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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

के Mechanosensation के लिए एक व्यवहार परख क्लोन में MARCM आधारित Published: December 30, 2015 doi: 10.3791/53537
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1
1Department of Biology, College of the Holy Cross, 2School of Medicine, Georgetown University, 3Department of Biochemistry, Giesel School of Medicine, Dartmouth College, 4School of Medicine, Tufts University, 5Transgenomic Inc., 6Department of Molecular, Cell and Cancer Biology, UMass Medical School

Abstract

क्योंकि स्तनधारी भीतरी कान के बालों की कोशिकाओं के लिए संरचनात्मक और कार्यात्मक अनुरूपता का, ड्रोसोफिला बाहरी इंद्रियों अंदर आना न्यूरॉन्स कि mechanosensation के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली प्रदान करते हैं। इस प्रोटोकॉल mechanosensation के साथ हस्तक्षेप कि म्यूटेशन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो फल मक्खियों में एक साधारण स्पर्श के व्यवहार का वर्णन है। मक्खियों की छाती या तो पहले या तीसरे पैर से एक संवारने पलटा elicits पर एक macrochaete का स्पर्श उत्तेजना बाल खड़े। Mechanotransduction (जैसे NOMPC के रूप में) के साथ हस्तक्षेप कि म्यूटेशन, या पलटा चाप के अन्य पहलुओं के साथ, संवारने की प्रतिक्रिया को बाधित कर सकते हैं। वयस्क व्यवहार का एक पारंपरिक स्क्रीन विकास के दौरान आवश्यक भूमिका है कि म्यूटेंट याद किया जाएगा। इसके बजाय, इस प्रोटोकॉल expr द्वारा उत्पन्न और चिह्नित किया जाना समयुग्मक उत्परिवर्ती कोशिकाओं के केवल सीमित क्षेत्रों के लिए अनुमति देने के लिए एक repressible सेल मार्कर (MARCM) के साथ पच्चीकारी विश्लेषण के साथ टच स्क्रीन को जोड़ती हैहरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) की ession। असामान्य व्यवहार प्रतिक्रियाओं के लिए MARCM क्लोन का परीक्षण करके, इसे और अधिक परंपरागत तरीके से याद किया गया है कि mechanosensation में शामिल नए जीनों के लिए खोज करने के लिए घातक पी-तत्व म्यूटेशन का एक संग्रह स्क्रीन करने के लिए संभव है।

Protocol

1. पार MARCM मक्खियों उत्पन्न करने के लिए

  1. 22 डिग्री सेल्सियस या मानक ड्रोसोफिला मीडिया cornmeal गुड़ मीडिया (0.13% Tegosept; 23.5 ग्राम / एल खमीर, 60 ग्राम / एल cornmeal, 60 मिलीग्राम / एल गुड़; 4 मिलीग्राम / एल एसिड मिश्रण 6.5 ग्राम / एल अग्रवाल) पर मक्खियों बनाए रखें एक 12 घंटा / प्रकाश अंधेरे चक्र में।
    नोट: मानक तापमान की तुलना में कम स्वस्थ MARCM-शेयरों को रखने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह 14 दिनों के लिए अंडे और वयस्कता के बीच विकास के समय फैली हुई है।
  2. एक नदी के ऊपर सक्रिय अनुक्रम (यूएएस GFP), Gal80 repressor प्रोटीन, Gal4 प्रतिलेखन कारक, एक के नियंत्रण में (GFP आवश्यक आनुवंशिक तत्वों से युक्त एक MARCM-तैयार माल से - (8 दिन पुरानी लगभग 1) कुंवारी महिलाओं का प्रयोग करें गर्मी सदमे संचालित Recombinase, और एक FRT पुनर्संयोजन साइट)।
    नोट: हमारी MARCM तैयार शेयरों निम्नलिखित जीनोटाइप होते हैं: elavGal4, यूएएस सीडी 8 GFP, एच एस flipase; FRT40A, tubGal80 / cyo; tubGal4 / TM3Sb।
    नोट: विशिष्ट FRT साइट उत्परिवर्तन के स्थान पर निर्भर करेगाजीनोम में। उदाहरण के लिए, FRT40A ऐसे NOMPC (MARCM प्रोटोकॉल के बारे में अधिक जानकारी के लिए 10 देखें) के रूप में गुणसूत्र 2 के बाएं हाथ पर म्यूटेशन परीक्षण करने के लिए प्रयोग किया जाता है।
  3. एक ब्याज के उत्परिवर्तन और अपनी इसी FRT साइट के होते हैं कि पुरुषों के लिए क्रॉस MARCM तैयार कुंवारी महिलाओं (; NOMPC3, FRT40A / cyo, उदाहरण के लिए, डब्ल्यू / + +)। प्रभावी MARCM शामिल करने के लिए नियंत्रित करने के लिए, एक ही FRT साइट युक्त पुरुष मक्खियों का उपयोग कर एक दूसरे पार निर्धारित है, लेकिन एक उत्परिवर्तन के बिना। पार में एक पुरुष: 5 महिलाओं की एक अनुमानित अनुपात का प्रयोग करें।

बिछाने 2. समय पर अंडा

  1. मक्खियों कम से कम एक रात के लिए दोस्त के लिए अनुमति के बाद, ताजा मीडिया के साथ नया शीशियों में वयस्कों के लिए कदम। मक्खियों फिर से नया शीशियों में पार स्थानांतरित करने से पहले लगभग 4 घंटे के लिए एक अंधेरे वातावरण में अंडे देना करने की अनुमति दें। अंडे बिछाने अवधि के शुरू और अंत समय ध्यान दें।
    नोट: 4 घंटे की interva के अंत से पहले मीडिया पर अंडे की एक उच्च संख्या प्रतीत होता है जब कम अंतराल स्वीकार्य हैंएल।
    1. गर्मी बाद में हैरान होने की सेल्सियस 22 डिग्री पर एक 12 घंटा / प्रकाश अंधेरे चक्र में एक पर्याप्त अंडे की संख्या (लगभग 20 से अधिक) और दुकान के साथ शीशियों रखें।
      नोट: वयस्क यह है कि वे आगे की जांच के लिए बनाए रखा नहीं किया जा सिफारिश की है व्यवहार परीक्षण के लिए और दक्षता के हित में मक्खियों की मीडिया पर अंडे की कम संख्या के साथ शीशियों (कम से कम 20 लगभग तुलना में) पर्याप्त संख्या उपज की संभावना नहीं है।
      नोट: हमारी मक्खियों 08:00-8:00 पर रोशनी के साथ उठाए गए हैं। 8:00 और 8:00-आधी रात - हम अंक अधिक अंडे घनत्व के लिए नेतृत्व शाम के समय, इसलिए आमतौर पर 4 के बीच समय पर पार प्रदर्शन पाया है। इनक्यूबेटर में नियमित रूप से प्रकाश अंधेरे चक्र को परेशान करने के रूप में नहीं तो मक्खियों अगले दिन इनक्यूबेटर को लौट रहे हैं तो एक अंधेरे कैबिनेट में आरटी पर अपने अंडे देते हैं और।

3. mitotic पुनर्संयोजन प्रेरित करने के लिए हीट शॉक प्रदर्शन करना

  1. लगभग 85 - अंडे बिछाने के बाद 100 मानव संसाधन, जगह वी1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में ials। जल स्तर शीशियों में मीडिया की ऊंचाई से ऊपर पहुंचता है, लेकिन पूरी तरह डूबने से लार्वा को रोकने के लिए शीशियों डूब नहीं है कि सुनिश्चित करें।
  2. नहाने के पानी से शीशियों निकालें और आरटी पर एक 1 घंटा वसूली की अवधि के लिए अनुमति देते हैं।
  3. वापस 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 1 घंटे के लिए जगह शीशियों।
  4. Eclosion तक 22 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटा / प्रकाश अंधेरे चक्र पर इनक्यूबेटर में नहाने के पानी और दुकान से शीशियों निकालें।

व्यवहार परीक्षण के लिए 4. तैयारी

  1. Eclosion के बाद, बर्फ पर मक्खियों anesthetize। MARCM के लिए सभी आनुवंशिक तत्व होते हैं और GFP अभिव्यक्ति से चिह्नित क्लोन होने की संभावना माता पिता के शेयरों में इस्तेमाल किया नमूदार फेनोटाइप मार्करों के आधार पर मनाया जाएगा संकेत मिलता है कि जीनोटाइप के साथ मक्खियों का चयन करें। Iridectomy कैंची से मक्खियों सिर काटना।
    नोट: उदाहरण के लिए, हम आनुवंशिक मार्करों के बिना मक्खियों के लिए cyo (घुंघराले पंख) और एस.बी. (खूंटी बाल खड़े) पहचान के लिए चयनितपच्चीकारी क्षेत्रों बनाने के लिए आवश्यक सभी आनुवंशिक तत्व होते हैं कि वित्तीय वर्ष मक्खियों GFP के साथ चिह्नित।
    नोट: कत्ल जब उत्तेजित दूर उड़ान से वयस्कों को रोकने के लिए आवश्यक है।
  2. एक बंद, नम वातावरण में बिना सिर मक्खियों की जगह है और लगभग 10 अनुमति - वसूली के 20 घंटा। केवल उपयोग का अधिकार खुद को आगे की जांच के लिए परेशान है कि जब मक्खियों। टेस्ट कत्ल के 30 घंटे के भीतर मक्खियों।

5. व्यवहार परीक्षण

  1. एक प्रतिदीप्ति विदारक माइक्रोस्कोप के तहत decapitated मक्खियों देख कर, बाल खड़े बाहरी संवेदी अंगों में GFP के साथ चिह्नित समयुग्मक क्लोन की पहचान। बाल खड़े नाम और बाईं या दाईं ओर रिकॉर्ड। किसी भी संभावित पूर्वाग्रह खत्म करने, बाल खड़े उत्तेजना प्रदर्शन कर प्रयोगशाला सदस्य बाल खड़े, जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती के जीनोटाइप के लिए अंधा होना चाहिए।
  2. एक कड़ा बाल या ठीक संदंश के साथ उड़ शरीर के प्रति बाल खड़े GFP deflecting द्वारा एक संवारने पलटा चिह्नित प्रकाश में लाना और पैर फिर से निरीक्षणप्रायोजक। उत्तेजना और उनके पैरों को स्थानांतरित नहीं है कि मक्खियों को शून्य के स्कोर बाल खड़े के जवाब में अपने पैर उठा कि मक्खियों को एक के स्कोर दे।
    नोट: पिछले अध्ययनों से 6.7 एक विशेष बाल खड़े उत्तेजक द्वारा हासिल किया गया है कि पैर प्रतिक्रिया की विशेषता है। यह प्रत्येक बाल खड़े करने के लिए जवाब है कि पैर और उस विशेष बाल खड़े उत्तेजना का जवाब है कि मक्खियों के अनुपात में भी शामिल है। हम केवल हम Vandervorst के वर्गीकरण 6 के आधार पर प्रतिक्रिया करने के लिए उम्मीद है कि पैर के आंदोलनों के लिए रन बनाए।
  3. अलग 2 मिनट के अंतराल पर पांच परीक्षणों का संचालन।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल की सफलता काफी हद तक परीक्षण योग्य मक्खियों की कुल उपज पर निर्भर करता है, गर्मी के झटके के प्रभाव का mitotic पुनर्संयोजन, और 2 मिनट के अंतराल पर उत्तेजित मक्खियों में एक मजबूत व्यवहार प्रतिक्रिया प्राप्त करने की क्षमता के लिए प्रेरित करने के लिए। भ्रूण के एक अनुमान के अनुसार 12.5% ​​आवश्यक MARCM तत्वों और GFP अभिव्यक्ति के लिए क्षमता है eclose कि वयस्कों की अनुमानित 16.67% होते हैं कि यह देखते हुए, यह समय पर तैयार करती दौरान अंडे की एक उच्च संख्या प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक सफल समय का एक उदाहरण चित्रा 1 ए में दिखाया गया है प्रोटोकॉल के बाकी हिस्सों में इस्तेमाल किया जाएगा कि एक 4 घंटा अंतराल पर लेट गई।

गर्मी के झटके 85 से किया जाता है - अंडे बिछाने के बाद 100 मानव संसाधन, बाह्य इंद्रियों लेबल GFP की उपज सबसे मक्खियों लेबल macrochaetae में से एक होने के साथ सबसे अधिक है। ब्याज के कई क्षेत्रों testabl के ठिकानों पर समयुग्मक कोशिकाओं हो सकती हैगर्मी के झटके पृष्ठीय केंद्रीय और बाद alar बाल खड़े होने के नाते पाया लेबल सबसे अधिक बार (2A चित्रा) के साथ, इस समय अवधि के भीतर प्रदर्शन कर रहे हैं जब ई जगमग है। ब्याज या कोई GFP अभिव्यक्ति (चित्रा 2 बी) के शरीर क्षेत्रों के बाहर GFP अभिव्यक्ति के धब्बे में इस विंडो परिणाम के बाहर समय अंक।

स्वाभाविक रूप से एक भागने प्रतिक्रिया 19 की शुरुआत से एक उभरते उत्तेजना का जवाब मक्खियों। भागने से मक्खियों को रोकने के क्रम में, हम मक्खियों decapitated। संवारने प्रतिक्रिया सर्किट उदर तंत्रिका कॉर्ड 5 में बरकरार है। मक्खियों कार्बन डाइऑक्साइड संज्ञाहरण के तहत decapitated यदि अच्छी तरह से ठीक है, लेकिन बर्फ पर ठंड संज्ञाहरण के साथ decapitated जब कुछ ही घंटों में ठीक नहीं है। कत्ल के बाद, मक्खियों सुखाना को रोकने के लिए वसूली की अवधि के दौरान एक संलग्न, नम वातावरण में संग्रहित किया जाना चाहिए। कुछ मक्खियों सूखना या (चित्रा 1 बी) खड़ा करने में असमर्थ हो सकता है,केवल (चित्रा 1 सी) खड़ा करने में सक्षम उन परीक्षण के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। परीक्षण से पहले, मक्खियों notum के लिए एक स्पर्श के बाद आंदोलन के लिए देख द्वारा सामान्य प्रतिक्रिया के लिए जाँच कर रहे हैं। कई मक्खियों के कई दिनों के लिए उत्तरदायी रहते हैं, लेकिन परीक्षण 24 तक पूरा किया जाना चाहिए - कत्ल के बाद 36 घंटा। एक पर्यवेक्षक के एक सच्चे प्रोत्साहन पर निर्भर संवारने की प्रतिक्रिया और मक्खी के सामान्य आंदोलनों के बीच अंतर करना कठिन हो सकता है क्योंकि सक्रियता व्यवहार परीक्षण के दौरान एक समस्या हो सकती है उड़ना। स्पर्श उत्तेजना से हासिल नहीं अतिरिक्त आंदोलन के साथ पशुओं में, और अधिक विश्वसनीय परिणाम मौन बनने के लिए अतिसक्रिय मक्खियों के लिए इंतज़ार कर रही द्वारा प्राप्त कर रहे हैं।

हम एक बाल खड़े पर आदी होना रोकने के लिए 2 मिनट के अंतराल पर स्थान दिया गया है पांच बार, जब छुआ प्रकार के जंगली मक्खियों के 47% से कम से कम एक बार जवाब है कि पाया। कई समूहों के विभिन्न जगमग की उत्तेजना एक विशिष्ट पैर 6.7 से एक नमूनों प्रतिक्रिया elicits पता चला है कि 6। हमारे प्रयोगों में, जंगली प्रकार नियंत्रण मक्खियों परीक्षणों के 86% (नोटो-फुफ्फुस) के लिए 14% (केंद्रीय पृष्ठीय) से एक हल्के स्पर्श करने के लिए (चित्रा 3) जवाब दिया। अज्ञात म्यूटेंट के साथ एक MARCM आधारित स्क्रीन में, mechanosensation में शामिल नहीं एक उत्परिवर्तन युक्त उन मक्खियों जंगली प्रकार नियंत्रण पशुओं में मनाया कि इसी तरह के एक विश्वसनीय व्यवहार प्रतिक्रिया प्रदर्शन करने की उम्मीद की जा सकती है।

उम्मीद के रूप में जाना जाता है mechanosensitive उत्परिवर्ती, NOMPC संवारने प्रतिक्रिया खलल डाल दिया। नियंत्रण मक्खियों समयुग्मक को क्लोन के बाद alar पर stimulations के समय के 37% (चित्रा 4) जगमग बाल खड़े करने के लिए प्रतिक्रिया व्यक्त की। इसके विपरीत, NOMPC के लिए समयुग्मक थे कि जगमग साथ जानवरों (चित्रा 4) समय के 2% से जवाब दिया। जंगली प्रकार मक्खियों फिर से वहींspond अलग अलग जगमग की उत्तेजना के लिए, इन परिणामों ऐसे NOMPC के रूप में एक mechanosensitive उत्परिवर्तन, लगभग संवारने की प्रतिक्रिया को समाप्त कि सुझाव देते हैं। अज्ञात म्यूटेंट के साथ एक स्क्रीन में, संवारने की प्रतिक्रिया को बाधित कि mechanosensation में शामिल कई परिवर्तन की उम्मीद कर रहे हैं।

आकृति 1
चित्रा 1. उचित पालन शर्तों इष्टतम व्यवहार परीक्षण के लिए आवश्यक हैं। 4 घंटा अंडा बिछाने अवधि - (ए) के भ्रूण की एक पर्याप्त संख्या 2 निम्नलिखित की जरूरत है। एक 4 घंटा समय पर जब्री के बाद भ्रूण की संख्या वयस्क के लिए पर्याप्त संख्या में व्यवहार परीक्षण के लिए मक्खियों मिलने की संभावना है। (बी) के कत्ल के बाद वसूली की अवधि के दौरान, कुछ मक्खियों जीवित नहीं है और आगे के परीक्षण में इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। (सी) ठीक से वसूली की अवधि के दौरान एक नम वातावरण में जमा हो गया था कि एक decapitated मक्खी है एक व्यवहार परख में परीक्षण योग्य। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. bristles में MARCM क्लोन गर्मी चौंक 85 के बीच जब - 100 घंटे के बाद अंडे बिछाने। अंडे बिछाने के बाद 101 घंटा - गर्मी 98 हैरान जब वयस्क में (ए) GFP अभिव्यक्ति मक्खियों। के रूप में कई के रूप में 10 macrochaete जगमग समयुग्मक उत्परिवर्ती बाहरी इंद्रियों होते हैं और संवारने प्रतिक्रिया व्यवहार परख में परीक्षण के लिए उपयुक्त हैं गर्मी 161 हैरान जब वयस्क में (बी) GFP अभिव्यक्ति मक्खियों -। अंडे बिछाने के बाद 164 घंटा। एक परीक्षण योग्य बाहरी संवेदी अंग पर समयुग्मक कोशिकाओं का कोई पैच का संकेत है, macrochaete जगमग के ठिकानों पर GFP अभिव्यक्ति की कमी पर ध्यान दें।arge.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
स्पर्श उत्तेजना के लिए प्रतिक्रिया की आवृत्ति 3. चित्रा बाल खड़े पहचान पर निर्भर है। एक भी बाल खड़े उत्तेजना के लिए एक व्यक्ति की मक्खी की प्रतिक्रियाओं की कुल संख्या एक प्रतिशत की प्रतिक्रिया देने के लिए उत्तेजनाओं की संख्या से विभाजित किया गया था। प्रत्येक (परीक्षण मक्खियों के एन = # 22 पोस्ट Alar, 21 पृष्ठीय मध्य 14, Scutellar, 7 Notopleural) बाल खड़े लिए प्रतिशत औसतन थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. NOMPC म्यूटेंट पी के स्पर्श उत्तेजना। उत्तेजना का जवाब नहीं हैOst-alar जगमग जंगली प्रकार MARCM क्लोन में एक प्रतिक्रिया elicits। हालांकि, NOMPC 3 थे कि पोस्ट alar जगमग पर MARCM क्लोन की उत्तेजना - / - (हरी पट्टी) कुछ प्रतिक्रियाओं में हुई (एन = 23 प्रकार के जंगली, और 12 NOMPC - / -)। एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा की।

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Discussion

म्यूटेंट के संग्रह वयस्कों के रूप में स्क्रीनिंग बंद करना होगा कि घातक पी-तत्व म्यूटेशन होता है क्योंकि इस प्रोटोकॉल इस प्रोटोकॉल पहले ली और लुओ द्वारा वर्णित एक जटिल आनुवंशिक तकनीक का इस्तेमाल करता है। ड्रोसोफिला में mechanosensation को प्रभावित करने वाले परिवर्तन के लिए स्क्रीन के लिए एक वयस्क व्यवहार परख का इस्तेमाल (1999) और वयस्क मारक नाकाम करने के लिए वू और लुओ द्वारा एक प्रोटोकॉल, (2006) के रूप में विस्तृत। MARCM समयुग्मक कोशिकाओं के प्रतिरूप क्षेत्रों उत्पन्न करने के मुताबिक़ गुणसूत्रों के बीच mitotic पुनर्संयोजन लाती है। इन क्षेत्रों क्योंकि mitotic पुनर्संयोजन के दौरान होता है कि repressor प्रोटीन, टब-GAL80 के नुकसान की GFP के साथ चिह्नित कर रहे हैं। एक विशेष आनुवंशिक ठिकाना पर समयुग्मक हैं जो कोशिकाओं को उत्पन्न करने MARCM का उपयोग करके, जीन समारोह इस पत्र में वर्णित व्यवहार परख सहित तरीकों की एक किस्म का उपयोग मक्खियों वयस्क में अध्ययन किया जा सकता है।

संख्या और कर सकते हैं ख है कि विशिष्ट जीन दोनों सीमित प्राथमिक कारकपरीक्षण किया ई मक्खी के जीनोम के भीतर एक FRT साइट की उपस्थिति है। उड़ शेयरों ब्याज के उत्परिवर्तन के गुणसूत्र हाथ पर एक FRT साइट शामिल होना चाहिए। MARCM तैयार उड़ शेयरों mitotic पुनर्संयोजन के लिए अनुमति देने के लिए उत्परिवर्ती गुणसूत्र के रूप में एक समान FRT साइट शामिल होना चाहिए। हमारी प्रयोगशाला में, हम FRT40A और FRT42D साइटों के साथ MARCM पृष्ठभूमि युक्त उड़ शेयरों विकसित की है। इन शेयरों हमें क्रमश: पहले से ही 2L और 2R गुणसूत्र बाहों पर एक इसी FRT साइट के साथ संयुक्त किसी भी वयस्क घातक पी-तत्व स्क्रीन करने के लिए अनुमति देगा। दोनों तीसरे गुणसूत्र के हथियारों और एक्स गुणसूत्र बनाया जाएगा पर जीनों का परीक्षण करने में सक्षम MARCM पृष्ठभूमि के साथ mechanotransduction या संवारने पलटा, अतिरिक्त उड़ शेयरों को प्रभावित करने वाले परिवर्तन के लिए स्क्रीन में MARCM की क्षमता को अधिकतम करने के लिए। विकसित एक बार एक FRT साइट के साथ संयुक्त ज्यादातर वयस्क घातक पी-तत्व म्यूटेशन mechanosensation में भागीदारी के लिए परीक्षण किया जा करने के लिए इन शेयरों की अनुमति देगा।

गर्मी श के समयब्याज का ठिकाना पर मक्खी विषमयुग्मजी के बाकी के बहुत जाते वक्त Ock प्रोटोकॉल, बाहरी संवेदी अंगों पर समयुग्मक सेल क्षेत्रों की संख्या को अधिकतम करने के लिए विकसित किया गया है। ब्याज के कई क्षेत्रों कई जगमग (चित्रा 2) परीक्षण किया जा करने के लिए अनुमति देता है, एक डबल गर्मी झटका निम्नलिखित GFP अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित किया जा सकता। MARCM प्रोटोकॉल हित के विशिष्ट क्षेत्रों में समयुग्मक घातक म्यूटेशन बनाने के लिए एक उत्कृष्ट अवसर प्रदान करता है, लेकिन हमारे MARCM प्रोटोकॉल अंततः परीक्षण के योग्य बनाया जाएगा जगमग करने के लिए जो के रूप में यह एक यादृच्छिक प्रक्रिया है, जिससे Recombinase गतिविधि की गर्मी झटका प्रेरण पर निर्भर करता है। प्रत्येक एक विशिष्ट पैर संवारने 6.7 पलटा elicits बाल खड़े क्योंकि हमें जंगली प्रकार MARCM क्लोन में प्रतिक्रियाओं पहले से वर्णित उन लोगों के लिए तुलना कर रहे हैं कि इस बात की पुष्टि करने के लिए, यह महत्वपूर्ण था। एक MARCM आधारित स्क्रीन की दक्षता अधिकतम एक उत्परिवर्ती प्रतिक्रिया के लिए macrochaete जगमग के किसी भी परीक्षण करने के लिए और इन Dat तुलना करने की क्षमता की आवश्यकता हैएक MARCM तैयार स्टॉक में एक इसी बाल खड़े से प्रतिक्रिया की दर के खिलाफ एक। हम MARCM मक्खियों में GFP व्यक्त जगमग में Corfas और Dudai 7 के परिणामों की पुष्टि की है।

आसानी से सामान्य और असामान्य मक्खी व्यवहार प्रतिक्रियाओं के बीच भेद करने की क्षमता mechanotransduction के साथ हस्तक्षेप जो म्यूटेशन निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है। Mechanotransduction या पैर प्रतिक्रिया रोकना चाहिए संवारने पलटा के दूसरे पहलू में शामिल एक जीन में उत्परिवर्तन; एक MARCM तैयार स्टॉक में इसी बाल खड़े पर एक काफी कम दर की प्रतिक्रिया की उम्मीद है। पच्चीकारी NOMPC और जंगली प्रकार मक्खियों में व्यवहार प्रतिक्रिया दरों MARCM आधारित व्यवहार स्क्रीन mechanosensory म्यूटेंट और सामान्य मक्खियों के बीच अंतर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि सिद्धांत का एक सबूत के रूप में सेवा करते हैं। हम NOMPC उत्परिवर्ती पच्चीकारी क्लोन में, उत्तेजना बाल खड़े के जवाब में संवारने पलटा लगभग समाप्त कर दिया है कि पता चला है। चौदह में से केवल दो मक्खियों का प्रदर्शन किया परीक्षणएक पैर की प्रतिक्रिया। इन मक्खियों से प्रत्येक एक MARCM आधारित व्यवहार परख एक mechanosensation दोष की पहचान करने में प्रभावी है, सुझाव है कि परीक्षण के पाठ्यक्रम पर केवल एक बार प्रतिक्रिया व्यक्त की। Mechanosensitive उत्परिवर्ती के बीच भेद कर सकते हैं एक पर्यवेक्षक मक्खियों और एक उत्परिवर्तन के बिना या संवारने की प्रतिक्रिया में शामिल नहीं किया गया है कि एक परिवर्तन के साथ उड़ जाता है। क्योंकि जंगली प्रकार की प्रतिक्रियाएं में परिवर्तनशीलता के उच्च स्तर की है, स्क्रीन मजबूत एलिलों की पहचान करेगा, लेकिन संभावना की वजह से कमजोर alleles के लिए व्यवहार में अधिक सूक्ष्म परिवर्तन याद आएगी। जांच की जानी म्यूटेंट का संग्रह केवल समयुग्मक घातक एलिलों शामिल हैं, तो यह इन मजबूत या अशक्त एलिलों हैं और प्रोटीन समारोह समाप्त होने की संभावना है कि संभावना है। हालांकि, स्क्रीन के विकास में घातक हो सकता है कि एलिलों याद आती है, लेकिन MARCM द्वारा एक और अधिक सीमित ढंग से समयुग्मक बने जब एक और अधिक सूक्ष्म mechanosensory दोष का उत्पादन होगा।

हम सादगी के लिए एक सभी या कोई भी स्कोरिंग प्रणाली चुना है। इस पद्धति का एक उदार पैदावारपैर आंदोलन की सीमा पर निर्भर 0-4 के स्कोर प्रदान करती है कि Corfas और Dudai 7 द्वारा इस्तेमाल किया प्रणाली की तुलना में स्कोर। सभी या कोई भी प्रणाली में, किसी भी प्रतिक्रिया उत्तेजना के लिए किसी भी प्रतिक्रिया संवेदी प्रणाली प्रोत्साहन का पता लगाने और मोटर व्यवस्था करने के लिए संकेत दे रहा है कि इंगित करता है कि इस धारणा के साथ पूरा श्रेय दिया जाता है।

इस स्क्रीन व्यवहार सर्किट में किसी भी कदम को प्रभावित करने वाले म्यूटेशन की पहचान हो सकती है। या कैल्शियम इमेजिंग (Kernan एट अल 5) के रूप में इस तरह के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के रूप में आगे के परीक्षण, उत्परिवर्तन सीधे mechanotransduction या संवेदी मोटर पलटा चाप के विकास या समारोह के कुछ अन्य पहलू प्रभावित निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए होगा।

ड्रोसोफिला mechanosensation के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली प्रदान मेलानोगास्टर। बाहरी संवेदी अंगों स्तनधारी भीतरी कान के बालों की कोशिकाओं के साथ कई संरचनात्मक और कार्यात्मक समानता का हिस्सा20। ड्रोसोफिला में इस प्रक्रिया में शामिल अणुओं की व्याख्या स्तनधारी homologs और orthologs को प्रकट करने की क्षमता है। बाद में सेल जैविक, electrophysiological के लिए मार्ग प्रशस्त होगा mechanosensation बाधित कि म्यूटेशन की खोज के उद्देश्य से स्क्रीन, और जैव रासायनिक अध्ययन के आगे की पहचान करने और मक्खियों और स्तनधारियों दोनों में इस प्रक्रिया के बारे में हमारी समझ को मजबूत बनाने, इन अणुओं को चिह्नित करने के लिए। Mechanotransduction और मक्खी संवारने पलटा में शामिल नए जीन प्रकट करने के लिए एक संवारने प्रतिक्रिया व्यवहार परख के साथ रखा एक अच्छी तरह से स्थापित आनुवंशिक तकनीक का प्रयोग करेंगे mechanosensation को प्रभावित करने परिवर्तन के लिए एक MARCM आधारित स्क्रीन।

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Disclosures

लेखकों कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है।

Acknowledgments

चाहते हैं लेखकों ब्लूमिंगटन स्टॉक केंद्र, Liqun लुओ, चार्ल्स Zuker, और लिली और Yuh Nung जनवरी उड़ शेयरों की उदार साझा करने के लिए और धन के लिए निम्नलिखित धन्यवाद:, बैचलर फोर्ड संकाय ग्रीष्मकालीन फैलोशिप (जद और दप करने के लिए) SOMAS-URM (दप करने के लिए), रेनी और एंथोनी एम मार्लोन, एमडी (डीएल) के लिए '63 ग्रीष्मकालीन रिसर्च फैलोशिप (सीएल और डीएल के लिए) बी.डी. निगम ग्रीष्मकालीन रिसर्च फैलोशिप जेम्स सी '75 और जेन Colihan ग्रीष्मकालीन रिसर्च फैलोशिप (TO) के माध्यम से पूर्व छात्र / होली क्रॉस कॉलेज के जनक ग्रीष्मकालीन रिसर्च फंड और Stransky फाउंडेशन ग्रीष्मकालीन रिसर्च फैलोशिप (TO के लिए)। प्रयोगशाला में सभी काम के समर्थन के लिए होली क्रॉस के कॉलेज में जीव विज्ञान विभाग और डीन के कार्यालय के लिए विशेष धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brewers Yeast (25 lb) MP Biomedicals  ICN90331225  Fly Food
Corn (25 lb) MP Biomedicals  ICN90141125  Fly Food
Agar (1 lb) MoorAgar Inc. 41004 Fly Food
Tegosept (5 kg) Genesee 20-259 Fly Food
Molasses (1 Gallon) Sugarmill Brand - Thomsen Food Service 0 2625 Fly Food
Propionic Acid Fisher A258-500 Fly Food
Phosphoric acid Fisher A260-500 Fly Food
Drosophila Vials, Narrow (PS) Genesee 32-109 Fly Cultures
6oz Square Bottom Bottle (PP) Genesee 32-130 Fly Cultures
Flugs - Plastic Fly Bottles Genesee 49-100 Fly Cultures
Rayon Balls, Large Genesee 51-100 Fly Cultures
Droso-Filler, Narrow Genesee 59-168 Fly Food Preparation
Droso-Filler, Bottles Genesee 59-170 Fly Food Preparation
8A-C / gear driven lab stirrer with c-clamp mount  1/15 HP, 700 rpm variable speed, 115 V, 50/60 Hz Cleveland Mixer 8A-C Fly Food Preparation
Water jacketed Kettle Fly Food Preparation
Diurnal Growth Chamber Forma Scientific Temperature and light/dark cycle controlled
Water bath VWR For heat shock
MicroScissors  Fine Science Tools  15000-08 For removing heads
Fluroscence Dissecting Microscope Zeiss SteREO Discovery V8  With GFP cube (KSC295-814D) band pass filter
Fluroscence Light Source Zeiss X-Cite 120 Fiber optic light pipe makes this easy to configure 
Camera for Scope Zeiss AxioCam ICc1
Image acquistion software Zeiss
Ice bucket for cold anthesia
Homemade cold anthesia tray for cold anthesia decapitation
Plastic boxes for recovery of decaptitated flies in humid environment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grünert, U., Gnatzy, W. K+ and Ca++ in the receptor lymph of arthropod cuticular mechanoreceptors. J Comp Physiol A. 161, 329-333 (1987).
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तंत्रिका विज्ञान अंक 106 MARCM पच्चीकारी विश्लेषण, Mechanosensation व्यवहार परख व्यवहार दोष उत्परिवर्ती बाल खड़े
के Mechanosensation के लिए एक व्यवहार परख क्लोन में MARCM आधारित<em&gt; ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em
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Murphy, T. P., Luu, D. D., DeSimone, … More

Murphy, T. P., Luu, D. D., DeSimone, J. A., O'Brien, T. C., Lally, C. J., Lindblad, J. J., Webster, S. M. A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (106), e53537, doi:10.3791/53537 (2015).

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