Abstract
En raison de l'homologie structurelle et fonctionnelle des cellules ciliées de l'oreille interne chez les mammifères, les neurones qui innervent les organes sensoriels externes Drosophila constituent un excellent système modèle pour l'étude de mécanosensibilité. Ce protocole décrit un comportement simple tactile dans les mouches des fruits qui peuvent être utilisés pour identifier les mutations qui interfèrent avec mécanosensibilité. La stimulation tactile d'un macrochaete poils sur le thorax de mouches déclenche un réflexe de damage de la première ou la troisième branche. Les mutations qui interfèrent avec la mécanotransduction (comme NOMPC), ou avec d'autres aspects de l'arc réflexe, peuvent inhiber la réponse de toilettage. Un écran traditionnel de comportements adultes aurait manqué mutants qui ont des rôles essentiels au cours du développement. Au lieu de cela, ce protocole combine l'écran tactile avec l'analyse de la mosaïque avec un marqueur de cellule répressible (marcm) pour permettre seules régions limitées de cellules mutantes homozygotes pour être généré et marqué par l'expression de la protéine fluorescente verte (GFP). En testant clones marcm des réponses comportementales anormales, il est possible de cribler une collection de mutations létales p-éléments à chercher de nouveaux gènes impliqués dans mécanosensibilité qui auraient été manqués par des méthodes plus traditionnelles.
Protocol
1. Croix pour générer Flies marcm
- Maintenir des mouches sur les médias semoule de maïs de la mélasse (6,5 g / L d'agar; 23,5 g / L de levure; 60 g / L de farine de maïs, 60 ml / l mélasse; 4 ml / L mix d'acide; 0,13% Tegosept) ou des médias Drosophila standard à 22 degrés Celsius dans un cycle de lumière de 12 h / sombre.
REMARQUE: Un inférieure à la température standard est utilisé pour garder marcm-stocks en bonne santé. Ceci augmente le temps de développement entre l'œuf et l'âge adulte à 14 jours. - Utilisez des femelles vierges (environ 1 - âgées de 8 jours) à partir d'un stock marcm prêt contenant les éléments génétiques nécessaires (GFP sous le contrôle d'une séquence en amont d'activation (UAS-GFP), la protéine répresseur GAL80, le facteur de transcription Gal4, un choc thermique de recombinase entraîné, et un site de recombinaison FRT).
Note: Notre marcm ready-titres contiennent les génotypes suivants: elavGal4, UAS-CD8-GFP, hs-flipase; FRT40A, tubGal80 / CYO; tubGal4 / TM3Sb.
Remarque: Le site FRT spécifique dépendra de la localisation de la mutationdans le génome. Par exemple, FRT40A est utilisé pour tester des mutations sur le bras gauche du chromosome 2, comme NOMPC (voir 10 pour plus de détails sur les protocoles de marcm). - Cross femelles vierges marcm prête aux hommes qui contiennent une mutation d'intérêt et de son site correspondant FRT (par exemple, W; NOMPC3, FRT40A / CYO; + / +). Pour contrôler pour l'induction de marcm efficace, mettre une deuxième croix utilisant mouches mâles contenant le même site FRT, mais sans une mutation. Utilisez un rapport approximatif de 5 femelles: 1 mâle dans les croisements.
2. Timed ponte
- Après avoir laissé les mouches à accoupler pour au moins une nuit, déplacer adultes dans de nouveaux flacons de milieux frais. Autoriser les mouches pondent leurs œufs dans un environnement sombre pendant environ 4 heures avant de le transférer à nouveau les croix dans de nouveaux flacons. Notez les heures de début et de fin de la période de ponte.
Remarque: Des intervalles plus courts sont acceptables quand il semble y avoir un nombre élevé d'œufs sur les médias avant la fin de la InterVA 4 heuresl.- Gardez les flacons avec un nombre suffisant d'oeufs (environ plus de 20) et de stocker dans un cycle de lumière de 12 h / obscurité à 22 degrés Celsius pour être un choc thermique plus tard.
Remarque: les flacons avec un faible nombre d'œufs sur le support (inférieure à environ 20) sont peu susceptibles de rapporter un nombre suffisant de mouches adultes pour les tests de comportement et dans l'intérêt de l'efficacité, il est recommandé qu'ils ne peuvent être conservés pour des tests supplémentaires.
Note: Nos mouches sont élevés avec les lumières sur 8 heures-20 heures. Nous avons trouvé le temps du soir points d'avance à la densité des œufs plus élevés, donc généralement effectuer des croisements entre chronométrés de 4 - 8 heures et 20 heures-minuit. Les mouches pondent leurs œufs à la température ambiante dans un cabinet noir, puis sont retournés à l'incubateur de la journée suivante, afin de ne pas perturber le cycle lumière-obscurité régulière dans l'incubateur.
- Gardez les flacons avec un nombre suffisant d'oeufs (environ plus de 20) et de stocker dans un cycle de lumière de 12 h / obscurité à 22 degrés Celsius pour être un choc thermique plus tard.
3. Effectuer Heat Shock pour Provoquer recombinaison mitotique
- Environ 85 à 100 heures après la ponte, place vEIAA dans un bain d'eau à 37 degrés Celsius pendant 1 heure. Assurez-vous que le niveau de l'eau atteint dessus de la hauteur des médias dans les flacons, mais ne submergent pas pleinement les flacons pour empêcher les larves de la noyade.
- Retirer les flacons du bain d'eau et de permettre une période de récupération de 1 heure à température ambiante.
- Placer les flacons dos en 37 degrés Celsius bain-marie pendant 1 h.
- Retirer les flacons du bain d'eau et de stocker dans un incubateur sur la lumière cycle de 12 h / obscurité à 22 degrés Celsius jusqu'à l'éclosion.
4. Préparation pour la vérification comportementale
- Après l'éclosion, anesthésier les mouches sur de la glace. Sélectionnez les mouches avec des génotypes qui contiennent tous les éléments génétiques pour marcm et indiquent GFP clones d'expression marquée seront probablement observées sur la base des marqueurs phénotypiques observables utilisées dans les stocks de parents. Décapitez mouches avec iridectomie ciseaux.
Note: Par exemple, nous avons sélectionné pour les mouches sans les marqueurs génétiques CYO (Les ailes arrondies) et Sb (poils de barbe) pour identimouches fy qui contiennent tous les éléments génétiques nécessaires pour créer des régions mosaïque marquées à la GFP.
Remarque: Décapitation est nécessaire pour empêcher les adultes de se envoler quand ils sont stimulés. - Placez les mouches sans tête dans un environnement clos et humide et laisser environ 10 - 20 h de récupération. Seule l'utilisation vole ce droit eux-mêmes quand perturbée pour des tests supplémentaires. Essai vole dans les 30 heures de la décapitation.
5. tests comportementaux
- En observant vol décapités sous un microscope de dissection fluorescence, identifier des clones GFP marquées d'homozygotes chez les poils des organes sensoriels externes. Enregistrez le nom de poils et à gauche ou à droite. Pour éliminer tout risque de biais, le membre du laboratoire d'effectuer la stimulation de poils doit être aveugle au génotype de la soie, de type sauvage ou mutant.
- Susciter un réflexe de toilettage en déviant la GFP marqué poils vers le corps de la mouche avec un poil raide ou une pince fine et observer la répétition de la jamberéponse. Donnez une note de un à mouches qui lève la patte en réponse à la stimulation et à poils un score de zéro à mouches qui ne se déplacent pas leurs jambes.
Remarque: Des études antérieures 6,7 ont caractérisé la réponse de la jambe qui est provoquée par la stimulation d'un poil particulier. Cela comprend la jambe qui répond à chaque poil et la proportion de vol qui répondent à une stimulation de poils qui particulier. Nous seulement marqué pour les mouvements de la jambe qui nous nous attendions à répondre basé sur la classification de Vandervorst 6. - Mener cinq essais espacés 2 minutes d'intervalle.
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Representative Results
Le succès de ce protocole dépend en grande partie sur le rendement global de mouches vérifiables, l'efficacité du choc thermique pour induire la recombinaison mitotique, et la capacité d'obtenir une réponse comportementale robuste dans les mouches stimulées à intervalles de 2 min. Étant donné qu'environ 12,5% des embryons contient les éléments nécessaires marcm et environ 16,67% des adultes qui ont le potentiel Eclose pour l'expression de la GFP, il est essentiel d'obtenir un nombre élevé d'œufs pendant chronométré fixe. Un exemple d'un chronométré succès réside dans un intervalle de 4 heures qui serait utilisé dans le reste du protocole est représentée sur la figure 1A.
Lorsque le choc thermique est effectué de 85 à 100 heures après la ponte, le rendement de la GFP étiqueté organes des sens externes est le plus élevé, avec la plupart des mouches ayant l'un des macrochaetae marqué. De nombreux domaines d'intérêt peuvent contenir des cellules homozygotes dans les bases de testable poils lorsque les chocs thermiques sont effectuées dans cette période de temps, avec la dorsale poils centrale et post-alaires être trouvé marqué le plus fréquemment (figure 2A). Les points de temps à l'extérieur de cette fenêtre de résultat dans des plaques de l'expression de GFP à l'extérieur des régions de corps d'intérêt ou pas d'expression de GFP (figure 2B).
Les mouches naturellement répondre à un stimulus imminente par l'ouverture d'une réaction de fuite 19. Afin d'empêcher les mouches de se échapper, nous décapité mouches. Le circuit de réponse toilettage reste intact dans le nerf épinière ventrale 5. Les mouches ne récupèrent pas bien si décapité sous dioxyde de carbone anesthésie, mais se rétablissent en quelques heures lorsque décapité avec une anesthésie froid sur la glace. Après décapitation, vol doivent être stockés dans un environnement humide fermée pendant la période de récupération pour éviter la dessiccation. Alors que certaines mouches peuvent se dessèchent ou être incapable de se tenir (figure 1B),seulement ceux qui sont capables de se tenir (figure 1C) sont utilisés pour les tests. Avant l'essai, les mouches sont vérifiées pour la réactivité générale en regardant pour le mouvement après une touche à l'notum. Beaucoup de mouches continuent de répondre pendant plusieurs jours, mais les tests devraient être achevées en 24 - 36 heures après la décapitation. Fly hyperactivité peut être un problème pendant les essais de comportement parce que l'observateur peut avoir des difficultés à distinguer entre une vraie réponse toilettage stimulus-dépendante et mouvements généraux de la mouche. Chez les animaux avec un excès de mouvements, pas provoqué par la stimulation tactile, des résultats plus fiables sont obtenus par l'attente pour les mouches de devenir hyperactifs repos.
Nous avons constaté que 47% des mouches de type sauvage répondre au moins une fois lorsqu'il est touché à un poil cinq fois, espacées à intervalles de 2 min pour éviter l'accoutumance. Plusieurs groupes ont montré que la stimulation de différents poils suscite une réponse à motifs d'une jambe spécifique 6,7 6. Dans nos expériences, les mouches de contrôle de type sauvage ont répondu à une touche de lumière de 14% (dorsale centrale) à 86% (Noto-pleural) d'essais (Figure 3). Dans un écran basé marcm-avec des mutants inconnus, ces mouches contenant une mutation non impliqué dans mécanosensibilité peuvent être attendus pour présenter une réponse comportementale fiable similaire à celle observée chez les animaux témoins de type sauvage.
Le mutant mécanosensible connu, NOMPC perturbé la réponse toilettage comme prévu. Vol de contrôle ont répondu à poils stimulations à homozygote post-Alar cloné soies 37% du temps (Figure 4). En revanche, avec des poils d'animaux qui étaient homozygotes pour NOMPC répondu 2% du temps (figure 4). Bien-mouches de type sauvage recorres- différemment à la stimulation de différents poils, ces résultats suggèrent que mécanosensible une mutation, tel que NOMPC, élimine pratiquement la réaction de toilettage. Dans un écran avec des mutants inconnus, plusieurs mutations impliquées dans mécanosensibilité qui inhibent la réponse de toilettage sont attendus.
Figure 1. Proper conditions d'élevage sont nécessaires pour Optimal tests comportementaux. (A) Un nombre suffisant d'embryons sont nécessaires à la suite de la 2 - période de ponte d'œufs 4 h. Le nombre d'embryons après une mise chronométré de 4 heures est susceptible de produire un nombre suffisant de mouches adultes pour les tests de comportement. (B) Au cours de la période de récupération après la décapitation, quelques mouches ne survivent pas et ne peuvent pas être utilisés dans des tests supplémentaires. (C) Une mouche décapité qui a été correctement stocké dans un environnement humide pendant la période de récupération est vérifiable dans un test de comportement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. marcm clones à poils quand un choc thermique entre 85 à 100 heures après la ponte. (A) l'expression de la GFP dans les mouches adultes quand un choc thermique de 98 à 101 heures après la ponte. Autant que 10 poils macrochaete contiennent homozygotes mutantes organes sensoriels externes et sont appropriées pour les essais dans le test de comportement de réponse de toilettage (B) l'expression de la GFP dans les mouches adultes lorsque la chaleur choqué 161 -. 164 h après la ponte. Notez l'absence d'expression de la GFP dans les bases des poils macrochaete, indiquant aucun patch de cellules homozygotes à un organe sensoriel externe testable.arge.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. La fréquence de la réponse à la stimulation tactile dépend de soies identité. Le nombre total de réponses avec une mouche individuelle à la stimulation d'un seul poil a été divisé par le nombre de stimuli pour donner une réponse pour cent. Les pourcentages ont été en moyenne pour chaque poil (N = # de mouches testés, 22 Poster Alar, 21 dorsale centrale 14, scutellaires, 7 Notopleural). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Mutants NOMPC ne répondent pas à la stimulation tactile. Stimulation de la ppoils de Ost-Alar provoque une réponse dans les clones de marcm de type sauvage. Toutefois, la stimulation de clones marcm sur les poils après alaires qui étaient NOMPC 3 - / - (barre verte) a entraîné peu de réponses (N = 23 de type sauvage, et 12 NOMPC - / -). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Ce protocole utilise un test de comportement des adultes à l'écran pour les mutations qui affectent mécanosensibilité chez la drosophile. Parce que la collection de mutants contient létales mutations élément P qui empêcherait de dépistage que les adultes, ce protocole permet l'utilisation d'une technique génétique complexe d'abord décrit par Lee et Luo , (1999) et détaillée en tant que protocole par Wu et Luo, (2006) pour contourner la létalité adulte. Marcm induit recombinaison mitotique entre les chromosomes homologues à générer des régions de cellules clonales homozygotes. Ces régions sont marquées avec la GFP du fait de la perte de la protéine répresseur, d'un bain-GAL80 qui se produit pendant la recombinaison mitotique. En utilisant marcm pour générer des cellules qui sont homozygotes à un locus génétique particulier, la fonction du gène peut être étudiée en utilisant les mouches adultes une variété de méthodes, y compris le test de comportement est décrit dans le présent document.
Le principal facteur limitant à la fois le nombre et les gènes spécifiques qui peuvent be testée est la présence d'un site FRT dans le génome de la mouche. Stocks de mouches doivent contenir un site FRT sur le bras chromosomique de la mutation d'intérêt. Marcm stocks de mouches prêt doit contenir un site FRT identique à celle du chromosome muté pour permettre la recombinaison mitotique. Dans notre laboratoire, nous avons développé des stocks de mouches contenant milieux de marcm avec des sites FRT40A et FRT42D. Ces stocks vont nous permettre de filtrer une p-élément létale adultes déjà associé à un site FRT correspondant sur les bras des chromosomes 2L et 2R, respectivement. Pour maximiser le potentiel de marcm dans les écrans pour les mutations qui affectent mécanotransduction ou le réflexe de toilettage, les stocks de mouches supplémentaires issus de l'marcm capables de tester des gènes sur les deux bras de la troisième chromosome et le chromosome X sera créé. Une fois mis au point, ces stocks vont permettre pour la plupart adultes mutations élément P létale combinés avec un site FRT à être testés pour leur implication dans mécanosensibilité.
Le calendrier de la sh de chaleurock protocole a été développé pour maximiser le nombre de régions de cellules homozygotes au niveau des organes sensoriels externes, tout en laissant une grande partie du reste de la volée de hétérozygote au locus d'intérêt. De nombreux domaines d'intérêt peuvent être marqués par l'expression de la GFP suite à un choc de chaleur à double, permettant de multiples poils à tester (Figure 2). Le protocole de marcm fournit une excellente occasion de créer des mutations homozygotes mortelles dans des régions spécifiques d'intérêt, mais notre protocole de marcm repose sur l'induction de choc thermique de l'activité recombinase, ce qui en fait un processus aléatoire quant aux soies sera finalement testable. Parce que chaque poil suscite un toilettage spécifique de la jambe reflex 6,7, il était important pour nous de confirmer que les réponses dans les clones de marcm de type sauvage sont comparables à ceux décrits précédemment. Maximiser l'efficacité d'un écran en fonction marcm nécessite la possibilité de tester l'un des poils macrochaete une réponse mutant et de les comparer datun rapport au taux de un poil correspondante dans un stock de marcm prêt réponse. Nous avons confirmé les résultats de Corfas et Dudai 7 à poils exprimant la GFP dans les vol d'marcm.
La capacité de distinguer facilement entre des réponses comportementales mouches normales et anormales est essentiel de déterminer quelles mutations interférer avec la mécanotransduction. Une mutation dans un gène impliqué dans la mécanotransduction ou l'autre aspect du réflexe de toilettage devrait inhiber la réponse de la jambe; un taux de réponse significativement plus faible à la brosse correspondante dans un stock de marcm-prêt est attendue. Les taux de réponse de comportement dans la mosaïque NOMPC et mouches de type sauvage servent comme une preuve du principe que l'écran comportementale basée à marcm peut être utilisé pour différencier les mutants mécano et les mouches normales. Nous avons montré que dans NOMPC mutants clones de mosaïque, le réflexe de toilettage en réponse à la stimulation poils est presque abolie. Seuls deux mouches des quatorze testés présentaientune réponse à la jambe. Chacun de ces mouches ont répondu qu'une seule fois au cours de l'essai, ce qui suggère qu'une analyse comportementale basée marcm est efficace à identifier un défaut de mécanosensibilité. Un observateur peut distinguer mutant mécanosensible vole et vole sans une mutation ou à une mutation qui ne soit pas impliqué dans la réponse de toilettage. En raison de la grande variabilité dans les réponses de type sauvage, l'écran permettra d'identifier les allèles forts, mais manquera probablement des changements plus subtils dans le comportement dus à allèles plus faibles. La collection de mutants à être projeté comprend alleles homozygotes létales seulement, il est donc probable que ce sont des alleles nuls ou solides et sont susceptibles de supprimer la fonction des protéines. Cependant, l'écran serait manquer allèles qui peuvent être mortelles dans le développement, mais de produire un défaut mécanosensorielle plus subtile lorsqu'il fait homozygote d'une manière plus limitée par marcm.
Nous avons choisi un système de notation tout ou rien pour la simplicité. Cette méthode donne une généreusemarquer par rapport au système utilisé par Corfas Dudai 7 et qui attribue une note de 0 à 4 en fonction de l'ampleur du mouvement de la jambe. Dans le système tout ou rien, aucune réponse complète est donnée à crédit avec l'hypothèse selon laquelle toute réponse à la stimulation indique que le système sensoriel détecte le stimulus et de signalisation pour le système de moteur.
Cet écran peut identifier des mutations qui affectent toute étape dans le circuit de comportement. D'autres tests, tels que l'électrophysiologie (comme dans Kernan et al 5) ou l'imagerie de calcium, devrait être utilisée pour déterminer si la mutation directement affectée mécanotransduction ou d'un autre aspect du développement ou de la fonction du réflexe arc sensori-motrice.
Drosophila melanogaster fournir un excellent modèle pour l'étude des mécanosensibilité. Les organes sensoriels externes partagent de nombreuses similitudes structurelles et fonctionnelles avec les cellules ciliées de l'oreille interne des mammifères20. L'élucidation des molécules impliquées dans ce processus chez la drosophile a le potentiel pour révéler homologues et orthologues de mammifères. Écrans visant à découvrir des mutations qui perturbent mécanosensibilité ouvrira la voie pour la cellule biologique ultérieure, électrophysiologique, et des études biochimiques pour identifier et caractériser ces molécules, approfondir notre compréhension de ce processus dans les deux mouches et les mammifères. Un écran en fonction marcm-de mutations affectant mécanosensibilité va utiliser une technique génétique bien établie jumelé avec un test de comportement de réponse de toilettage pour découvrir de nouveaux gènes impliqués dans la mécanotransduction et la mouche toilettage réflexe.
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Disclosures
Les auteurs ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Les auteurs souhaitent remercier le centre Bloomington boursier, Liqun Luo, Charles Zuker, et Lily et Yuh Nung Jan pour le partage généreux des stocks de mouches et de la suivante pour un financement: SOMAS-URM (JD et SW), baccalauréat Ford Faculté été Fellowship (SW), BD Corporation de bourses de recherche d'été (à CL et DL), Renée et Anthony M. Marlon, MD '63 bourses de recherche d'été (DL) James C. '75 et Jane Colihan bourses de recherche d'été (TO) par Alumni / Fonds de recherche Summer Parent du Collège de la Sainte Croix et la Fondation Stransky Summer Research Fellowship (TO). Un merci spécial au Département de biologie et le bureau du doyen au Collège de la Sainte Croix pour le soutien de tout le travail dans le laboratoire.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brewers Yeast (25 lb) | MP Biomedicals | ICN90331225 | Fly Food |
| Corn (25 lb) | MP Biomedicals | ICN90141125 | Fly Food |
| Agar (1 lb) | MoorAgar Inc. | 41004 | Fly Food |
| Tegosept (5 kg) | Genesee | 20-259 | Fly Food |
| Molasses (1 Gallon) | Sugarmill Brand - Thomsen Food Service | 0 2625 | Fly Food |
| Propionic Acid | Fisher | A258-500 | Fly Food |
| Phosphoric acid | Fisher | A260-500 | Fly Food |
| Drosophila Vials, Narrow (PS) | Genesee | 32-109 | Fly Cultures |
| 6oz Square Bottom Bottle (PP) | Genesee | 32-130 | Fly Cultures |
| Flugs - Plastic Fly Bottles | Genesee | 49-100 | Fly Cultures |
| Rayon Balls, Large | Genesee | 51-100 | Fly Cultures |
| Droso-Filler, Narrow | Genesee | 59-168 | Fly Food Preparation |
| Droso-Filler, Bottles | Genesee | 59-170 | Fly Food Preparation |
| 8A-C / gear driven lab stirrer with c-clamp mount 1/15 HP, 700 rpm variable speed, 115 V, 50/60 Hz | Cleveland Mixer | 8A-C | Fly Food Preparation |
| Water jacketed Kettle | Fly Food Preparation | ||
| Diurnal Growth Chamber | Forma Scientific | Temperature and light/dark cycle controlled | |
| Water bath | VWR | For heat shock | |
| MicroScissors | Fine Science Tools | 15000-08 | For removing heads |
| Fluroscence Dissecting Microscope | Zeiss | SteREO Discovery V8 | With GFP cube (KSC295-814D) band pass filter |
| Fluroscence Light Source | Zeiss | X-Cite 120 | Fiber optic light pipe makes this easy to configure |
| Camera for Scope | Zeiss | AxioCam ICc1 | |
| Image acquistion software | Zeiss | ||
| Ice bucket | for cold anthesia | ||
| Homemade cold anthesia tray | for cold anthesia decapitation | ||
| Plastic boxes | for recovery of decaptitated flies in humid environment |
References
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