Summary

Kwantificering van draadvormige actine (F-actine) Puncta in Rat corticale neuronen

Published: February 10, 2016
doi:

Summary

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

Abstract

Filamenteus actine eiwit (F-actine) speelt een belangrijke rol in spinogenesis, synaptische plasticiteit, en synaptische stabiliteit. Veranderingen in de dendritische F-actine rijke structuren suggereren veranderingen in de synaptische integriteit en connectiviteit. Hier hebben we een gedetailleerd protocol voor het kweken van primaire rat corticale neuronen, Phalloidin kleuring voor F-actine puncta, en de daaropvolgende kwantificatie technieken. Ten eerste, de frontale cortex van de rat E18 embryo's worden gescheiden in een lage dichtheid celcultuur, dan de neuronen gekweekt in vitro gedurende ten minste 12-14 dagen. Volgende experimentele behandeling worden de corticale neuronen gekleurd met AlexaFluor 488 Phalloidin en microtubule-geassocieerd eiwit 2 (de dendritische F-actine puncta label) (MAP2, de neuronale cellen en dendritische integriteit valideren). Ten slotte wordt de gespecialiseerde software die wordt gebruikt om te analyseren en te kwantificeren willekeurig gekozen neuronale dendrieten. F-actine rijke structuren worden geïdentificeerd aan de tweede orde dendritische takken (lengte range 25-75 &# 181; m) met doorlopende MAP2 immunofluorescentie. Het protocol hier gepresenteerde een bruikbare methode voor het onderzoeken van veranderingen in dendritische structuren synaps na experimentele behandelingen.

Introduction

Het primaire doel van dit onderzoek is een betrouwbare meetmethode (schatting) van synaptische integriteit van de neuronale dendritische netwerk te ontwikkelen. Hier beschrijven we kwantificering van F-actine puncta in primaire rat gekweekte neuronen met een combinatie van Phalloidin kleuring en immunocytochemische (ICC) detectie van dendrieten met daaropvolgende analyse met behulp van gespecialiseerde (NIS-elementen) software.

Gelabelde phallotoxins soortgelijke affiniteit voor zowel grote als kleine filamenten (F-actine), maar niet binden aan monomere globulaire actine (G-actine), in tegenstelling tot sommige actine antilichamen 1. Niet-specifieke binding van Phalloidin verwaarloosbaar, waardoor minimale achtergrond tijdens cellulaire beeldvorming. Phalloidin is veel kleiner dan antilichamen die typisch zou worden gebruikt om cellulaire eiwitten te labelen voor fluorescentiemicroscopie, die zorgt voor veel intenser etikettering van F-actine met falloïdine. Zo kunnen gedetailleerde beelden van F-actine lokalisatie in neuronenverkregen door het gebruik van gelabelde Phalloidin.

Phalloidin (F-actine) kleuring van neuronale dendrieten genereert discrete "hot spots" of heldere "puncta", die een verscheidenheid van dendritische structuren, met inbegrip van volwassen stekels, niet-stekelige synapsen 2 en onvolwassen stekels vertegenwoordigen. Onrijpe stekels onder dunne filopodia en sommige vormen van patch morfologie, en kunnen de inleiding van spinogenesis 3 vertegenwoordigen. Onrijpe stekels en niet-stekelige flarden missen PSD95 4. Veranderingen in de productie van F-actine leiden tot latere wijzigingen in niet alleen stekels, maar ook extra dendritische structuren, waardoor Phalloidin een belangrijk instrument voor het onderzoeken van synaptodendritic integriteit 5-7. In het algemeen is het aantal Phalloidin-positieve (F-actine) puncta weerspiegelen een evenwicht tussen actieve synapsen (prikkelende en remmende), actine dynamiek en stabiliteit synaps 8.

Hoewel het belangrijk dieper specifieke types synapsen (dwz excitatoire stekels), wanneer het doel van de behandeling is niet bekend moet eerst de algemene integriteit van verschillende dendritische structuren te schatten. Aangezien F-actine is een belangrijke component van spines en andere structuren, waaronder remmende synapsen, een veranderde aantal F-actine puncta kan synaptopathy duiden. Dit synaptopathy kan dan verder worden onderzocht voor meer specifieke aanpassingen. Onze kwantificatie methode voor het opsporen van meerdere synaptische typen / structuren levert een totale raming van dendritische synaptische veranderingen (stijgingen en dalingen) na verschillende experimentele behandelingen.

Protocol

Alle dieren protocollen zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van South Carolina (assurance nummer: A3049-01) goedgekeurd. 1. Lage-dichtheid Embryonale neuronale Cultuur Voorbereiding voor primaire corticale neuron cultuur oplossingen: Bereid Poly-L-lysine voorraadoplossing door het oplossen van 5 mg van poly-L-lysine in 10 ml Boraatbuffer. Bereid werkoplossing door verdunning 1 ml poly…

Representative Results

In de huidige methoden, moeten we eerst cultuur rat corticale neuronen bij lage dichtheid in 35 mm glazen bodem gerechten, die ons in staat stelt om de dendrieten van individuele neuronen te identificeren. In figuur 1, de differentiële interferentie contrast (DIC) beelden tonen de morfologische veranderingen in de ontwikkeling foetale rat corticale neuronen op dag 4, 6, 10, 14, 21 en 27 in vitro. Merk op dat de lengte en het aantal dendrieten toenemen rijping v…

Discussion

In dit protocol beschrijven we het kweken van rat corticale neuronen bij lage dichtheid in 35 mm glazen bodem gerechten die ons in staat stelt om dendrieten van individuele neuronen te identificeren. Vervolgens gebruiken we Phalloidin en MAP2 kleuring dendritische veranderingen te detecteren. Vervolgens gebruikten we gespecialiseerde software veranderingen in F-actine puncta kwantificeren.

Om veranderingen in de F-actine puncta het hele neurale netwerk van een individuele neuron moet duideli…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was funded by NIH grants DA013137, DA031604, and HD043680. Partial support was provided by a NIH T32 training grant in Biomedical-Behavioral science.

Materials

35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass MatTek Corporation P35G-1.5-20-C
DMEM/F12 medium Life Technologies 10565-018
Trypsin-EDTA Life Technologies 15400-054
Poly-L-Lysine Sigma P9155
Boric acid Sigma B0252
Borax Sigma B9876
GlutaMax Life Technologies 35050-061 100X
Glucose VWR 101174Y
HBSS Sigma H4641 10X
Neurobasal medium Life Technologies 21103-049
B-27 supplement Life Technologies 17504-044 50X
Antibiotic-Antimycotic solution Cellgro 30004CI 100X
Sodium Bicarbonate Life Technologies 25080
Vannas Scissors World Precision Instruments 500086
Iris Scissors World Precision Instruments 500216
Iris Forceps World Precision Instruments 15914
Dumont #7 Forceps World Precision Instruments 14097
Dumont #5 Forceps World Precision Instruments 14095
ProLong Gold Life Technologies P36930
Paraformaldehyde  Sigma P6148
Cover glass VWR 631-0137
AlexaFluor 488 Phalloidin Life Technologies A12379
Normal horse serum Life Technologies 26050-070
Chicken polyclonal anti-MAP2 abcam Ab92434
Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG Life Technologies A11042
NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342 Life Technologies R37605
NIS-Elements software package Nikon Instruments
Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope  Nikon Instruments
0.2 μm Nalgene nylon membrane filter Fishersci 151-4020

References

  1. Heller, E. A., et al. The biochemical anatomy of cortical inhibitory synapses. PLoS One. 7, e39572 (2012).
  2. Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker, G. Selective clustering of glutamate and gamma-aminobutyric acid receptors opposite terminals releasing the corresponding neurotransmitters. Proc Natl Acad Sci USA. 91, 12373-12377 (1994).
  3. Johnson, O. L., Ouimet, C. C. A regulatory role for actin in dendritic spine proliferation. Brain Res. 1113, 1-9 (2006).
  4. Rao, A., Craig, A. M. Signaling between the actin cytoskeleton and the postsynaptic density of dendritic spines. Hippocampus. 10 (5), 527-541 (2000).
  5. Matus, A., Ackermann, M., Pehling, G., Byers, H. R., Fujiwara, K. High actin concentrations in brain dendritic spines and postsynaptic densities. Proc Natl Acad Sci USA. 79, 7590-7594 (1982).
  6. Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors. J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).
  7. Sekino, Y., Kojima, N., Shirao, T. Role of actin cytoskeleton in dendritic spine morphogenesis. Neurochem Int. 51, 92-104 (2007).
  8. Zhang, W., Benson, D. L. Stages of synapse development defined by dependence on F-actin. J Neurosci. 21 (14), 5169-5181 (2001).
  9. Bertrand, S. J., Aksenova, M. V., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 Tat protein variants: Critical role for the cysteine region in synaptodendritic injury. Exp Neurol. 248, 228-235 (2013).
  10. Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Aksenova, M. V., Espensen-Sturges, T. D., Booze, R. M. Synaptodendritic recovery following HIV Tat exposure: neurorestoration by phytoestrogens. J Neurochem. 128 (1), 140-151 (2014).
  11. Lau, P. M., Zucker, R. S., Bentley, D. Induction of filopodia by direct local elevation of intracellular calcium ion concentration. J Cell Biol. 145, 1265-1275 (1999).

Play Video

Cite This Article
Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (108), e53697, doi:10.3791/53697 (2016).

View Video