Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Kwantificering van draadvormige actine (F-actine) Puncta in Rat corticale neuronen

doi: 10.3791/53697 Published: February 10, 2016
* These authors contributed equally

Abstract

Filamenteus actine eiwit (F-actine) speelt een belangrijke rol in spinogenesis, synaptische plasticiteit, en synaptische stabiliteit. Veranderingen in de dendritische F-actine rijke structuren suggereren veranderingen in de synaptische integriteit en connectiviteit. Hier hebben we een gedetailleerd protocol voor het kweken van primaire rat corticale neuronen, Phalloidin kleuring voor F-actine puncta, en de daaropvolgende kwantificatie technieken. Ten eerste, de frontale cortex van de rat E18 embryo's worden gescheiden in een lage dichtheid celcultuur, dan de neuronen gekweekt in vitro gedurende ten minste 12-14 dagen. Volgende experimentele behandeling worden de corticale neuronen gekleurd met AlexaFluor 488 Phalloidin en microtubule-geassocieerd eiwit 2 (de dendritische F-actine puncta label) (MAP2, de neuronale cellen en dendritische integriteit valideren). Ten slotte wordt de gespecialiseerde software die wordt gebruikt om te analyseren en te kwantificeren willekeurig gekozen neuronale dendrieten. F-actine rijke structuren worden geïdentificeerd aan de tweede orde dendritische takken (lengte range 25-75 &# 181; m) met doorlopende MAP2 immunofluorescentie. Het protocol hier gepresenteerde een bruikbare methode voor het onderzoeken van veranderingen in dendritische structuren synaps na experimentele behandelingen.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Het primaire doel van dit onderzoek is een betrouwbare meetmethode (schatting) van synaptische integriteit van de neuronale dendritische netwerk te ontwikkelen. Hier beschrijven we kwantificering van F-actine puncta in primaire rat gekweekte neuronen met een combinatie van Phalloidin kleuring en immunocytochemische (ICC) detectie van dendrieten met daaropvolgende analyse met behulp van gespecialiseerde (NIS-elementen) software.

Gelabelde phallotoxins soortgelijke affiniteit voor zowel grote als kleine filamenten (F-actine), maar niet binden aan monomere globulaire actine (G-actine), in tegenstelling tot sommige actine antilichamen 1. Niet-specifieke binding van Phalloidin verwaarloosbaar, waardoor minimale achtergrond tijdens cellulaire beeldvorming. Phalloidin is veel kleiner dan antilichamen die typisch zou worden gebruikt om cellulaire eiwitten te labelen voor fluorescentiemicroscopie, die zorgt voor veel intenser etikettering van F-actine met falloïdine. Zo kunnen gedetailleerde beelden van F-actine lokalisatie in neuronenverkregen door het gebruik van gelabelde Phalloidin.

Phalloidin (F-actine) kleuring van neuronale dendrieten genereert discrete "hot spots" of heldere "puncta", die een verscheidenheid van dendritische structuren, met inbegrip van volwassen stekels, niet-stekelige synapsen 2 en onvolwassen stekels vertegenwoordigen. Onrijpe stekels onder dunne filopodia en sommige vormen van patch morfologie, en kunnen de inleiding van spinogenesis 3 vertegenwoordigen. Onrijpe stekels en niet-stekelige flarden missen PSD95 4. Veranderingen in de productie van F-actine leiden tot latere wijzigingen in niet alleen stekels, maar ook extra dendritische structuren, waardoor Phalloidin een belangrijk instrument voor het onderzoeken van synaptodendritic integriteit 5-7. In het algemeen is het aantal Phalloidin-positieve (F-actine) puncta weerspiegelen een evenwicht tussen actieve synapsen (prikkelende en remmende), actine dynamiek en stabiliteit synaps 8.

Hoewel het belangrijk dieper specifieke types synapsen (dwz excitatoire stekels), wanneer het doel van de behandeling is niet bekend moet eerst de algemene integriteit van verschillende dendritische structuren te schatten. Aangezien F-actine is een belangrijke component van spines en andere structuren, waaronder remmende synapsen, een veranderde aantal F-actine puncta kan synaptopathy duiden. Dit synaptopathy kan dan verder worden onderzocht voor meer specifieke aanpassingen. Onze kwantificatie methode voor het opsporen van meerdere synaptische typen / structuren levert een totale raming van dendritische synaptische veranderingen (stijgingen en dalingen) na verschillende experimentele behandelingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle dieren protocollen zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van South Carolina (assurance nummer: A3049-01) goedgekeurd.

1. Lage-dichtheid Embryonale neuronale Cultuur

  1. Voorbereiding voor primaire corticale neuron cultuur
    1. oplossingen:
      1. Bereid Poly-L-lysine voorraadoplossing door het oplossen van 5 mg van poly-L-lysine in 10 ml Boraatbuffer.
      2. Bereid werkoplossing door verdunning 1 ml poly-L-lysine De in 49 ml boraatbuffer.
      3. Bereid boraatbuffer, pH 8,4 door te beginnen met 395 ml dH 2 O en vervolgens het toevoegen van alle ingrediënten (1,24 g boorzuur + 1,9 g Borax). Stel de pH tot 8,4 met 1 M NaOH. Pas tot 400 ml en filter met 0,2 um nylon membraanfilter onder de motorkap.
      4. Bereid HBSS oplossing, pH 7,2 door te beginnen met 445 ml dH 2 O en het toevoegen van alle andere bestanddelen (50 ml 10X HBSS Stock + 1,2 g HEPES). Stel de pH tot 7,2 met 1 N HCl, bring tot 500 ml en filter met 0,2 um nylon membraanfilter onder de motorkap.
      5. Bereid plating medium: DMEM / F12 met 10% foetaal runderserum. Filter met 0,2 um nylon membraanfilter onder de motorkap.
      6. Bereid compleet groeimedium: Aan 50 ml Neurobasal medium, voeg de supplementen (500 ui GlutaMax (100X) + 500 ul Glucose + 1 ml B-27 (50X) + 500 ui van antibiotica Antimycoticum-oplossing (100x) + 100 pl 7,5% natriumbicarbonaat. filter met 0,2 um nylon membraanfilter onder de motorkap.
    2. Twee dagen voor cultuur:
      1. Coat twaalf 35 mm glazen bodem gerechten met 2 ml Poly-L-Lysine werkoplossing en houdt onder de motorkap O / N.
    3. Een dag voor de cultuur:
      1. Lege bekledingsmiddel van de gerechten en spoel af met DDH 2 O. Laat gerechten te drogen voor een uur onder de motorkap.
      2. Bereid plating medium (DMEM / F12 met 10% foetaal runderserum (10% van de totale oplossing). Pipetteer 2 ml medium inelke schotel en incubeer O / N bij 37 ° C, 5% CO2.
        Let op: Het is belangrijk om plastic cultuur gerechten te vermijden bij het ​​kweken. Het gebruik van glazen bodem gerechten (voor omgekeerde microscopen) of dekglaasjes (voor staande microscopen) levert scherpe en heldere beelden. Vergeleken met een plastic bodem gerecht, de glazen bodem schaal voorkomt ongewenste tinten of schittering tijdens fluorescentie microscopie.
  2. Celkweek protocol:
    1. Put gekoelde HBSS Buffer (100-150 ml), 100 mm petrischaaltjes, tang, schaar, 50 ml buizen, en 15 ml buizen onder UV-licht in de kap.
    2. Euthanaseren zwangere rat met dodelijke inhalatie van 5% sevofluraan onder de motorkap buiten cultuur kamer.
    3. Steriliseren met 70% EtOH, tent de huid van de onderbuik behulp van een tang tijdens het snijden van de staart in het midden van abdominale cavity.Open de baarmoeder met een schaar de placenta bloot.
    4. Verwijder 8-10 E18 foetussen. Place 8-10 foetussen in petrischaaltjes met HBSS oplossing.
    5. Houd de achterkant van het hoofd van de foetus met een tang en gebruik schaar om het hoofd van het lichaam scheiden. Plaats het in een andere petrischaal gevuld met 5-7 ml van HBSS. Transfer gerecht te capuchon.
    6. Vul twee extra 100 mm petrischaal met koud HBSS.
    7. Peel opzij schedel, en schep de hersenen in een nieuwe petrischaal gevuld met HBSS.
    8. Gebruik scherp gebogen tang, aparte cerebellum en de hersenstam van de hersenen, vervolgens over te dragen hersenen om een ​​nieuwe petrischaal met koud HBSS erin.
    9. Gebruik een pincet te beveiligen, scheiden de hemisferen met gebogen pincet. hersenvliezen te verwijderen; isoleren frontale cortex en de overdracht stukken in gemarkeerd 15 ml centrifugebuizen.
    10. Vul de 15 ml buis met 2 ml verse HBSS en voeg 20 ul trypsine EDTA (10x geconcentreerd mengsel met 0,5% trypsine en 5,3 mM EDTA.) Aan elk 15 ml buis.
    11. Incubeer 10-15 minuten bij kamertemperatuur. Zwenk buis om de paar minuten, niet toestaan ​​dat de afwikkeling.
    12. After 10-15 min, gebruik glazen pipet om oude HBSS te verwijderen en tweemaal spoelen met nieuwe HBSS.
    13. Dompel in trypsineremmer (1 mg / ml, 2 mg trypsine-remmer in 2 ml HBSS), meng goed en laat het zitten 5 min. Was tweemaal met verse HBSS.
    14. Het gebruik van glazen pipet met rubberen bol, fijnstampen hersenen stukken 10-15 keer heel langzaam om zo bubbles.Triturate voorkomen dat opnieuw met een gekalibreerde pipet en een steriel tip met een gereduceerde tip diameter heel langzaam tot homogeen.
    15. Overdracht gedissocieerde cellen op gewenste dichtheid vooraf bereide gecoate kweekschalen (50 cellen / mm2). Incubeer O / N bij 37 ° C, 5% CO2.
    16. Na 24 uur werd vervangen DMEM / F12 medium met vers gemaakte volledige groei serumvrij Neurobasaal medium.
    17. Handhaaf de cellen te allen tijde in een 5% CO2 / 95% kamerlucht bevochtigde incubator gedurende ten minste 12-14 dagen voor de experimenten. Supplement de cellen elke 5-6 dagen met vers Neurobasal medium vervangen ongeveer 50% van het oude medium.

2. Fluorescerende Labeling en Immunocytochemie

Opmerking: De immunofluorescentie labeling van primaire corticale celkweken werd in glazen bodem 35 mm celcultuurschalen uitgevoerd met een werkvolume van 1 ml.

  1. Het glazen bodem schaal tweemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing pH 7,4 (PBS).
  2. Fix cellen met 4% paraformaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Was de cellen tweemaal met PBS en doorlaatbaar met 0,1% Triton X-100 in PBS gedurende 5 minuten.
  4. Behandel cellen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur met een F-actine specifieke kleurstof, AlexaFluor 488 Phalloidin (01:40, 25 gl Phalloidin in 1 ml PBS).
  5. Spoel de cellen tweemaal met PBS en geblokkeerd met 10% normaal geit serum bij kamertemperatuur gedurende 1-2 uur.
  6. Verdun de kippen polyklonale anti-MAP2 antilichaam (1: 2500) in PBS met 2% normaal geit serum en geïncubeerd O / N bij 4 oC
  7. Na incubatie, spoelen in PBS twee keer.
  8. Verdun de secundaire antilichaam (Alexa Red 594-geconjugeerde geit anti-kip IgG (1: 500) met 2% normaal geit serum en incubeer gedurende 2 uur bij KT.
  9. Spoelen met PBS en voeg 10 pl / schotel van Hoechst kleurstof.
  10. Incubeer 3 min bij RT en wassen met PBS twee keer.
    Opmerking: De gelabelde cellen klaar voor stap 3 (F-actine puncta tellen).
  11. Preserve cel monster met 100 ui antifade reagens als afdekproces middel en houden bij 4 ° C in het donker voor de lange termijn opslag.
    Opmerking: Phalloidin is relatief stabiel in PBS bij 4 ° C in het donker tot 1 week en fluorescentie kan worden geconserveerd met antifade afdekken reagentia. Echter, optimale afbeeldingen verkregen 1-3 dagen na kleuring sinds Phalloidin kan beginnen uit te verspreiden met langdurige opslag.

3. F-actine Puncta Counting

  1. Schakel fluorescentiemicroscoop en over te schakelen naar 20 × doelstelling. Open microscoop software, en het opzetten van programma van 1280 × 960 pixels beeldformaat, en 0,17 um / pixel resolutie bij 1 × zoom.
  2. Acquire beelden van co-gelabelde F-actine / MAP2 neuronen onder groene (495 nm) / rood (613 nm) fluorescerende kanalen.
  3. Kies 5 Green (F-actine) / Rood (MAP2) immunolabeled / blauw (Hoechst) fluorescerende beelden van individuele neuron met duidelijk omschreven dendritische priëlen.
  4. Identificeer de F-actine rijke structuren in tweede orde dendritische segment (lengte range 25-75 pm) met doorlopende MAP2 immunofluorescentie.
  5. Draai het geselecteerde gebied van beelden naar een horizontale niveau. Kopiëren en plakken als nieuwe afbeelding.
  6. Aftrekken van de achtergrond van afbeeldingen, met een consistente dient voor elk gerecht.
  7. Tel de felgroene F-actine puncta en traceren van de lengte van de geselecteerde dendritische segment handmatig door getrainde onafhankelijke waarnemers. Exporteer de gegevens naar een spreadsheet-bestand.
  8. Bereken de dichtheid door het totale F-actine gelabeld puncta (N) door de lengte (L) van de MAP2 gemerkte dendrieten. Express-gegevens als het aantal F-actin puncta per 10 micrometer van dendriet
    Opmerking: Puncta (size ≤1.5 pm) van F-actine fluorescentie met een piekintensiteit van ten minste 50% boven het gemiddelde intensiteit van kleuring in de dendritische as werden in elke geselecteerde dendritische segment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

In de huidige methoden, moeten we eerst cultuur rat corticale neuronen bij lage dichtheid in 35 mm glazen bodem gerechten, die ons in staat stelt om de dendrieten van individuele neuronen te identificeren. In figuur 1, de differentiële interferentie contrast (DIC) beelden tonen de morfologische veranderingen in de ontwikkeling foetale rat corticale neuronen op dag 4, 6, 10, 14, 21 en 27 in vitro. Merk op dat de lengte en het aantal dendrieten toenemen rijping van ratten gekweekte primaire neuronen. Neuronen worden gebruikt in proeven na 14 dagen rijping.

Om dendritische en synaptische veranderingen te detecteren, combineren we de Phalloidin F-actine labeling met MAP2 antilichaam detectie van dendrieten. Aangezien Phalloidin etikettering van F-actine is zeer snel (20-30 min), is het mogelijk om de integriteit van het netwerk synaptodendritic visueel schatten alvorens ICC antilichaam labeling (Figuur 2

Vervolgens krijgen we hoge resolutie beelden van co-gelabelde Phalloidin (F-actine) / MAP2 neuronen en willekeurig geselecteerde neuronen geanalyseerd. Fijn filopodia, wervelkolom uitsteeksels en F-actine pleisters werden F-actine structuren rijk beschouwd en opgenomen in onze studie (figuur 3). Segmenten van de tweede orde dendrieten (MAP2 positief) werden geselecteerd voor de analyse van F-actine puncta dichtheden. MAP2 positieve kleuring wordt gebruikt om de neuronale lokalisatie van F-actine puncta bevestigen. Computerondersteunde detectie en het tellen van Phalloidin (F-actine) gemerkt (groene fluorescentie kanaal) synaptische puncta werd uitgevoerd via het gebruik van gespecialiseerde software. Er is een stap voor stap beschreven protocol in figuur 4 2 = 0,97).

Voorheen gebruikten we kwantificeren van F-actine te puncta synaptodendritic schade geïnduceerd door HIV-1 Tat 9 en herstel van HIV-1 Tat geïnduceerde synaptopathy 10 beoordelen. In figuur 5, rat corticale neuronen werden tezamen gelabeld met Phalloidin en MAP2 antilichaam na 50 nM HIV-1 Tat behandeling. MAP2 vlekken bleek minder dendritische takken en verminderde F-actine volgende HIV-1 Tat-behandeling.

We vonden dat F-actine puncta zowel stijgen of dalen als reactie op experimentele behandelingen. In figuur 6, werden gekweekte neuronen behandeld met the-concurrerende NMDA receptor antagonist memantine, aanzienlijke verhoging van F-actine positieve puncta. Daarentegen behandeling met een combinatie van metamfetamine + HIV-1 Tat resulteerde in significant verlies van F-actine puncta.

Figuur 1
Figuur 1. Foetale rat corticale neuronen in celcultuur Differentieel interferentie contrast (DIC) beelden van de foetale rat corticale neuronen tussen 4 -. 27 dagen in vitro (20X). Neuronen verschijnen volwassen op 14 dagen in vitro. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 2
Figuur 2. Phalloidin / MAP2 co-labeling in de rat corticale neuronen. Gekweekte neuronen gelabeld met MAP2 antilichaam (rood) en Phalloidin (groen). Samengevoegde afbeeldingen laten bepalen dat de Phalloidin kleuring wordt gelokaliseerd aan neuronale dendrieten (20X). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3. F-actine synaptische structuren van rat corticale neuronen. (A) Linker - F-actine positieve structuren gelabeld met Phalloidin (60X). De pijlpunten geven aan F-actine gelabeld structuren omvatten paddestoel stekels (paars), patch-achtige morfologie (blauw) en lange filopodia (oranje). Midden - samengevoegde afbeelding te tonen deze F-actine structuren worden gelokaliseerd op dendrieten (20X). Right - Box in de rechterbenedenhoek geeft aan dat de tweede orde dendritische tak geselecteerd voor analyse (20X) (B) Dendritische segmenten van Phalloidin (F-actine) (Groen) / MAP2. (Rood) co-gemerkte corticale neuronen (20X) worden gebruikt om neuronale oorsprong van F-actine puncta verifiëren. De groene enige afbeelding (Phalloidin / F-actine) wordt verder verwerkt. (C) Phalloidin / F-actine (groen) beelden van de drie dendritische segmenten geselecteerd voor puncta tellen. Dichtheden worden bepaald door N / l. N = aantal puncta, L = lengte van dendritische segment. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4. Demonstratie van softwarepakket. Stap voor stap instructies Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

/53697fig5.jpg "/>
Figuur 5. HIV-1 Tat gemedieerde synaptodendritic letsel rat corticale neuronen. Celkweken werden geco-gekleurd voor F-actine en MAP2 na HIV-1 Tat eiwit behandeling (50 nM). Upper panelen- onbehandelde neuronen tonen robuuste F-actine, complexe vertakking patronen, en uitgebreide fijne neuronale processen. Onderste panelen - HIV-1 Tat eiwit neuronen behandeld met verminderde F-actine en verminderde dendritische vertakking. (20X) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 6
Figuur 6 F-actine puncta in rat corticale neuronen. Verschillende effecten die Memantine vs. metamfetamine + Tat behandeling Images (20X) van onbehandelde gekweekte neuronen, neuronen behandeld met memantine (10 uM) en neuronen behandeld met Methamphetamine (20 uM) 10 nM Tat (10 nM). Memantine behandeling verhoogde de F-actine kleuring, terwijl Methamphetamine + HIV-1 Tat behandeling daalde F-actine kleuring en verminderde dendritische vertakking. Memantine behandeling aanzienlijk toegenomen F-actine puncta dichtheid ten opzichte van onbehandelde controlekweken. Daarentegen Methamphetamine + HIV-1 Tat behandelingen significant verlaagd F-actine puncta dichtheid ten opzichte van onbehandelde controlekweken. Mean + SEM, * p <0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

In dit protocol beschrijven we het kweken van rat corticale neuronen bij lage dichtheid in 35 mm glazen bodem gerechten die ons in staat stelt om dendrieten van individuele neuronen te identificeren. Vervolgens gebruiken we Phalloidin en MAP2 kleuring dendritische veranderingen te detecteren. Vervolgens gebruikten we gespecialiseerde software veranderingen in F-actine puncta kwantificeren.

Om veranderingen in de F-actine puncta het hele neurale netwerk van een individuele neuron moet duidelijk zichtbaar zijn vast te stellen, dit maakt het mogelijk de selectie van geschikte tweede orde dendritische segmenten van een enkele neuron. Low-density plating is essentieel om zowel individuele neuronen te visualiseren en de aanwezigheid van gliale cellen te minimaliseren. Astrocytes bevatten ook F-actine en zonder neuronale marker, zou de analyse van de F-actine positieve puncta beschamen. Lage dichtheid kweken en het gebruik van Neurobasal medium zijn nuttig afnemende astrocytic proliferatie in de celkweken. Aangezien het voorbehoud dat de F-actine eiwitniet specifiek voor neuronen specifieke neuronale proteïne markers, zoals MAP2 moet worden gebruikt met Phalloidin. Andere eiwit antilichamen kunnen ook worden gebruikt in combinatie met Phalloidin zoals TH (tyrosine hydroxylase) voor identificatie van specifieke neuronale populaties in kweek.

Een algemene techniek voor het bestuderen van synapsen en synaptische morfologie is immunocytochemie (ICC). ICC is populair omdat veel antilichamen synaptische eiwitten zijn beschikbaar waaronder PSD 95, NMDAR (postsynaptische) en synaptofysine, fagot en synapsin I (presynaptische) 11. Sommige structuren kan niet worden gedetecteerd door ICC (zoals dunne filopodia), maar een combinatie van F-actine labeling met Phalloidin detectie antilichaam (of dubbele labeling met twee verschillende antilichamen) kan zorgen voor specifieke en ingewikkeld onderzoek van synaptische subpopulaties en differentiële respons op experimentele behandelingen.

F-actine puncta kunnen partic zijngoed vast gevoelig voor experimentele behandelingen. We hebben onlangs gemeld dat behandeling met HIV-1 Tat eiwit een afname van F-actine puncta (24 uur) vóór enig bewijs voor duidelijke neuronale dood (48 uur) 10. Het is opmerkelijk dat experimentele behandelingen kunnen zowel stijging (memantine) of verlagen (methamfetamine + HIV-1 Tat) F-actine puncta. We vonden ook dat F-actine puncta verlies is een reversibele reactie volgende specifieke experimentele behandelingen 10. Als zodanig, F-actine puncta kwantificatie is een waardevol hulpmiddel om niet alleen acute synaptopathy, maar ook voor het bestuderen van synaptische herstel en herstel van zenuwen experimentele processen te monitoren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass MatTek Corporation P35G-1.5-20-C
DMEM/F12 medium Life Technologies 10565-018
Trypsin-EDTA Life Technologies 15400-054
Poly-L-Lysine Sigma P9155
Boric acid Sigma B0252
Borax Sigma B9876
GlutaMax Life Technologies 35050-061 100X
Glucose VWR 101174Y
HBSS Sigma H4641 10X
Neurobasal medium Life Technologies 21103-049
B-27 supplement Life Technologies 17504-044 50X
Antibiotic-Antimycotic solution Cellgro 30004CI 100X
Sodium Bicarbonate Life Technologies 25080
Vannas Scissors World Precision Instruments 500086
Iris Scissors World Precision Instruments 500216
Iris Forceps World Precision Instruments 15914
Dumont #7 Forceps World Precision Instruments 14097
Dumont #5 Forceps World Precision Instruments 14095
ProLong Gold Life Technologies P36930
Paraformaldehyde  Sigma P6148
Cover glass VWR 631-0137
AlexaFluor 488 Phalloidin Life Technologies A12379
Normal horse serum Life Technologies 26050-070
Chicken polyclonal anti-MAP2 abcam Ab92434
Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG Life Technologies A11042
NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342 Life Technologies R37605
NIS-Elements software package Nikon Instruments
Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope  Nikon Instruments
0.2 μm Nalgene nylon membrane filter Fishersci 151-4020

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heller, E. A., et al. The biochemical anatomy of cortical inhibitory synapses. PLoS One. 7, e39572 (2012).
  2. Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker, G. Selective clustering of glutamate and gamma-aminobutyric acid receptors opposite terminals releasing the corresponding neurotransmitters. Proc Natl Acad Sci USA. 91, 12373-12377 (1994).
  3. Johnson, O. L., Ouimet, C. C. A regulatory role for actin in dendritic spine proliferation. Brain Res. 1113, 1-9 (2006).
  4. Rao, A., Craig, A. M. Signaling between the actin cytoskeleton and the postsynaptic density of dendritic spines. Hippocampus. 10, (5), 527-541 (2000).
  5. Matus, A., Ackermann, M., Pehling, G., Byers, H. R., Fujiwara, K. High actin concentrations in brain dendritic spines and postsynaptic densities. Proc Natl Acad Sci USA. 79, 7590-7594 (1982).
  6. Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors. J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).
  7. Sekino, Y., Kojima, N., Shirao, T. Role of actin cytoskeleton in dendritic spine morphogenesis. Neurochem Int. 51, 92-104 (2007).
  8. Zhang, W., Benson, D. L. Stages of synapse development defined by dependence on F-actin. J Neurosci. 21, (14), 5169-5181 (2001).
  9. Bertrand, S. J., Aksenova, M. V., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 Tat protein variants: Critical role for the cysteine region in synaptodendritic injury. Exp Neurol. 248, 228-235 (2013).
  10. Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Aksenova, M. V., Espensen-Sturges, T. D., Booze, R. M. Synaptodendritic recovery following HIV Tat exposure: neurorestoration by phytoestrogens. J Neurochem. 128, (1), 140-151 (2014).
  11. Lau, P. M., Zucker, R. S., Bentley, D. Induction of filopodia by direct local elevation of intracellular calcium ion concentration. J Cell Biol. 145, 1265-1275 (1999).
Kwantificering van draadvormige actine (F-actine) Puncta in Rat corticale neuronen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (108), e53697, doi:10.3791/53697 (2016).More

Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (108), e53697, doi:10.3791/53697 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter