Abstract
因为结构和功能同源性的哺乳动物内耳的毛细胞，即支配果蝇外部感觉器官的神经元提供机械感觉的研究的优良模型系统。这个协议描述在果蝇中，可用于识别与机械感觉干扰突变简单的触摸行为。一个macrochaete的触觉刺激刷毛上的苍蝇的胸部引出一清洁反射从第一或第三站。与机械传导（如NOMPC）干扰的突变，或者与反射弧的其他方面，可以抑制疏导响应。成人行为的传统画面就会错过这一发展过程中发挥重要作用的突变体。相反，该协议结合镶嵌分析与阻遏细胞标记物（MARCM）触摸屏，以允许纯合突变细胞中，只有有限的区域由EXPR生成并标分裂国家绿色荧光蛋白（GFP）的。通过测试MARCM克隆为异常的行为反应，有可能筛选的致死对元件的突变的集合以寻找涉及机械感觉新基因，将已经错过由更传统的方法。
Protocol
1.十字到生成MARCM苍蝇
- 保持苍蝇玉米面糖蜜培养基（6.5克/升琼脂; 23.5克/升酵母; 60 g / L的玉米面; 60毫升/升糖蜜; 4毫升/升酸混合物; 0.13％Tegosept）或标准果蝇介质在22摄氏度在12小时的光照/黑暗循环。
注：比标准温度下是用来保持MARCM-股健康。这延伸到14天蛋和成年之间的发育时间。 - 从一个MARCM就绪库存 - （8日龄约1）含有必要的遗传元件（GFP的上游活化序列（UAS-GFP）的GAL80阻遏蛋白，该Gal4的转录因子，的控制下使用处女雌性热休克驱动的重组，和FRT重组位点）。
注：我们MARCM现成的个股包括以下基因型：elavGal4，UAS-CD8-GFP，HS-flipase; FRT40A，tubGal80 / CYO; tubGal4 / TM3Sb。
注意：特定FRT位点，将取决于突变的位置在基因组中。例如，FRT40A用于左臂2号染色体，如NOMPC（见10的更多详细信息MARCM协议）测试突变。 - 交叉MARCM就绪处女雌性到男性包含感兴趣的突变和其相应的FRT位点（例如，W-; NOMPC3，FRT40A / CYO + / +）。为了控制有效MARCM感应，设置使用雄性苍蝇含有相同FRT位点的第二交叉，但没有突变。使用5位女性的大致比例：1男在十字架。
2.定时产卵
- 使苍蝇交配用于至少一个晚上后，移动大人到新的小瓶中，用新鲜培养基。允许苍蝇之前再次转移杂交到新的小瓶产卵在黑暗环境中进行大约为4小时。注意产蛋期的开始和结束时间。
注意：当似乎有高数量的媒体卵经4小时interva结束之前更短的时间间隔是可以接受的湖- 保持小瓶鸡蛋足够数量（大约大于20），并存储在一个12小时的光/暗周期在22摄氏度至晚热冲击。
注意：小瓶用鸡蛋的介质上一个数低（小于大约20）是不可能产生足够数量的成蝇对于行为测试和效率起见，建议他们不被保留用于进一步的测试。
注：我们的苍蝇就提出用灯光从早上8点到晚上8点。我们已经找到了傍晚的时候分的领先优势，以更高的蛋密度，因此通常执行4之间定时十字 - 晚上8点到晚上8点 - 午夜。苍蝇奠定在室温下的鸡蛋放在一个黑暗的橱柜，然后返回到孵化第二天，以免干扰常规明暗周期在孵化器。
- 保持小瓶鸡蛋足够数量（大约大于20），并存储在一个12小时的光/暗周期在22摄氏度至晚热冲击。
3.执行热休克来诱导有丝分裂重组
- 大约85 - 产蛋后100小时，地点vIALS进入水浴在37摄氏度下1小时。确保水位到达媒体在小瓶的高度以上，但不完全淹没小瓶以防止幼虫溺水。
- 从水浴中取出药瓶，并允许在室温下1小时的恢复期。
- 地方小瓶放回37摄氏度的水浴中1小时。
- 取下水浴和存储小瓶在孵化器12小时光照/黑暗周期在22摄氏度左右，直至羽化。
4.准备行为测试
- 羽化之后，麻醉苍蝇在冰上。选择苍蝇与包含所有为MARCM遗传元件和表示GFP表达标记的克隆很可能会根据在父个股中使用的可观察到的表型的标记物观察到的基因型。斩首苍蝇与虹膜切除术剪刀。
注：例如，我们选择了苍蝇不遗传标记CYO（大翅膀）和Sb（茬毛）来鉴定FY苍蝇，将包含所有必要创造马赛克区域的遗传元件标有绿色荧光蛋白。
注：斩首是既要防止成年人，当刺激飞走。 - 放置无头苍蝇在封闭，潮湿的环境，并允许约10 - 20小时的恢复。只有用苍蝇这种权利本身扰动时进行进一步的测试。 30小时断头内的测试飞行。
5.行为测试
- 通过荧光解剖显微镜下观察断头苍蝇，发现标有绿色荧光蛋白的猪鬃外部感觉器官纯合子克隆。记录刷毛名称和左，右两侧。以消除任何潜在的偏见，该实验室构件进行刷毛刺激应盲目刷毛，野生型或突变体的基因型。
- 通过偏转GFP引发疏导反射标塞得满满的向飞机身采用了硬毛或细镊子，观察腿再sponse。给苍蝇解除他们的腿在应对猪鬃刺激和苍蝇不动自己的腿得分为零分之一。
注：以前的研究6,7有特点的是通过刺激特定的刷毛引起腿部的反应。这包括，响应各刷毛的腿和苍蝇该特定刷毛刺激响应的比例。我们只打进了我们预期的基础上Vandervorst的分类6响应腿的动作。 - 开展间隔2分钟间隔五位审判。
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Representative Results
此协议的成功在很大程度上依赖于可检验的苍蝇的总产率，热休克的有效性以诱导有丝分裂重组，并获得在果蝇以2分钟的间隔刺激一个健壮的行为反应的能力。鉴于胚胎的估计12.5％包含必要MARCM元素和成年人E关闭对GFP表达的潜在的估计的16.67％，这是关键的期间定时规定以获得高数鸡蛋。一个成功的定时的一个例子笼罩，将在该协议的其余部分被用来显示在图1A中一个4小时的时间间隔。
当热冲击，进行85 - 产卵后100小时，绿色荧光蛋白的产量标记外部感觉器官是最高的，具有标示的macrochaetae的一个最苍蝇。许多感兴趣的领域可能包含纯合子细胞testabl的基地当热冲击是在这段时间内进行，与背部中央和后翼状刚毛被发现标记最常见（ 图2A）电子刷毛。此窗口导致GFP表达的补丁的兴趣或无GFP表达（图2B）的体区的周边以外的时间点。
苍蝇自然地发起逃避反应19到若隐若现的刺激作出反应。为了防止苍蝇逃跑，我们断头苍蝇。疏导响应电路丝毫无损于腹神经索5。苍蝇不恢复好，如果在二氧化碳麻醉断头，但与在冰上冷麻醉断头恢复在几个小时。断头后，苍蝇应在恢复期以防止干燥储存在一个封闭的，潮湿的环境。虽然一些苍蝇可能变干或无法站立（ 图1B），只有那些能够站（图1C）用于测试。在测试之前，苍蝇被触摸到notum后观看运动检查一般反应性。许多苍蝇保持响应了好几天，但是测试应该由24完成 - 斩首后36小时。飞动可以在行为测试一个问题，因为观察者可能难以真正刺激相关的疏导响应和飞一般的动作加以区分。在动物与未由触觉刺激引起过量运动，更可靠的结果是通过等待亢进蝇成为静态实现。
我们发现，野生型果蝇的47％上的刷毛触摸五次，隔开2分钟的间隔，以防止习惯时响应至少一次。几个小组已经表明，不同刷毛刺激引起从一个特定腿6,7的图案化反应）6-。在我们的实验中，野生型果蝇的控制响应轻触从14％（背部中央）审判的86％（能登胸膜）（ 图3）。在具有未知突变一个MARCM基屏幕上，可以预期那些含有不参与机械感觉突变苍蝇表现出类似野生型对照动物中观察到了可靠的行为反应。
已知的机械敏感突变，NOMPC打乱了疏导响应预期。控制苍蝇回应刷毛刺激在纯合克隆后鼻翼刷毛的时间的37％（图4）。与此相反，与刷毛动物是纯合NOMPC响应的时间的2％（图4）。虽然野生型果蝇重spond不同，以不同的刷毛刺激，这些结果表明，一个机械敏感突变，如NOMPC，几乎消除了修饰反应。在未知的突变体屏幕，涉及机械感觉一些基因突变，抑制梳理响应预期。
图1.正确育苗条件要求的最优行为测试。 （一）胚胎的足够数量的需要继2 - 4小时产蛋期。胚胎的一个4小时定时捻后的数字是可能产生成人足够数量的苍蝇为行为测试。（B）在下列断头恢复期，一些苍蝇不存活，并且可以在进一步的测试中使用。（C）的 ，在恢复期被妥善存放在潮湿环境中的断头苍蝇可测试的行为分析。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2. MARCM在克隆猪鬃时，热休克85之间- 100小时后产蛋。成人（A）GFP表达苍蝇时，热冲击98 - 101小时产卵后。多达10 macrochaete刚毛包含纯合突变的外部感觉器官和适合的测试，在疏导响应行为分析成人（B）GFP表达苍蝇时，热冲击161 -产卵后164小时。注意在macrochaete刷毛基地缺乏GFP表达，表明在测试的外部感觉器官没有补丁纯合子细胞。arge.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图3.响应触觉刺激的频率取决于鬃毛认同。的单个飞到单个刷毛刺激响应的总数目除以刺激的数目，得到的百分比响应。百分比的平均值为每个鬃（苍蝇N =＃测试，22后阿拉尔，21背中央14，盾片，7 Notopleural）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4. NOMPC突变体不响应的P 触觉刺激。刺激OST-鼻翼刷毛引起野生型MARCM克隆的响应。然而，在后翼刷毛那名NOMPC 3 MARCM克隆的刺激- / - （绿色条）导致了一些反应（N = 23的野生型和12 NOMPC - / - ）。 请点击此处查看大图这个数字。
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Discussion
这个协议利用一个成人行为分析以筛选影响机械感觉在果蝇的突变。因为突变体的集合包含致死对元件的突变，将排除筛选作为成年人，该协议使得使用第一Lee和罗述的复杂的遗传技术的，（1999年）和详细的协议吴，罗，（2006年），以规避成人杀伤力。 MARCM诱导同源染色体之间有丝分裂重组以产生纯合细胞的克隆的区域。因为阻遏蛋白，浴盆-GAL80中有丝分裂重组发生的损失的这些区域都标有GFP。通过使用MARCM产生细胞，其纯合在特定遗传基因座，基因功能可以研究在成年果蝇使用各种方法，包括在本文中所描述的行为测定。
的主要因素限制的数量和具体的基因，可以bË测试是FRT位点的蝇的基因组中的存在。蝇股票必须包含FRT位点上的目标突变的染色体臂。 MARCM准备飞股票必须包含相同的FRT位点的突变染色体允许有丝分裂重组。在我们的实验室，我们开发了含MARCM背景的FRT40A和FRT42D网站飞股票。这些股票将使我们能够筛选已经结合相应的FRT位点上的2L和2R染色体臂任何一个成年人致命的P-元，分别。为了最大限度地提高MARCM在屏幕的影响力传导或疏导反射，额外的飞股票与MARCM背景能够在第三号染色体的双臂和X染色体会产生基因检测突变的潜力。一旦开发成功，这些股票将允许大多数成年致命的对元件的突变结合FRT网站被用于参与机械感觉测试。
热的sh的定时玉珠协议已被开发以最大化纯合细胞的区域的数量在外部感觉器官，同时留下许多飞杂的其余部分在感兴趣的位点。许多感兴趣的区域可以按照以下一个双热休克GFP表达作标记，允许多个刷毛被测试（ 图2）。该MARCM协议提供了一个极好的机会来创造感兴趣的特定区域的纯合子致死突变，但我们的MARCM协议依赖于重组活动的热休克诱导，使之成为一个随机过程哪个刷毛最终将测试。因为每个鬃引出一个特定的腿修饰反射6,7，重要的是为我们证实，在野生型MARCM克隆的反应是媲美先前描述。最大化MARCM型屏幕的效率需要测试任何的macrochaete刷毛的突变响应和比较这些DAT能力一对来自一个MARCM，现货相应的刷毛的响应速度。我们已经在刷毛MARCM苍蝇表达GFP证实Corfas和杜达伊7的结果 。
至正常和异常蝇行为反应容易区分的能力是至关重要的，以确定哪些突变与机械传导干扰。在涉及机械传导或疏导反射应该抑制腿部响应等方面的基因的突变;一个显著降低响应速度在MARCM-现货相应的刷毛的预期。在镶嵌NOMPC和野生型果蝇的行为反应率充当该MARCM基于行为屏幕可用于mechanosensory突变体和正常果蝇区分原理的证据。我们已经表明，在NOMPC突变镶嵌克隆，以应对猪鬃刺激疏导反射几乎废止。只有两只苍蝇的十四测试的表现一条腿的反应。每个这些果蝇的答复只能进行一次测试过程中，这表明MARCM基于行为测定是在识别机械感觉缺陷有效。一名观察员机械敏感突变可以区分苍蝇，苍蝇没有突变或与未参与疏导响应的突变。因为在野生型应答的高度变异性，屏幕会识别那些强有力的等位基因，但很可能会错过由于较弱的等位基因更微妙的行为变化。突变体的集合，被筛选仅包括纯合致死基因，因此它很可能是这些是强或无效等位基因，并有可能取消蛋白质功能。然而，屏幕将错过等位基因可能是致命的发展，但是，当在更有限的方式，通过MARCM制成纯合产生更细微mechanosensory缺陷。
我们选择了一个全或无的评分系统的简单性。这种方法产生一个慷慨得分相比使用Corfas和杜达伊7的系统，该系统分配的评分为0 - 4取决于腿部运动的程度。在全或无的系统中，任何给出响应充分信用的假设，即对刺激的任何响应指示感觉系统正在检测的刺激和信令到电机系统。
该屏幕可以找出影响的行为电路的任何步骤突变。进一步的测试，如电（如在克南等人 5）或钙成像，将必须用于确定突变是否直接影响机械传导或感觉运动反射弧的发育或功能的一些其他方面。
果蝇为机械感觉的研究一个很好的模型系统。外部感觉器官与哺乳动物内耳的毛细胞许多共同的结构和功能上的相似20。参与这一过程在果蝇分子阐释有揭示哺乳动物同系物和直向同源物的潜力。屏幕旨在发现突变，破坏机械感觉会铺路随后的细胞生物学，电生理和生化研究，以进一步确定和表征这些分子，加深我们对这个过程既果蝇和哺乳动物的认识。一个MARCM为基础的屏幕影响机械感觉会使用搭配疏导响应行为分析行之有效的基因技术来揭示涉及机械传导和飞疏导反射新的基因突变。
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Disclosures
作者有没有竞争经济利益。
Acknowledgments
作者谨感谢布卢明顿股票中心，利群罗，查尔斯·朱克和莉莉和裕侬扬慷慨分享飞股票及以下资金：肉体-URM（以JD和SW），本科福特学院暑期奖学金（申银万国），BD公司暑期研究奖学金（以CL和DL），该蕾妮和Anthony M.马龙，MD '63暑期研究奖学金（以DL），詹姆斯·'75和简Colihan暑期研究奖学金（TO）通过校友/圣十字学院的家长暑期研究基金和Stransky基金会暑期研究奖学金（为TO）。特别感谢生物系和教务处在学院的圣十字对实验室全部工作的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brewers Yeast (25 lb) | MP Biomedicals | ICN90331225 | Fly Food |
| Corn (25 lb) | MP Biomedicals | ICN90141125 | Fly Food |
| Agar (1 lb) | MoorAgar Inc. | 41004 | Fly Food |
| Tegosept (5 kg) | Genesee | 20-259 | Fly Food |
| Molasses (1 Gallon) | Sugarmill Brand - Thomsen Food Service | 0 2625 | Fly Food |
| Propionic Acid | Fisher | A258-500 | Fly Food |
| Phosphoric acid | Fisher | A260-500 | Fly Food |
| Drosophila Vials, Narrow (PS) | Genesee | 32-109 | Fly Cultures |
| 6oz Square Bottom Bottle (PP) | Genesee | 32-130 | Fly Cultures |
| Flugs - Plastic Fly Bottles | Genesee | 49-100 | Fly Cultures |
| Rayon Balls, Large | Genesee | 51-100 | Fly Cultures |
| Droso-Filler, Narrow | Genesee | 59-168 | Fly Food Preparation |
| Droso-Filler, Bottles | Genesee | 59-170 | Fly Food Preparation |
| 8A-C / gear driven lab stirrer with c-clamp mount 1/15 HP, 700 rpm variable speed, 115 V, 50/60 Hz | Cleveland Mixer | 8A-C | Fly Food Preparation |
| Water jacketed Kettle | Fly Food Preparation | ||
| Diurnal Growth Chamber | Forma Scientific | Temperature and light/dark cycle controlled | |
| Water bath | VWR | For heat shock | |
| MicroScissors | Fine Science Tools | 15000-08 | For removing heads |
| Fluroscence Dissecting Microscope | Zeiss | SteREO Discovery V8 | With GFP cube (KSC295-814D) band pass filter |
| Fluroscence Light Source | Zeiss | X-Cite 120 | Fiber optic light pipe makes this easy to configure |
| Camera for Scope | Zeiss | AxioCam ICc1 | |
| Image acquistion software | Zeiss | ||
| Ice bucket | for cold anthesia | ||
| Homemade cold anthesia tray | for cold anthesia decapitation | ||
| Plastic boxes | for recovery of decaptitated flies in humid environment |
References
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