大鼠皮层神经元丝状肌动蛋白（F-肌动蛋白）泪点的量化
Summary
Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.
Abstract
肌动蛋白丝状蛋白（F-肌动蛋白）起着spinogenesis，突触可塑性，突触稳定的重大作用。树突状F-肌动蛋白丰富的结构变化表明突触的完整性和连通性的改变。在这里，我们为主要培养大鼠皮层神经元，鬼笔环肽染色F-肌动蛋白泪点，和随后的量化技术的详细协议。首先，E18大鼠胚胎的额叶皮层解离成低密度细胞培养，然后在体外生长至少12-14天的神经元。以下实验性治疗，皮质神经元染色AlexaFluor 488鬼笔环肽（标记树枝状F-肌动蛋白泪点）和微管相关蛋白2（MAP2;验证神经元细胞和树突完整性）。最后，专门的软件，用于分析和量化随机选择的神经元树突。 F-肌动蛋白丰富的结构被确定二阶树突分支（长度范围25-75＆＃181;米），连续MAP2免疫。这里介绍的协议将是调查到实验处理后续树突突触结构的变化的有用方法。
Introduction
本研究的主要目标是开发测量（估计）的神经元的树突状网络的突触完整性的可靠方法。在这里，我们描述了使用鬼笔环肽染色和使用专门的（NIS元素）软件与后续分析树突免疫细胞化学（ICC）检测结合原代大鼠神经细胞培养F-肌动蛋白泪点的定量。
标毒肽对大型和小型丝（F-肌动蛋白）相似的亲和力，但不绑定到单体球状肌动蛋白（G-actin的），不像有些肌动蛋白抗体，1。鬼笔环肽非特异性结合是微不足道的，因此，细胞成像过程中提供最小的背景。鬼笔环肽是比通常被用于标记细胞蛋白为荧光显微镜，其允许由鬼笔环肽F-肌动蛋白的更强烈标记抗体小得多。因此，在神经元F-肌动蛋白本地化的详细图像可以通过使用标记的鬼笔环肽而获得的。
毒伞素（F-肌动蛋白），神经元树突染色产生离散的“热点”或明亮的“泪点”，它代表了各种树状结构，包括成熟的刺，无刺的突触2和不成熟的刺。未成熟的棘包括薄丝状伪足和某些形式的贴剂的形态，并且可以代表spinogenesis 3的启动。未成熟的刺和非多刺补丁缺乏PSD95 4。从而在生产F-肌动蛋白导致不仅刺后续变化，而 且还附加树枝状结构的变化，使得鬼笔环肽进行调查synaptodendritic完整性5-7的重要工具。一般情况下，鬼笔环肽阳性（F-肌动蛋白）泪点的数字反映了积极的突触之间的平衡（兴奋和抑制），肌动蛋白和突触的稳定性8。
虽然研究特异性T是非常重要的突触（即，兴奋性刺）的ypes，当治疗的靶标是未知有必要首先估计各种树枝状结构的总体完整性。由于F-肌动蛋白是树突棘和其它结构，包括抑制性突触，改变的数目F-肌动蛋白泪点的可指示synaptopathy的主要组成部分。这synaptopathy然后可用于更具体的变化进一步调查。我们的检测多种类型的突触/结构的量化方法产生的树突突触的改变（增加和减少）以下的各种实验性治疗的总体估计。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这个协议中，我们描述了在35毫米的玻璃底菜低密度这使我们能够识别单个神经元树突培养大鼠皮层神经元。接下来，我们使用鬼笔环肽和MAP2染色检测树枝状的改变。然后，我们使用专门的软件来量化在F-肌动蛋白泪点的变化。
为了确定F-肌动蛋白泪点的个体神经元的神经全网络必须是清晰可见的变化，这使得从单个神经元适当二阶树突段的选择。低密度电镀是为了既可视?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by NIH grants DA013137, DA031604, and HD043680. Partial support was provided by a NIH T32 training grant in Biomedical-Behavioral science.
Materials
| 35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| ProLong Gold | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Cover glass | VWR | 631-0137 | |
| AlexaFluor 488 Phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| Normal horse serum | Life Technologies | 26050-070 | |
| Chicken polyclonal anti-MAP2 | abcam | Ab92434 | |
| Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG | Life Technologies | A11042 | |
| NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342 | Life Technologies | R37605 | |
| NIS-Elements software package | Nikon Instruments | ||
| Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope | Nikon Instruments | ||
| 0.2 μm Nalgene nylon membrane filter | Fishersci | 151-4020 |
References
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