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Neuroscience

Quantifizierung von filamentösen Aktin (F-Aktin) Puncta in Rat Cortical Neurons

doi: 10.3791/53697 Published: February 10, 2016
* These authors contributed equally

Abstract

Filamentösen Aktin-Protein (F-Actin) spielt eine wichtige Rolle in spinogenesis, synaptischer Plastizität und synaptischen Stabilität. Änderungen in dendritischen F-Actin-reichen Strukturen deuten darauf hin, Veränderungen der synaptischen Integrität und Konnektivität. Hier bieten wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zur Kultivierung von primären Ratten-kortikalen Neuronen, Phalloidin-Färbung für F-Actin puncta und anschließende Quantifizierung Techniken. Zuerst werden die frontalen Kortex von E18-Rattenembryos dissoziiert in Low-Density-Zellkultur, dann die Nervenzellen in vitro gezüchtet mindestens 12-14 Tage. Folgenden experimentellen Behandlung werden die kortikalen Neuronen gefärbt mit AlexaFluor 488 Phalloidin (die dendritische F-Aktin puncta zu markieren) und Mikrotubuli-assoziiertes Protein 2 (MAP2; die neuronalen Zellen und dendritischen Integrität zu validieren). Schließlich wird spezielle Software zu analysieren und zu quantifizieren zufällig ausgewählten neuronalen Dendriten verwendet. F-Actin reichen Strukturen sind auf zweiter Ordnung dendritischen Verzweigungen (Längenbereich 25-75 identifiziert &# 181; m) mit kontinuierlicher MAP2 Immunfluoreszenz. Das Protokoll hier vorgestellt wird eine nützliche Methode zur Untersuchung von Veränderungen in dendritische Synapse Strukturen im Anschluss an experimentellen Behandlungen.

Introduction

Das primäre Ziel dieser Studie ist es, eine zuverlässige Methode zur Messung (Schätzung) der synaptischen Integrität der neuronalen dendritischen Netzwerk zu entwickeln. Hier beschreiben wir die Quantifizierung von F-Actin puncta in primären Ratten kultivierten Neuronen eine Kombination von Phalloidin-Färbung verwendet und immunzytochemische (ICC) Erkennung von Dendriten mit anschließender Analyse mit speziellen (NIS-Elements) Software.

Markierten Phallotoxine haben ähnliche Affinität für sowohl große als auch kleine Filamente (F-Actin), aber binden nicht an monomeren globulären Actin (G-Actin), im Gegensatz zu einigen Aktin Antikörper 1. Die unspezifische Bindung von Phalloidin vernachlässigbar ist, so minimal Hintergrund während der zellulären Bildgebung bietet. Phalloidin ist viel kleiner als Antikörper, die normalerweise verwendet werden würde zelluläre Proteine ​​für Fluoreszenzmikroskopie zu kennzeichnen, die durch Phalloidin für viel intensiver Markierung von F-Aktin ermöglicht. So detaillierte Bilder von F-Actin-Lokalisierung in Neuronen seindurch die Verwendung von markiertem Phalloidin erhalten.

Phalloidin (F-Actin) Färbung der neuronalen Dendriten erzeugt diskrete "Hot Spots" oder hell "puncta", die eine Vielzahl von dendritischen Strukturen darstellen, einschließlich reifen Stacheln, nicht stachelig Synapsen 2 und unreif Stacheln. Unreife Stacheln sind dünn Filopodien und einige Formen von Patch-Morphologie und kann die Einleitung spinogenesis 3 darstellen. Unreife Stacheln und nicht stachelig Patches fehlen PSD95 4. Veränderungen in der Produktion von F-Aktin führen zu Änderungen in nachfolgenden nicht nur Stacheln sondern auch zusätzliche dendritischen Strukturen, wodurch Phalloidin ein wichtiges Werkzeug für synaptodendritic Integrität 5-7 untersucht. In der Regel Zahlen von Phalloidin-positive (F-Actin) puncta reflektieren ein Gleichgewicht unter den aktiven Synapsen (erregenden und hemmenden), Aktindynamik und Synapse Stabilität 8.

Zwar ist es wichtig, spezifische t zu studierenypen von Synapsen (dh exzitatorischen Stacheln), wenn das Ziel der Behandlung ist es notwendig, nicht bekannt ist, zuerst die allgemeine Integrität einer Vielzahl von dendritischen Strukturen schätzen. Da F-Aktin ist eine Hauptkomponente von dendritischen Dornen und anderen Strukturen, einschließlich hemmende Synapsen, einer veränderten Anzahl von F-Aktin puncta eine Synaptopathie hinweisen. Diese Synaptopathie kann dann weiter für mehr spezifische Veränderungen untersucht werden. Unsere Quantifizierungsmethode mehrere synaptischen Arten / Strukturen zum Nachweis ergibt eine Gesamtschätzung von dendritischen synaptischen Veränderungen (Zunahmen und Abnahmen) nach verschiedenen experimentellen Behandlungen.

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Protocol

Alle Tierprotokolle wurden überprüft und durch die Animal Care und Use Committee an der University of South Carolina (Sicherung Nummer: A3049-01) zugelassen.

1. Low-Density-embryonale neuronale Kultur

  1. Vorbereitung für die primäre kortikale Neuronen Kultur
    1. Lösungen:
      1. Bereiten Poly-L-Lysin-Stammlösung durch Auflösen von 5 mg Poly-L-Lysin in 10 ml Boratpuffer.
      2. Bereiten Arbeitslösung durch Verdünnen von 1 ml Poly-L-Lysin-Lager auf 49 ml Boratpuffer.
      3. Bereiten Boratpuffer, pH 8,4, indem sie mit 395 ml dH 2 O beginnt und dann Zugabe aller Bestandteile (1,24 g Borsäure + 1,9 g Borax). Der pH-Wert auf 8,4 bis 1 M NaOH. Passen zu 400 ml und Filter mit 0,2 um Nylonmembranfilter unter der Motorhaube.
      4. Bereiten HBSS-Lösung, pH 7,2, indem sie mit 445 ml dH 2 O beginnt und das Hinzufügen alle anderen Zutaten (50 ml 10X HBSS Auf + 1,2 g HEPES). Der pH-Wert auf 7,2 mit 1 N HCl, bring bis 500 ml und Filter mit 0,2 um Nylonmembranfilter unter der Motorhaube.
      5. Bereiten Plattenmedium: DMEM / F12 mit 10% fötalem Rinderserum. Filter mit 0,2 um Nylonmembranfilter unter der Motorhaube.
      6. Bereiten komplette Wachstumsmedium: Zu 50 ml Neurobasalmedium, fügen Sie die Ergänzungsmittel (500 ul GlutaMAX (100X) + 500 ul Glucose + 1 ml B-27 (50x) + 500 ul Antibiotika-Antimykotika-Lösung (100X) + 100 ul 7,5% Natriumbicarbonat. Filter mit 0,2 um Nylonmembranfilter unter der Motorhaube.
    2. Zwei Tage vor Kultur:
      1. Mantel zwölf 35 mm Glasbodenschalen mit 2 ml Poly-L-Lysin-Arbeitslösung, und halten unter der Haube O / N.
    3. Einen Tag vor Kultur:
      1. Leere Beschichtungsmittel aus den Schalen und spülen mit ddH 2 O. Lassen Gerichte für eine Stunde unter der Motorhaube zu trocknen.
      2. Bereiten Plattenmedium (DMEM / F12 mit 10% fötalem Rinderserum (10% der Gesamtlösung). Pipette 2 ml Medium injedes Gericht, und O / N bei 37 ° C, 5% CO 2 inkubiert.
        Hinweis: Es ist wichtig, Kunststoff-Kulturschalen zu vermeiden, wenn die Kultivierung. Die Verwendung von Glasbodenschalen (für inverse Mikroskope) oder Deckgläser (für aufrechte Mikroskope) liefert scharfe und klare Bilder. Im Vergleich zu einem Kunststoff-Bodenschale, die Glasbodenschale verhindert unerwünschte Farbtöne oder Blendung während der Fluoreszenzmikroskopie.
  2. Zellkultur-Protokoll:
    1. Put gekühlt HBSS Puffer (100-150 ml), 100 mm-Petrischalen, Pinzetten, Scheren, 50 ml-Röhrchen und 15-ml-Röhrchen unter UV-Licht in der Haube.
    2. Euthanize trächtigen Ratten mit tödlichen Einatmen von 5% Sevofluran unter der Haube außerhalb von Kulturraum.
    3. Sterilisieren mit 70% EtOH, Zelt der Haut der Unterleib einer Pinzette, während aus dem Schwanz Zerschneiden in der Mitte der Bauch cavity.Open die Gebärmutter einer Schere, die Plazenta zu belichten.
    4. Entfernen 8-10 E18 Föten. Place 8-10 Föten in Petrischalen mit HBSS-Lösung.
    5. Halten Sie die Rückseite des Kopfes des Fötus mit einer Pinzette, dann mit einer Schere den Kopf vom Körper zu trennen. Legen Sie sie in eine andere Petrischale gefüllt mit 7.5 ml HBSS. Übertragen Gericht Kapuze.
    6. Füllen Sie zwei weitere 100-mm-Petrischale mit kaltem HBSS.
    7. Peel beiseite Schädel, und Schaufel Gehirn in eine neue Petrischale mit HBSS gefüllt.
    8. Scharfe gebogenen Pinzette, separater Kleinhirn und Hirnstamm aus Gehirn, dann übertragen Gehirn auf eine neue Petrischale mit kaltem HBSS darin.
    9. Verwenden einer Pinzette zu sichern, trennen Sie die Halbkugeln mit einer gebogenen Pinzette. Entfernen Hirnhaut; isolieren frontalen Kortex und Transfer Stücke in markierte 15 ml Zentrifugenröhrchen.
    10. Füllen Sie die 15-ml-Röhrchen mit frischem 2 ml HBSS und fügen Sie 20 ul Trypsin-EDTA (10x konzentrierte Mischung mit 0,5% Trypsin und 5,3 mM EDTA.) Zu jedem 15-ml-Tube.
    11. Inkubieren 10-15 Minuten bei Raumtemperatur. Sanft Rohr alle paar Minuten wirbeln, erlauben nicht nieder.
    12. After 10-15 min, Pipette Verwendung Glas alt HBSS und spülen Sie zweimal mit neuen HBSS zu entfernen.
    13. Tauchen Sie ein in Trypsin-Inhibitor (1 mg / ml, 2 mg Trypsin-Hemmstoff in 2 ml HBSS), gut mischen und lassen Sie es 5 Minuten sitzen. Zweimal waschen mit frischem HBSS.
    14. Mit Glaspipette mit Gummiball, verreiben Gehirn Stücke 10-15 mal sehr langsam, so dass bubbles.Triturate wieder mit einem kalibrierten Pipette und eine sterile Spitze mit einer reduzierten Spitzendurchmesser sehr langsam, bis sie homogen zu vermeiden.
    15. Transfer dissoziierten Zellen auf gewünschte Dichte vorzunehmen vorbereitet beschichteten Kulturschalen (50 Zellen / mm 2). O / N bei 37 ° C, 5% CO2 inkubiert.
    16. Nach 24 Stunden DMEM / F12-Medium mit frisch zubereiteten kompletten Wachstum Serum-freien Neurobasalmedium ersetzen.
    17. Pflegen der Zellen zu allen Zeiten in einem 5% CO 2/95% Raumluft befeuchteten Inkubator für mindestens 12-14 Tage vor dem Experiment. Ergänzen Sie die Zellen alle 5-6 Tage mit frischem Neurobasalmedium etwa 50% der alten Medium zu ersetzen.

2. Fluoreszenzmarkierung und Immunzytochemie

Hinweis: Die Immunfluoreszenz-Markierung von primären kortikalen Zellkulturen wurden in Glasboden 35 mm Zellkulturschalen mit einem Arbeitsvolumen von 1 ml durchgeführt.

  1. Waschen Sie die Glasbodenschale zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung pH 7,4 (PBS).
  2. Fix Zellen mit 4% Paraformaldehyd für 15 min bei RT.
  3. Wasche die Zellen zweimal mit PBS und permeabilisieren mit 0,1% Triton X-100 in PBS für 5 min.
  4. Behandlung von Zellen für 20 min bei RT mit einem F-Actin-spezifischen Farbstoffs, AlexaFluor 488 Phalloidin (1:40 25 ul Phalloidin in 1 ml PBS).
  5. Spülen Sie die Zellen zweimal mit PBS und Blockieren mit 10% normalem Ziegenserum bei RT für 1-2 Std.
  6. Verdünnen Sie das Huhn polyklonalen anti-MAP2 Antikörper (1: 2500) in PBS mit 2% normalem Ziegenserum und Inkubation O / N bei 4 o C
  7. Nach der Inkubation spülen zweimal in PBS.
  8. Verdünnen Sie die Sekundär-Antikörper (Alexa Red 594-konjugiertem Ziege-anti-Huhn-IgG (1: 500) mit 2% normalem Ziegenserum und 2 h bei RT inkubiert.
  9. Spülen mit PBS und fügen Sie 10 ul / Schale von Hoechst-Farbstoff.
  10. Inkubieren 3 min bei RT und waschen mit PBS zweimal.
    Hinweis: Die jetzt markierten Zellen bereit für Schritt 3 (F-Actin puncta Zählung).
  11. Preserve Zellprobe mit 100 ul Antifade-Reagenz als Eindeckmittel und halten bei 4 ° C im Dunkeln für langfristige Lagerung.
    Anmerkung: Phalloidin ist relativ stabil in PBS bei +4 ° C im Dunkeln für bis zu 1 Woche und Fluoreszenz kann mit Antifade Eindecken Reagenzien konserviert werden. Allerdings sind optimale Bilder von 1-3 Tagen nach der Färbung erhalten seit Phalloidin kann mit längerer Lagerung zu diffundieren beginnen.

3. F-Aktin Puncta Zählen

  1. Schalten Sie Fluoreszenzmikroskop und wechseln Sie in 20 × Ziel. Offene Mikroskop-Software und Programm bei 1280 × 960 Pixel Bildgröße einrichten und 0,17 um / Pixel Bildauflösung bei 1-facher Zoom.
  2. Erwerben Sie Bilder von Co-markierten F-Actin / MAP2 Neuronen unter Grün (495 nm) / Rot (613 nm) Fluoreszenz-Kanäle.
  3. Wählen Sie 5 Green (F-Actin) / Rot (MAP2) immun / Blue (Hoechst) Fluoreszenzbilder der einzelnen Neuron mit klar definierten dendritischen Dornen.
  4. Identifizieren Sie die F-Actin reichen Strukturen in zweiter Ordnung dendritischen Segment (Längenbereich von 25 bis 75 & mgr; m) mit kontinuierlicher MAP2 Immunfluoreszenz.
  5. Drehen Sie den ausgewählten Bereich der Bilder auf einer horizontalen Ebene. Kopieren und Einfügen als neues Bild.
  6. Ziehen Sie den Hintergrund der Bilder, eine konsistente Einstellungen für jedes Gericht verwenden.
  7. Zählen Sie die hellgrüne F-Actin puncta und Spuren die Länge der ausgewählten dendritischen Segment manuell durch geschultes unabhängige Beobachter. Exportieren Sie die Daten in ein Tabellenkalkulationsdatei.
  8. Berechnen der Dichte durch Dividieren Gesamt F-Aktin gekennzeichnet puncta (N) durch die Länge (L) der MAP2 Dendriten bezeichnet. Express-Daten als Anzahl von F-acZinn puncta pro 10 & mgr; m von Dendriten
    Anmerkung: Puncta (Größe ≤1.5 um) von F-Actin-Fluoreszenz mit einer Spitzenintensität von mindestens 50% über dem durchschnittlichen Intensität der Färbung in den dendritischen Welle wurden in jedem ausgewählten dendritischen Segment enthalten.

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Representative Results

In den vorliegenden Verfahren haben wir zunächst Kultur Ratte kortikalen Neuronen bei geringer Dichte in 35 mm Glasboden-Gerichte, die uns die Dendriten der einzelnen Neuronen zu identifizieren. In 1 zeigt das Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) Bilder, um die morphologischen Veränderungen an den Tagen fötalen Ratte kortikalen Neuronen Entwicklungs 4, 6, 10, 14, 21 und 27 in vitro. Beachten Sie, dass die Länge und Anzahl der Dendriten erhöhen mit der Reifung von kultivierten Ratten primären Neuronen. Neuronen sind nur nach 14 Tagen Reifung in Experimenten verwendet.

Um dendritische und synaptische Veränderungen erfassen, kombinieren wir die Phalloidin F-Actin-Kennzeichnung mit MAP2 Antikörper-Nachweis von Dendriten. Da Phalloidin Markierung von F-Aktin ist sehr schnell (20-30 min), ist es möglich, visuell die Integrität synaptodendritic Netz abzuschätzen, bevor mit ICC Antikörpermarkierung (Abbildung 2 fortfahren

Als nächstes erwerben wir hochauflösende Bilder von Co-markiertem Phalloidin (F-Actin) / MAP2 Neuronen und zufällig ausgewählten Nervenzellen untersucht. Feine Filopodien, Wirbelsäule Vorsprünge und F-Actin Patches wurden als F-Actin-reichen Strukturen und wurden in unseren Studien (Abbildung 3) enthalten. Segmente der zweiten Ordnung Dendriten (MAP2 positiv) wurden für die Analyse von F-Actin puncta Dichten ausgewählt. MAP2 positive Färbung verwendet, um den neuronalen Lokalisierung des F-Actin puncta zu bestätigen. Computergestützte Erkennung und Zählung von Phalloidin (F-Actin) markiert (grüne Fluoreszenz-Kanal) synaptischen puncta wurde durch den Einsatz von spezieller Software durchgeführt. Es ist ein Schritt für Schritt detaillierte Protokoll in Abbildung 4 (r 2 = 0,97), daß.

Zuvor verwendeten wir Quantifizierung von F-Aktin puncta synaptodendritic Verletzung beurteilen, induziert durch HIV-1-Tat-9 und Erholung von HIV-1 Tat-induzierte Synaptopathie 10. In Abbildung 5 wurden Ratte kortikalen Neuronen-co markiert mit Phalloidin und MAP2 Antikörper nach 50 nM HIV-1-Tat-Behandlung. MAP2 Färbung ergab weniger dendritische Zweige und verminderte F-Actin folgenden HIV-1-Tat-Behandlung.

Wir fanden, dass F-Aktin puncta kann entweder Anstieg oder Abfall in Reaktion auf experimentelle Behandlungen. In 6 wurden kultivierten Neuronen mit th behandeltene wettbewerbsfähig NMDA-Rezeptor-Antagonist Memantin, nimmt stark zu F-Actin-positiven puncta. Dagegen führte die Behandlung mit einer Kombination von Methamphetamin + HIV-1-Tat führte zu signifikanten Verlust an F-Aktin puncta.

Abbildung 1
Abbildung 1. Fetal Ratte kortikalen Neuronen in der Zellkultur Differentialinterferenzkontrast (DIC) Bilder von fetalen Ratte kortikalen Neuronen zwischen 4 -. 27 Tage in vitro (20X). Neuronen erscheinen reifen nach 14 Tagen in vitro. Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Phalloidin / MAP2 Co-Kennzeichnung in Ratte kortikalen Neuronen. Kultivierten Neuronen mit MAP beschriftet2-Antikörper (rot) und Phalloidin (grün). Zusammengeführt Bilder ermöglichen die Bestimmung, dass die Phalloidin-Färbung zu neuronalen Dendriten lokalisiert ist (20X). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3
Abbildung 3. F-Actin synaptischen Strukturen der Ratte kortikalen Neuronen. (A) Linke - F-Actin-positiven Strukturen mit Phalloidin (60X) markiert. Die Pfeilspitzen zeigen F-Actin-markierten Strukturen umfassen Pilz Stacheln (lila), pflasterartigen Morphologie (blau) und lange Filopodien (orange). Mitte - Fusionsbild diese F-Actin-Strukturen demonstriert werden lokalisiert Dendriten (20X). Rechts - Box in der rechten unteren zeigt die zweite dendritischen Verzweigung, um für die Analyse ausgewählt (20X) (B) Dendritische Segmente von Phalloidin (F-Actin) (Grün) / MAP2. (Rot) co-markierten kortikalen Neuronen (20x) werden verwendet, um neuronalen Ursprungs von F-Aktin puncta verifizieren. Die grüne nur Bild (Phalloidin / F-Actin) weiterverarbeitet wird. (C) Phalloidin / F-Aktin (grün) Bilder von drei dendritischen Segmente für puncta Zählen ausgewählt. Dichten errechnet sich, indem N / L bestimmt. N = Anzahl der puncta, L = Länge der dendritischen Segment. Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4. Demonstration der Software-Paket. Schritt für Schritt Anleitung Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 5. HIV-1-Tat synaptodendritic Verletzung in Ratten kortikalen Neuronen vermittelt. Die Zellkulturen wurden co-gefärbt F-Actin und MAP2 nach HIV-1-Tat-Protein-Behandlung (50 nM). Ober Panels- unbehandelten Neuronen zeigt robuste F-Actin, komplexe Verzweigungsmuster und umfangreiche Fein neuronalen Prozesse. Niederplatten - HIV-1-Tat-Protein behandelt Neuronen mit verminderter F-Actin und verringert dendritischen Verzweigung. (20x) Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 6
Abbildung 6. F-Actin puncta in Ratte kortikalen Neuronen. Unterschiedliche Wirkungen von Memantine gegen Methamphetamin + Tat Behandlung Images (20X) von unbehandeltem kultivierten Neuronen, Neuronen, behandelt mit Memantine (10 uM) und Neuronen mit Methamph behandeltEtamine (20 uM) 10 nM von Tat (10 nM). Memantine Behandlung erhöhte sich die F-Actin-Färbung, während Methamphetamin + HIV-1-Tat-Behandlung F-Actin-Färbung verringert und dendritischen Verzweigung verringert. Memantin-Behandlung deutlich erhöht F-Actin puncta Dichte, bezogen auf unbehandelte Kontrollkulturen. Im Gegensatz dazu verringert Methamphetamin + HIV-1-Tat-Behandlungen signifikant F-Aktin puncta Dichte, bezogen auf unbehandelte Kontrollkulturen. Mittelwert + SEM, * p <0.05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

In diesem Protokoll beschreiben Züchten wir Ratte kortikalen Neuronen bei geringer Dichte in 35 mm Glasboden-Gerichte, die uns Dendriten von einzelnen Neuronen zu identifizieren. Als nächstes benutzen wir Phalloidin und MAP2 Färbung zu dendritischen Änderungen erkennen. Dann haben wir spezialisierte Software-Änderungen in F-Actin puncta zu quantifizieren.

Um Änderungen in F-Aktin puncta bestimmen, muss das gesamte neuronale Netzwerk eines einzelnen Neurons deutlich sichtbar, ermöglicht diese Auswahl entsprechender zweiter Ordnung dendritischen Segmente aus einem einzelnen Neuron. Low-Density-Überzug ist kritisch, um sowohl an einzelnen Neuronen visualisieren sowie das Vorhandensein von Gliazellen zu minimieren. Astrozyten enthalten auch F-Actin und ohne neuronalen Marker könnte die Analyse von F-Actin positive puncta verwechseln. Low-Density-Kulturen und die Verwendung von Neurobasal Medium sind nützlich in Astrozyten Proliferation in den Zellkulturen zu verringern. Allerdings ist die Einschränkung, dass die F-Aktin-Protein gegeben istnicht spezifisch für Neuronen spezifische neuronale Proteinmarker, wie beispielsweise MAP2, sollten zusammen mit Phalloidin verwendet werden. Andere Protein-Antikörper können auch in Verbindung mit Phalloidin wie TH (Tyrosinhydroxylase) zur Identifizierung von spezifischen neuronalen Populationen in Kultur verwendet werden.

Eine allgemeine Technik für Synapsen und synaptische Morphologie des Studiums ist Immunzytochemie (ICC). ICC populär ist, da viele Antikörper für synaptische Proteine ​​leicht verfügbar sind, einschließlich PSD 95, NMDAR (post-synaptischen) sowie Synaptophysin, Fagott und Synapsin I (präsynaptischen) 11. Allerdings sind einige Strukturen nicht durch ICC erkannt werden (wie dünne Filopodien), sondern eine Kombination von F-Actin Phalloidin Kennzeichnung mit den Antikörpernachweis (oder Doppelmarkierung mit zwei verschiedenen Antikörpern) kann für spezifische und komplexe Untersuchung der synaptischen Subpopulationen und unterschiedlichen Reaktionen auf experimentelle Behandlungen ermöglichen.

F-Actin puncta kann partic seinders empfindlich auf experimentelle Behandlungen. Wir berichteten kürzlich, dass die Behandlung mit HIV-1 Tat-Proteins eine Abnahme der F-Actin puncta (24 h) vor jeder Evidenz für offene neuronalen Tod hergestellt (48 h) 10. Es ist bemerkenswert, dass experimentelle Behandlungen entweder ansteigen (Memantin) oder verringern (Methamphetamin + HIV-1-Tat) F-Actin puncta. Wir fanden auch, dass F-Actin puncta Verlust einer reversiblen Reaktion folgenden spezifischen experimentellen Behandlungen ist 10. Als solches ist F-Aktin puncta Quantifizierung ein wertvolles Werkzeug zur Überwachung nicht nur akute Synaptopathie, sondern auch synaptische Rückgewinnung und experimentellen neurorestoration Verfahren zu studieren.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass MatTek Corporation P35G-1.5-20-C
DMEM/F12 medium Life Technologies 10565-018
Trypsin-EDTA Life Technologies 15400-054
Poly-L-Lysine Sigma P9155
Boric acid Sigma B0252
Borax Sigma B9876
GlutaMax Life Technologies 35050-061 100X
Glucose VWR 101174Y
HBSS Sigma H4641 10X
Neurobasal medium Life Technologies 21103-049
B-27 supplement Life Technologies 17504-044 50X
Antibiotic-Antimycotic solution Cellgro 30004CI 100X
Sodium Bicarbonate Life Technologies 25080
Vannas Scissors World Precision Instruments 500086
Iris Scissors World Precision Instruments 500216
Iris Forceps World Precision Instruments 15914
Dumont #7 Forceps World Precision Instruments 14097
Dumont #5 Forceps World Precision Instruments 14095
ProLong Gold Life Technologies P36930
Paraformaldehyde  Sigma P6148
Cover glass VWR 631-0137
AlexaFluor 488 Phalloidin Life Technologies A12379
Normal horse serum Life Technologies 26050-070
Chicken polyclonal anti-MAP2 abcam Ab92434
Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG Life Technologies A11042
NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342 Life Technologies R37605
NIS-Elements software package Nikon Instruments
Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope  Nikon Instruments
0.2 μm Nalgene nylon membrane filter Fishersci 151-4020

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References

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Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (108), e53697, doi:10.3791/53697 (2016).More

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