This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.
This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex.
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.
To-foton mikroskopi revolusjonert observasjon av hjernens aktivitet i levende og oppfører seg dyr. Siden introduksjonen i 1990 det raskt vunnet popularitet og er nå implementert som en av de mest interessante og nyskapende tilnærminger til undersøkelse av mange aspekter av hjernens aktivitet in vivo 1,2. Disse programmene omfatter blodstrømsmåling, neuronal aktivering (for eksempel ved hjelp av kalsium nivåindikatorer eller umiddelbare tidlige gener uttrykk) og morfologi av nerveceller. Et økende antall laboratorier bruker to-foton mikroskop, implementere teknikken i hele den vitenskapelige verden som en ny standard for in vivo avbildning av hjernen.
Standarden tilnærming innebærer implantering av kranie vinduet (et rundt hull i kraniet dekket med et dekkglass) over løpet eller visuelle cortex av mus hjernen tre. Neste, avhengig av den eksperimentelle protokollen, mouse gjennomgår en serie av visualisering og atferdsmessige kurs, slik at for å overvåke endringer i hjerneaktivitet og neuronal morfologi over tid 4,5. I begge tilfeller kraniotomi påvirker bare isse benet, uten å krysse suturene. Det er i stor grad antas at den viktigste ulempen av teknikken er dens begrensede søknad til lett tilgjengelige cortexes eksempel fat eller visuell cortex. Implantasjon av kranie vinduet over andre områder utgjør en rekke vanskeligheter, på grunn av overdreven blødning og / eller romlig hindring.
I denne artikkelen foreslår implantasjon av den kraniale vinduet ovenfor retrosplenial cortex (RSC) som et annet mulig område av interesse for to-foton in vivo 6 mikroskopi. RSC er en viktig del av hjernen krets ansvarlig for romlig minne formasjon. Anatomisk, RSC er en del av en nevronale nettverk å koble cortical, hippocampus, og thalamic regioner 7. Det ersterkt involvert i en rekke atferd, for eksempel romfølelse og utryddelse samt romlig navigasjon seks.
For å visualisere de morfologiske endringer av nevroner bruker vi en transgen muselinje som uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP) under thy1 promoteren. I disse musene, er GFP uttrykt i omtrent 10% av nevronene i hjernen som muliggjør klar visualisering av kortikale aksoner og dendritter ved hjelp av to-foton mikroskopi 8. En annen oppfinnelse som vi foreslår er injeksjon av en rekombinant adeno-assosiert virus serotype 2/1 (rAAV2 / 1) som koder et rødt fluorescerende protein (mCherry) under en neuron-spesifikk promoter CaMKII 9 inn i de dypere strukturer i hjernen som rager til RSC , slik som hippocampus. Ekspresjonen av rAAV2 / 1 mCherry i hippocampus av Thy1-GFP mus muliggjør samtidig visualisering av pre- og postsynaptisk elementer av Hippocampo-Cortiçal synapser 10. Den rAAV-drevet ekspresjon av mCherry krever to til tre uker for proteinet for å oppnå et tilstrekkelig nivå i de aksonale terminalene. Denne perioden er i overensstemmelse med den vanlige tid som kreves for utvinning fra kraniotomi.
I dagens papir presenterer vi en protokoll for simultan to-foton in vivo avbildning av de synaptiske innganger og postsynaptisk mål i RSC gjennom en cranial vindu. Den implanteringsoperasjon bestå av flere viktige trinn. Først blir dyret dypt bedøvet, og festet i stereotaktisk ramme, deretter skallen i løpet av RSC er fortynnet med en drill langs de merkede sirkulære linjer, og det sirkulære ben er fjernet. Etter at blødningen er stoppet, blir den rAAV2 / 1 mCherry injisert i hippocampus, og …
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke M. Steczkowski for taleopptak, M. Borczyk for tegninger, A. Trąbczyńska for virusproduksjon, M. Ziókowska for genotyping og A. Mirgos for å få hjelp med filming. KR erkjenner velvillig gave av det rekombinante adeno-assosiert virus (rAAV) som uttrykker fluorescerende protein mCherry under kontroll av promoteren fra CaMK K. Deisseroth. Dette prosjektet ble gjennomført på kjernefasiliteter av Laboratory dyremodeller og laboratorium Tissue struktur og funksjon, Centre of nevrobiologi, NENCKI Institute of Experimental Biology, med bruk av CEPT infrastruktur finansiert av EU – European Regional Development Fund innen Handlingsprogrammet "Innovative Economy" for 2007-2013. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Science Centre: Sonata Bis 2012/05 / E / NZ4 / 02996, Harmonia 2013/08 / M / NZ3 / 00861, Symfonia 2013/08 / W / NZ24 / 00691 til KR og Sonata Bis 2014 / 14 / E / NZ4 / 00172 til RC
Drug | |||
Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 5-2% pre-operative |
Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 1.5-2% during surgery |
Dexametasone | Scan Vet | Dexasone 2mg/ml | 0.2 mg/kg intramuscular |
Baytril | Bayer | 2.50% | 5 mg/kg subcutaneously |
Tolfedine | Vetoquinol | 4% | 4 mg/kg subcutaneously |
Butomidor | Richter Pharma | 10 mg/ml | 2 mg/kg subcutaneously |
Carprofen | KRKA-Polska | Rycarfa 50mg/ml | 10 mg/kg subcutaneously |
Lidocaine | Jelfa | Lignocainum | topically |
Lidocaine | Jelfa | 20 mg/g | topically |
Surgery | |||
Gelfoam | Ethicon | Spongostan dental; REF MS0005 | |
Eye ointment | Dedra | Lubrithal | topically |
CA glue | Pelikan Daniel | 20G Huste | |
Dental acrylic | SpofaDental | Duracryl Plus | |
Stereotaxic frame | Stoelting | 51500D | |
Tool | |||
Coverglass | Harvard Apparatus | HSE-64-0720 | 3 mm diameter |
Dental drill | Sigmed | Keystone KVet | |
Fixation bar | Custom made | N/A | M2 or M3 screw nuts could be used |
Forceps | Renex | PN-7B-SA | |
Micro scissors | Falcon | BM.183.180 | |
Dissection microscope | KOZO | XTL6445T | |
Imaging | |||
Holder frame | Custom made | N/A | |
Two-photon microscope | Zeiss | Upright Axio Examiner Z1 | Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm with Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectives: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 and LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detection: Zeiss bandpass filters BP 500-550 (GFP) and BP 570-610 (mCherry) separated by beam splitter at 560nm and coupled to two GaAsP photodetectors. |
Reagent | |||
Virus | gift from K. Deisseroth | Recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing fluorescent protein mCherry under the control of CaMK promoter |