol m -2 s -1 witte lichten, en incubeer gedurende 7 dagen. Zaailingen met zaadlobben van ongeveer 1 mm lang kan vervolgens worden geoogst.
2. Sky Drop Montage van Cotyledon Specimens
LET OP: Een belangrijke factor bij het prepareren voor VAEM observatie is het vermijden van het opnemen van luchtbellen tussen het model en het deksel glas. Bubbles sterk verminderen van de beeldkwaliteit van VAEM door het veroorzaken verschillen in de brekingsindex. Een eenvoudige methode die wij "sky drop 'hebben genoemd montage, kan worden gebruikt om luchtbellen te vermijdentussen A. thaliana zaadlobben en het deksel glas. Dit moet gebeuren onmiddellijk voor observatie.
- Plaats 30 gl buffer basale [5 mM 2- (N -morpholino) -ethanesulfonic acid-Tris (MES-Tris) bij pH 6,5, 50 mM KCl, 100 pM CaCl2] in het midden van een glasplaatje (size: 76 x 26 mm, dikte: 1,0-1,2 mm).
- Verwijderen van een zaadlob van een 7-dagen oude zaailing met het ontleden van een schaar. Float de zaadlob met de waarneming naar boven op de basale buffer druppel (Figuur 1, stap 1).
- Plaats 30 gl basale buffer in het midden van een dekglas (grootte: 18 x 18 mm, dikte: 0,12-0,17 mm) (Figuur 1, stap 2). Draai het deksel glas ondersteboven voorzichtig. Oppervlaktespanning de buffer daling kunnen vallen te voorkomen. Houd het deksel glas met een pincet op een rand. Plaats de tegenoverliggende rand van het glaasje zodat de buffer druppel is ongeveer boven de zaadlob.
- Met de rand van het deksel glas nog steeds op de glijbaan, en nog steeds de tegenoverliggende rand met een pincet, stel de positie van de buffer vallen onder de dekking van glas, zodat het direct boven de zaadlob monster (Figuur 1, stap 3). Loslaten van het deksel glas. Monteer een druppel op het monster resulteert in een preparaat zonder luchtbellen.
- Veeg overtollige buffer met behulp van niet-pluizende weefsels. Onmiddellijk houden aan de voorbereiding (zie stap 3).
Opmerking: Het is niet nodig om de monsters te verzegelen.
3. VAEM observatie en Movie Acquisition
Opmerking: Een omgekeerde microscoop is uitgerust met een TIRF eenheid en TIRF objectieflens met een numerieke apertuur van 1,49: The TIRF microscoopsysteem 9 toegepast in dit onderzoek wordt als volgt beschreven. Voor geautomatiseerde regeling van de laser inloophoek is een schakelkast gebruikt. Groen fluorescent eiwit (GFP) wordt geëxciteerd met een 488 nm optisch gepompte halfgeleiderlaser en thij fluorescentie wordt gedetecteerd door een 510-550 nm banddoorlaatfilter om autofluorescentie voorkomen chloroplasten. De gemeten maximale waarde van vezels uitgangsvermogen is 13,0-13,5 mW. Voor de detectie, een elektron te vermenigvuldigen charge-coupled device (EM-CCD) camera hoofd-systeem en een C-mount camera vergroting verandering unit worden gebruikt.
- Kalibreer de laser centreren en richten volgens de instructies van de fabrikant.
OPMERKING: Deze stap is cruciaal voor nauwkeurige VAEM waarnemingen. Het wordt sterk aanbevolen dat de periodieke controles van de aanpassing procedures laser pad, afhankelijk van uw microscoop, worden uitgevoerd.- Bepaal de centrale positie verlicht met een objectief-lens vrije lichtpad op het plafond van de microscopie kamer. Naar de centrale positie te markeren, zet een gekleurde cirkel zegel op het plafond (afbeelding 2, stap 1, 2).
- Verlichten het plafond met een objectieflens (figuur 2, stap 3, 4). Verplaats de illuminated regio in de middelste stand (figuur 2, stap 5). Concentreer de laser (figuur 2, stap 6). Fijn afstellen van de positie van de gefocusseerde laser naar het midden (figuur 2, stap 7).
- Stel een exemplaar op het podium van de microscoop en selecteer cellen voor observatie met behulp van helderveld verlichting.
- Controleer of de fluorescerende eiwit kan worden waargenomen in de cellen, en de ingestelde positie van de z-as op het celoppervlak via epifluorescentie belichting (Figuur 3A).
- Voeren VAEM waarnemingen.
- Neig de ingang hoek van de laserstraal geleidelijk met de doos controller. Op hetzelfde moment, het toezicht op de livebeeld zorgvuldig. In eerste instantie zal het beeld wazig zijn (Figuur 3B).
- Als de laser hoek toeneemt, zal het beeld op de VAEM minder vervaagd, een helder beeld (Figuur 3C en D) uiteindelijk produceren. Op dit punt, stop increazingen de laser hoek. Als de fluorescentie signaal verloren, afnemen tot een ondieper hoek.
- Fine-tunen van de laser ingang hoek om een beter beeld te krijgen. Fine-tuning van de positie van de z-as kan ook het verbeteren van het beeld. Indien nodig, de optische parameters (laservermogen, golflengte en filter set) en de beeldsensor parameters [beeldgrootte, belichtingstijd, winst, digitizer en elektron te vermenigvuldigen (EM) winst].
OPMERKING: Bij de TIRF microscoop uitrusting hierboven beschreven representatieve parameters als volgt. Vergroting van de lens vlak voor de camera: 2X; Laser-uitgang: 1,0 mW; Beeldformaat: 512 × 512 pixels; Belichtingstijd: 100 msec; Gain: 5 ×; Digitizer: 11 MHz; en EM winst: 100.
- Verwerven van een film als een multi-page TIFF image-bestand met de commerciële microscoop software. Hier is de film van met GFP gemerkte dots knippert op het oppervlak van stomatale cellen.
OPMERKING: representatief beeld acquisitie voorwaarden zijn foldieptepunten. Acquisitie modus: Stroom naar RAM; Aantal beelden: 600; en multi-page TIFF bestandsgrootte: ~ 302 MB.
4. kymograaf Analyse voor kwantificatie van GFP-gelabelde Dot Residence tijd met behulp van Fiji Software
- Installeer Fiji (Fiji is slechts ImageJ ') software 10 met behulp van de instructies van de auteurs (http://fiji.sc/Fiji).
- Run Fiji en open de verworven multi-page TIFF-bestand met behulp van de Fiji-menu "Bestand-Open".
- Plaats een lijn op de plaats van belang, met behulp van de Fiji-werkbalk menu "Rechte Lijn Selection Tool". Optioneel gebruik maken van de "gesegmenteerde Line Selection Tool" of "Freehand Line Selection Tool". In de hier gepresenteerde resultaten is een rechte lijn van 100 pixels (overeenkomend met 8,0 um) subsidiair cellen (Figuur 4A) geplaatst.
- Maak kymograaf beeld met behulp van de Fiji-menu "Beeld-Stacks-Dynamic Reslice een (Figuur 4B). Eventueel "Flip verticaal" en "Rotate 90 graden" in een vakje raam zijn ook (niet gebruikt in de hier gepresenteerde resultaten). De x- en y-as beeld kymograaf geven de lijn positie (overeenkomend met 100 pixels 8,0 micrometer) en observatie tijd (600 pixels dat overeenkomt met 60 sec), respectievelijk. Als het beeld kymograaf niet bevredigend is, de positie en het type (rechte, gesegmenteerd en uit de vrije hand) van de lijn op het meerdere pagina's kan worden gewijzigd. Als de lijn verandert, beeld kymograaf dynamisch verandert. Sla beeld kymograaf als een TIFF-bestand met behulp van de Fiji-menu "Bestand-Save As-Tiff".
- Meet de lengte van de blob in de richting van de tijdas.
- Om geluidsreductie te voeren, breng dan een Gauss-filter om de kymograaf beelden met behulp van de Fiji-menu "-Filters-Gaussian Blur". De "Sigma (Radius) "parameter instelbaar is (1 pixel radius wordt gebruikt voor de gepresenteerde resultaten).
- Segment het signaal regios drempelen, met behulp van de Fiji-menu "Beeld-Adjust-drempel".
NB: Er zijn verschillende drempelwaarden algoritmen om uit te kiezen. In gepresenteerde resultaten, werd de "Yen" algoritme gekozen (Figuur 4C). - Bereid je voor om de tijd (y) te meten -as lengte van de blob met het menu "Analyseren-Set Metingen". Controleer de "begrenzende rechthoek" in het venster "Set Metingen". Uitstek het gebied set moet zo klein mogelijk zijn, om ruis uit te sluiten. Hier werd de minimale oppervlakte vastgesteld op 50 pixels. Meet de tijd (y) -as lengte van de blob met het menu "Analyze-Analyseer Deeltjes". Om het resultaat te verkrijgen waarden en bewijzen dat de geloofwaardigheid van de meting regio's, controleer de "Toon resultaten" en "toevoegen aan Manager </ em> "dozen.
- Waarden in de "hoogte" kolom zijn de tijd (y) -as lengtes voor de gemeten blob (Figuur 4D). Sla de waarden met behulp van het menu Results tafel "Bestand-opslaan als" en bereken en verwerken van de dataset van het beeld blob duur met behulp van een statistisch pakket en / of spreadsheet-software (Figuur 4E).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In deze video artikel, de protocollen voor VAEM observatie van GFP-PATROL1 in A. thaliana zaadlob stomatale complex cellen zijn aanwezig. Hemel druppel montage is een eenvoudige bereidingswijze die kunnen helpen bij het verminderen van het optreden van luchtbellen in VAEM voorbereidingen van A. thaliana zaadlobben (figuur 1). Overtilting van de invoer laser en / of z-positionering specimens VAEM zal een onduidelijk beeld te krijgen. Als dat gebeurt, is het raadzaam om opnieuw te starten vanaf een plaats direct boven het monster, zoals beoordeeld door epifluorescentie belichting. Na een paar dagen ervaring VAEM waarneming, moet het mogelijk zijn om VAEM films succesvol en routinematig verkrijgen, zoals hier getoond van GFP-PATROL1 dot knipperen. De kymograaf analyse in figuur 4, de verblijftijden van 185 GFP-PATROL1 dots van 12 onafhankelijke dochteronderneming cellen A. thaliana zaadlobben werden gemeten. De gemonteerde dichtheidfunctie bleek dat de meeste GFP-PATROL1 stippen waren woonachtig in een dochteronderneming cel voor tussen de 2 en 10 seconden, met een piek van ongeveer 3,5 sec (figuur 4E), wat suggereert snelle exocytose / endocytose van proton pompen op de dochteronderneming celoppervlak.
Figuur 1. Schematische voorstelling van de lucht dalen montagemethode Stap 1:. Specimen Arabidopsis thaliana zaadlobben worden dreef op een druppel basaal buffer op een glasplaatje. Stap 2: Een daling van de basale buffer druppel wordt geplaatst op een cover glas. Stap 3: Het deksel glas met de daling op zijn kop gezet en de daling boven het monster op het glaasje geplaatst. Stap 4: Het dekglaasje wordt vrijgegeven en de druppel valt op het model. (Top) Vogels-eye view. (Onder) Laterale en vergrote weergave. Please klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Kalibratie van de laser centreer- en concentreren Stap 1:. De lege positie van de microscoop revolver wordt gekozen om laserlicht te sturen naar het plafond boven de microscoop. Stap 2: De centrale positie wordt gemarkeerd met een gekleurde cirkel zegel op het plafond. Stap 3: Een objectief is geselecteerd. Stap 4: Controleer de stand verlicht door het laserlicht door de objectieflens. Stap 5: De verlichting wordt aangepast aan de gemarkeerde middenstand. Stap 6: Het laserlicht wordt gericht. Stap 7:. De gerichte laserlicht wordt aan de gemarkeerde centrale positie verhuisd Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Vergelijking van epifluorescentiemicroscopie en variabele hoek epifluorescentiemicroscopie (VAEM). (A) Schematische weergave van het lichtpad van de laser in epifluorescentiemicroscopie. (B) Representatieve epifluorescentie beeld van GFP-PATROL1 bij cotyledon oppervlakken in 7 dagen oude zaailingen van Arabidopsis thaliana. Schaal balk geeft 5 micrometer. (C) Schematische voorstelling van het lichtpad van de laser in VAEM. Merk op dat de toetreding van de laser wordt gekanteld, en het verlicht oppervlak van het monster met variabele diepte. (D) VAEM afbeeldingen van dezelfde regio, zoals in (B). Schaal balk geeft 5 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. kymograaf analyse te kwantificeren van een GFP-PATROL1 dot de verblijftijd. Image (A) VAEM met een rechte lijn geplaatst om een kymograaf maken. Schaal balk geeft 5 micrometer. Een afbeelding kymograaf langs de in (A) lijn (B). (C) Een binair beeld (B) op basis van Yen algoritme gegenereerd Fiji software. Gele lijnen geven de automatisch-gedetecteerde regio GFP-PATROL1 signaal. (D) Screenshot van de resultaten tabel van de Fiji "Analyseren Particles" functie. (E) een histogram van GFP-PATROL1 dot de verblijftijd in dochteronderneming cellen. De rode lijn toont de functie dichtheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze video artikel, zijn protocollen gegeven voor het bewaken en meten van het dynamische gedrag van GFP-PATROL1 stippen op de stomatale complex van Arabidopsis thaliana. Zoals hier getoond, VAEM observatie is een krachtig hulpmiddel voor live-beeldvorming van plantencel oppervlakken. Onder dezelfde omstandigheden hier voor GFP-PATROL1 controle, was er zeer weinig fluorescentie fotobleken in de voor 1 min video capture monster, omdat de zeer gevoelige EM-CCD maakt het gebruik van een relatief zwakke laser VAEM excitatie optica. Laser centreren en focussen, voor het begin van elk experiment zijn belangrijk voor een succesvolle VAEM observatie. Gebruikers moeten worden opgeleid door professionele medewerkers van de gekozen microscoop bedrijf voordat u VAEM.
VAEM blijkt dat GFP-PATROL1 heeft een dynamische lokalisatie met een immobiele dot-achtige compartiment knippert op het plasmamembraan. De fluorescerend-gemerkte plasmamembraan protonpomp AHA1 mis-localizes in patrol1 mutant sluitcellen en dochter cellen, zoals eerder gemeld 8,9. Aldus kan de VAEM gevisualiseerd GFP-PATROL1 punt dynamiek levering van het proton pomp in de plasmamembraan vertegenwoordigen. Het dynamisch gedrag van GFP-PATROL1 moeilijk te visualiseren met gebruikelijke galvanometerspiegel type confocale laser scanning microscopie, waarin de bruikbaarheid van VAEM blootleggen real-time eiwitdynamica op plant celoppervlakken. GFP-PATROL1 observatie is slechts één voorbeeld van VAEM toepassing in plantaardige celbiologie. VAEM zou van toepassing zijn op de monitoring van de talrijke evenementen in de dunne corticale laag van cytoplasma in plantencellen (bijvoorbeeld, enzym secretie in celwand synthese of wijziging 11,12, plasma membraaneiwit dynamiek 7,13,14, corticale microtubuli dynamiek 4, herschikking van actine microfilamenten 4,15 en organel beweging 6). Een breed scala aan plantencel wetenschappers moeten benefit uit VAEM technieken.
Kwantitatieve evaluatie van biologische beeldgegevens heeft onlangs belangrijk geworden, gedreven door de vooruitgang in de microscoop apparatuur en computers. VAEM filmgegevens met 512 (X) x 512 (Y) x 600 (t) pixels kan gemakkelijk worden verkregen in slechts enkele minuten. Beeldanalyse helpt niet alleen bij het meten van de levensduur of verplaatsing van een fluorescent-gemerkte eiwitten, maar ook in de mijnbouw biologische informatie van grote, multidimensionale afbeelding datasets. Een kymograaf is een eenvoudige, doch waardevolle benadering bepalen doeleiwit beweging van VAEM filmgegevens, zoals blijkt uit de sequentiële rekrutering van eiwitten op plasmamembranen 2. De toegestane kymograaf de visualisatie van verblijftijden het GFP-PATROL1 dots "en hun lage beweeglijkheid op plasmamembranen, zie figuur 4. Omgekeerd heeft een beperkte effectiviteit kymograaf gaan meer gecompliceerde bewegingen, zoals cytoplasmastroming. Voor meer compliven beweging, andere beeldanalyse benadert zoals optische stroom 16 zou nuttig zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteur heeft niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted microscope | Olympus | IX-73 | |
| TIRF unit | Olympus | IX3-RFAEVAW | |
| TIRF objective lens | Olympus | UAPON 100 × OTIRF | NA = 1.49 |
| Laser angle control box | Chuo Seiki | QT-AK | |
| Optically pumped semiconductor laser | Coherent | SapphireTM LP USB 488-20 CDRH Laser | |
| 510–550 nm band-pass filter | Olympus | U-FBNA | |
| EM CCD camera | Hamamatsu Photonics | ImagEM C9100-13 | |
| C-mount camera magnification change unit | Olympus | U-TVCAC | |
| MetaMorph software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.7.11.0 | |
| TIRF microscopy manual | Olympus | AX7385 | Instructions: Total Internal Reflection Illumination System (Printed in Japan on August 24, 2012) |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Typr-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
References
- Konopka, C. A., Bednarek, S. Y. Comparison of the dynamics and functional redundancy of the Arabidopsis dynamin-related isoforms DRP1A and DRP1C during plant development. Plant Physiol. 147 (4), 1590-1602 (2008).
- Fujimoto, M., et al. Arabidopsis dynamin-related proteins DRP2B and DRP1A participate together in clathrin-coated vesicle formation during endocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (13), 6094-6099 (2010).
- Higaki, T., Sano, T., Hasezawa, S. Actin microfilament dynamics and actin side-binding proteins in plants. Curr. Opin. Plant Biol. 10 (6), 549-556 (2007).
- Rosero, A., Žársky, V., Cvrčková, F. AtFH1 formin mutation affects actin filament and microtubule dynamics in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 64 (2), 585-597 (2013).
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2 (11), 764-774 (2001).
- Konopka, C. A., Bednarek, S. Y. Variable-angle epifluorescence microscopy: a new way to look at protein dynamics in the plant cell cortex. Plant J. 53 (1), 186-196 (2008).
- Wan, Y., Ash, W. M., Fan, L., Hao, H., Kim, M. K., Lin, J. Variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy of intact cells of Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 7 (27), (2011).
- Hashimoto-Sugimoto, M., et al. A Munc13-like protein in Arabidopsis mediates H+-ATPase translocation that is essential for stomatal responses. Nat. Commun. 4, 2215 (2013).
- Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells. Plant Cell Physiol. 55 (4), (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Chebli, Y., Kaneda, M., Zerzour, R., Geitmann, A. The cell wall of the Arabidopsis pollen tube-spatial distribution, recycling, and network formation of polysaccharides. Plant Physiol. 160 (4), 1940-1955 (2012).
- Fujimoto, M., Suda, Y., Vernhettes, S., Nakano, A., Ueda, T. Phosphatidylinositol 3-kinase and 4-kinase have distinct roles in intracellular trafficking of cellulose synthase complexes in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 56 (2), 287-298 (2015).
- Li, X., Wang, X., Yang, Y., Li, R., He, Q., Fang, X., Luu, D. T., Maurel, C., Lin, J. Single-molecule analysis of PIP2; 1 dynamics and partitioning reveals multiple modes of Arabidopsis plasma membrane aquaporin regulation. Plant Cell. 23 (10), 3780-3797 (2011).
- Li, R., Liu, P., Wan, Y., Chen, T., Wang, Q., Mettbach, U., Baluska, F., Samaj, J., Fang, X., Lucas, W. J., Lin, J. A membrane microdomain-associated protein, Arabidopsis Flot1, is involved in a clathrin-independent endocytic pathway and is required for seedling development. Plant Cell. 24 (5), 2105-2122 (2012).
- Staiger, C. J., Sheahan, M. B., Khurana, P., Wang, X., McCurdy, D. W., Blanchoin, L. Actin filament dynamics are dominated by rapid growth and severing activity in the Arabidopsis cortical array. J. Cell Biol. 184 (2), 269-280 (2009).
- Ueda, H., et al. Myosin-dependent endoplasmic reticulum motility and F-actin organization in plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (15), 6894-6899 (2010).
