Primary cilia influence various signaling pathways. The mammalian cochlea is ideal for examining planar cell polarity (PCP) signaling. Cilia dysfunction affects cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, readouts of PCP. Our goal is to analyze PCP signaling in mouse cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy.
In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest signaling pathways shown to be associated with ciliary function was the non-canonical Wnt signaling pathway, also referred to as planar cell polarity (PCP) signaling. One of the best places in which to study the effects of planar cell polarity (PCP) signaling during vertebrate development is the mammalian cochlea. PCP signaling disruption in the mouse cochlea disrupts cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, all of which are affected by cilia dysfunction. The goal of this protocol is to describe the analysis of PCP signaling in the developing mammalian cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy. Defects in convergence and extension are manifested as a shortening of the cochlear duct and/or changes in cellular patterning, which can be quantified following dissection from developing mouse mutants. Changes in stereociliary bundle orientation and kinocilia length or positioning can be observed and quantitated using either immunofluorescence or scanning electron microscopy (SEM). A deeper insight into the role of ciliary proteins in cellular signaling pathways and other biological phenomena is crucial for our understanding of cellular and developmental biology, as well as for the development of targeted treatment strategies.
Первичные реснички длинные микротрубочки основе придатки, которые простираются от поверхности большинства клеток млекопитающих. Первичная реснички часто путают с подвижных ресничек, из которых всегда много на одну ячейку, и цель которого заключается в переходе жидкость через поверхности мембран. Первичная реснички, напротив, принять сенсорные роли и, следовательно, также называют сенсорной ресничек. После давно забыли, это органеллы недавно был 'вновь' в результате его ассоциации с множеством генетических заболеваний человека 1. В идеале позиционируется как сигнальной органеллы, первичная ресничка было показано, чтобы регулировать многочисленные сигнальные пути, многие из которых имеют важное значение не только в тканевого гомеостаза и болезни, но также и во время развития 2.
Одним из первых сигнальных путей показано, что связано с ресничек дисфункции был неканонической сигнализации Wnt путь, известный также как полярность плоская клеток (PCP) пути <sup > 3. Это сигнальный каскад первоначально определены у дрозофилы, имеет решающее значение для эмбриогенеза; в частности, для конвергенции и расширения процессов и для правильной ориентации клеток в плоскости эпителия 4. Последовательное сигнализация основного набора регуляторных белков переводит направленные сигналы, которые, в конечном счете привести к цитоскелета перестроек и приводят к согласованной поляризации эпителиальных клеток в плоскости 5. Процесс сближения и расширения абсолютно необходим для канала улитки, чтобы удлинить и для правильного клеточного паттерна 6. Как это регулируется с помощью активации PCP пути, один из самых ярких фенотипов улитки PCP мутантов является сокращенной канал улитки с неорганизованной сенсорного эпителия 7. Аналогичным образом, мутантные мыши, у которых нет реснички, также демонстрируют такую конвергенции и расширения фенотип 8,9, хотя как именно это регулируется еще предстоит выяснить.
ve_content "> Поскольку конвергентные и расширение процессов являются критическими для выроста канала улитки и сотовой паттерна сенсорного эпителия внутри канала улитки, развивающийся улитка является идеальным органом, в котором для изучения сигналов PCP во время развития позвоночных. Орган Корти, термин, данный специализированного сенсорного эпителия, что линии канал улитки, состоит из несенсорных опорных клеток и механосенсорных волосковых клеток, которые должны быть равномерно ориентированных на улитке функционировать 10. в механосенсорные волосковые клетки так называемый из-за stereociliary пучки, которые простираются от кутикулы пластины (апикальной поверхности) каждой сенсорной волосковых клеток 11. Они действуют как первичных преобразователей в mechanosensation и несмотря на их номенклатуре в качестве стереоцилиях, фактически состоит из модифицированного актиновых филаментов на основе микроворсинок. Внутри каждого шеврона-образной волос расслоение, три ряда стереоцилиях организованы в очень упорядоченной и регулярной годовыхttern в лестница манере. Реальный микротрубочек на основе реснички, называемые киноцилии, которые необходимы для развития и ориентации stereociliary пучков 12. По каждой ячейке волос, одна киноцилия физически подключен к стереоцилий расслоения, расположенный в центре рядом с самой высокой строки стереоцилий. Точная функция киноцилии неясно, и одна гипотеза, что Киноцилия 'тянет' Стереоцилии в форме, как они созревают с микроворсинок 12. У позвоночных киноцилии в улитке имеются только временно и убрать из волосковых клеток у мышей до начала слушания 11,13,14.Полная потеря ресничек в развивающихся результатов улитки сильно укороченных кохлеарных каналов, неправильно формируется и неправильно ориентированной stereociliary пучки, а также неправильно расположенные Кинетосомы 8,9. Функциональная ресничка не просто состоит из ресничного аксонемы. Многие белки, связанные с ресничкамиФункция происходят в комплексах локализованных в ресничками связанной поддоменов, таких как базального тельца, в переходной зоне, или мерцательной аксонемы 15. Базальное тельце, происходит от материнской центриоли из центросомы, также микротрубочки организационным центром для микротрубочек, проходящих от реснички в теле клетки и может регулировать внутриклеточный людьми, а также с торговлей ресничек. Зона цилиарного перехода является еще одним регионом, где функция цилиарной регулируется с точки зрения организации импорта и экспорта цилиарных соединений 16.
Многочисленные исследования выявили связь между ресничками и неканонической Wnt (РСР сигнализации), хотя точный механизм остается неясным 17. Избыточность цилиарных и PCP генов и чувствительность клеточной полярности к обобщенным клеточных нарушений, затрудняют напрямую связать мутацию в PCP конкретных дефицитов. Один из считанных выходы сигнализации PCP является расположение базальных тела и Primarу ресничка, поэтому разделения первичного от вторичных дефектов является сложной задачей. Некоторые исследования в данио и мыши мутантов не предложили никакой связи между ресничками и Wnt сигнализации 18-20. Расхождение в данных могут отражать виды, ткани или височно-зависимые различия в цилиарных взносов в Wnt сигнализации. Кроме того, нормальная Wnt отзывчивость может быть сохранена, если базальные тельца остаются функциональными. Более глубокое проникновение в роли цилиарных белков в клеточных сигнальных путей и других биологических явлений имеет решающее значение для нашего понимания сотовой биологии и биологии развития, а также для развития целевых стратегий лечения.
При подготовке кохлеарный ткани для анализа, есть несколько ключевых моментов, чтобы иметь в виду. Во-первых, различия в генетическом фоне может изменить кохлеарный фенотип, что делает необходимым для анализа и сравнения только элементы управления однопометница. Во-вторых, полное удал…
The authors have nothing to disclose.
Автор хотел бы поблагодарить Мэтью Келли, Тициана Cogliati, Джессика Gumerson Уве Вольфрума Ривка LEVRON, Виола Кречмер и Zoe Манн и их критической оценки рукописи. Эта работа была профинансирована Софья Ковалевская премии (Humbodlt Foundation) и Йоханнес-Университет Гутенберга, Майнц, Германия.
Tools/Equipment | |||
Silicone elastomere – Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | See Note 2 |
Micro dissecting scissors-straight blade | Various | ||
Fine forceps (no. 5 and 55) and blunt forceps | Various | ||
Dissecting microscope. | Various | ||
Uncoated glass microscope slides | Various | ||
Microscope cover slips (22 mm × 40 mm × 0.15 mm) | Various | ||
Transfer pipettes | Various | ||
Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
SEM sample holder | tousimis | 8762 | |
Scanning electron microscopy studs | TED PELLA | 16111 | |
PELCO Tabs: Carbon adhesive | TED PELLA | 16084-3 | |
Fluorescent Microscope | Various | ||
Critical Point Dryer | Various | ||
Scanning Electron Microscope | Various | ||
Glass microscope slides | Various | ||
Glass coverslips | Various | ||
Kimwipe Tissue | Various | ||
Fine Paint Brush | |||
Reagents | |||
1× Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco/Life Technologies | 10010023 | |
Paraformaldehyde (PFA) (EM Grade Required for EM) | Various | Prepare a 4% solution in 1× PBS made fresh each time. EM Grade Required for EM. | |
2.5% Glutaraldehyde Grade1 | Sigma-Aldrich | G5882 | |
Tris-HCl (pH 7.5) | Various | ||
NaCl | Various | ||
CaCl 2 | Various | ||
Triton X-100 | Various | ||
Normal Goat Serum | Various | ||
AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-007-003 | |
Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | |
10× Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco/Life Technologies | 14065 | |
Hepes | Gibco/Life Technologies | 15630-080 | |
Osmium tetroxide (OsO4 ) | Sigma-Aldrich/Fluka Analytical | 75632 | |
Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
Ethanol 200 proof | Various | ||
Antibodies | |||
anti Arl13b | Protein Tech | 17711-1-AP | Suggested concentration 1:1000 |
anti acetylated tubulin (611-B1) | Sigma-Aldrich | T6793 | Suggested concentration 1:800 |
anti gamma tubulin (GTU-88) | Sigma-Aldrich | T6557 | Suggested concentration 1:200 |
anti Zo_1 | Invitrogen | 40-2300 | Suggested concentration 1:500 |
Myosin VI | Proteus Biosciences | 25-6791 | Suggested concentration 1:1000 |
Myosin VIIa | Proteus Biosciences | 25-6790 | Suggested concentration 1:1000 |
anti Vangl2 | Merk Millipore | ABN373 | Suggested concentration 1:250 |
anti Gαi3 | Sigma-Aldrich | G4040 | Suggested concentration 1:250 |
Alexa Fluor® 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | Suggested concentration 1:300-1000 |
Alexa Fluor® 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | Suggested concentration 1:300-1000 |