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Neuroscience

चूहा cortical न्यूरॉन्स में filamentous actin (एफ actin) puncta की मात्रा

doi: 10.3791/53697 Published: February 10, 2016
* These authors contributed equally

Abstract

Filamentous actin प्रोटीन (एफ actin) spinogenesis, synaptic plasticity, और synaptic स्थिरता में एक प्रमुख भूमिका निभाता है। वृक्ष के समान एफ actin अमीर संरचनाओं में परिवर्तन अन्तर्ग्रथनी अखंडता और कनेक्टिविटी में परिवर्तन का सुझाव है। यहाँ हम एफ actin puncta, और बाद में मात्रा का ठहराव तकनीक के लिए प्राथमिक चूहे cortical न्यूरॉन्स, Phalloidin धुंधला संवर्धन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। सबसे पहले, E18 चूहा भ्रूण के ललाट प्रांतस्था, कम घनत्व सेल संस्कृति में अलग कर रहे हैं तो कम से कम 12-14 दिनों के लिए इन विट्रो में उगाया न्यूरॉन्स। और microtubule जुड़े प्रोटीन 2 (वृक्ष के समान एफ actin puncta लेबल करने के लिए) प्रयोगात्मक उपचार के बाद, cortical न्यूरॉन्स AlexaFluor 488 Phalloidin साथ दाग रहे हैं (MAP2; neuronal कोशिकाओं और वृक्ष के समान अखंडता को मान्य करने के लिए)। अंत में, विशेष सॉफ्टवेयर का विश्लेषण और बेतरतीब ढंग से चुनी न्यूरोनल डेन्ड्राइट यों इस्तेमाल किया जाता है। एफ actin अमीर संरचनाओं दूसरा आदेश वृक्ष के समान शाखाओं (लंबाई सीमा 25-75 & पर पहचाने जाते हैं# 181; निरंतर MAP2 immunofluorescence के साथ मीटर)। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक उपचार के बाद के वृक्ष के समान अन्तर्ग्रथन संरचनाओं में परिवर्तन की जांच के लिए एक उपयोगी तरीका होगा।

Introduction

इस अध्ययन का प्राथमिक लक्ष्य न्यूरोनल वृक्ष के समान नेटवर्क के synaptic अखंडता की माप (अनुमान) का एक विश्वसनीय विधि विकसित करने का है। यहाँ हम प्राथमिक चूहे सुसंस्कृत Phalloidin धुंधला और immunocytochemical (आईसीसी) के विशेष (एनआईएस-तत्वों) सॉफ्टवेयर का उपयोग कर के बाद के विश्लेषण के साथ डेन्ड्राइट का पता लगाने के संयोजन का उपयोग न्यूरॉन्स में एफ actin puncta की मात्रा का ठहराव का वर्णन है।

लेबल phallotoxins दोनों बड़े और छोटे तंतु (एफ actin) के लिए इसी तरह की समानता है, लेकिन कुछ actin एंटीबॉडी 1 विपरीत monomeric गोलाकार actin (जी actin) करने के लिए बाध्य नहीं है। अविशिष्ट Phalloidin के बंधन इस प्रकार सेलुलर इमेजिंग के दौरान कम से कम पृष्ठभूमि प्रदान करने, नगण्य है। Phalloidin एंटीबॉडी कि आम तौर पर फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी, जो Phalloidin द्वारा एफ actin की बहुत अधिक तीव्र लेबलिंग के लिए अनुमति देता है के लिए सेलुलर प्रोटीन लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा की तुलना में काफी छोटा होता है। इस प्रकार, न्यूरॉन्स में एफ actin स्थानीयकरण के विस्तृत चित्र हो सकता हैलेबल Phalloidin के उपयोग के माध्यम से प्राप्त की।

Phalloidin (एफ actin) न्यूरोनल dendrites के धुंधला असतत 'हॉट स्पॉट' या तेज "puncta", जो परिपक्व कांटा, गैर काँटेदार synapses 2 और अपरिपक्व कांटा सहित वृक्ष के समान संरचनाओं की एक किस्म का प्रतिनिधित्व उत्पन्न करता है। अपरिपक्व कांटा पतली filopodia और पैच आकृति विज्ञान के कुछ रूपों में शामिल हैं, और spinogenesis 3 की दीक्षा का प्रतिनिधित्व कर सकते। अपरिपक्व कांटा और गैर-काँटेदार पैच PSD95 4 की कमी है। , एफ actin न केवल कांटा में बाद में परिवर्तन लेकिन यह भी अतिरिक्त वृक्ष के समान संरचनाओं के लिए नेतृत्व के उत्पादन में परिवर्तन इस प्रकार Phalloidin synaptodendritic अखंडता 5-7 की जांच के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बना रही है। सामान्य तौर पर, Phalloidin पॉजिटिव (एफ actin) puncta की संख्या सक्रिय synapses के बीच एक संतुलन (उत्तेजक और निरोधात्मक), actin गतिशीलता और अन्तर्ग्रथन स्थिरता 8 दर्शाते हैं।

हालांकि यह विशेष टी अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण हैsynapses (यानी, उत्तेजक कांटा) के ypes, जब एक उपचार का लक्ष्य अज्ञात है यह पहली वृक्ष के समान संरचनाओं की एक किस्म के सामान्य अखंडता अनुमान लगाने के लिए आवश्यक है। चूंकि एफ actin वृक्ष के समान कांटा और निरोधात्मक synapses, एफ actin puncta का बदला हुआ संख्या एक synaptopathy का संकेत हो सकता सहित अन्य संरचनाओं की एक प्रमुख घटक है। इस synaptopathy तो और अधिक विशिष्ट परिवर्तन के लिए आगे की जांच की जा सकती है। कई synaptic प्रकार / संरचनाओं का पता लगाने के लिए हमारी मात्रा का ठहराव विधि वृक्ष के समान synaptic परिवर्तन (बढ़ जाती है और कम हो जाती है) विभिन्न प्रयोगात्मक उपचार के बाद की एक समग्र अनुमान अर्जित करता है।

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Protocol

सभी पशु प्रोटोकॉल की समीक्षा की और दक्षिण कैरोलिना विश्वविद्यालय में पशु की देखभाल और उपयोग समिति (आश्वासन संख्या: A3049-01) द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. कम घनत्व भ्रूण neuronal संस्कृति

  1. प्राथमिक cortical न्यूरॉन संस्कृति के लिए तैयारी
    1. समाधान की:
      1. 10 मिलीलीटर borate बफर में पाली एल Lysine की 5 मिलीग्राम भंग द्वारा पाली एल Lysine शेयर समाधान तैयार है।
      2. 49 मिलीलीटर borate बफर में 1 मिलीलीटर पाली एल Lysine शेयर गिराए द्वारा समाधान काम कर तैयार करें।
      3. 395 मिलीलीटर DH 2 हे के साथ शुरू करने और फिर सभी सामग्री (1.24 छ बोरिक एसिड + 1.9 बोरेक्स के छ) जोड़कर borate बफर, पीएच 8.4 से तैयार करें। 1 एम NaOH से 8.4 पीएच को समायोजित करें। 400 मिलीलीटर को समायोजित करने और हुड के नीचे के साथ 0.2 माइक्रोन नायलॉन झिल्ली फिल्टर फिल्टर।
      4. 445 मिलीलीटर DH 2 हे के साथ शुरू करने और अन्य सभी सामग्री जोड़कर HBSS समाधान, पीएच 7.2 तैयार (50 मिलीलीटर 10X HBSS स्टॉक + 1.2 जी HEPES)। 1 एन एचसीएल, Bri से 7.2 पीएच को समायोजित करेंएनजी के लिए 500 मिलीग्राम और साथ हुड के तहत 0.2 माइक्रोन नायलॉन झिल्ली फिल्टर फिल्टर।
      5. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ DMEM / F12: चढ़ाना मध्यम तैयार। साथ हुड के तहत 0.2 माइक्रोन नायलॉन झिल्ली फिल्टर फिल्टर।
      6. पूर्ण विकास के माध्यम से तैयार: 50 मिलीलीटर Neurobasal मध्यम करने के लिए की खुराक जोड़ने (500 μl GlutaMAX (100x) + 500 μl ग्लूकोज + 1 मिलीलीटर बी 27 (50X) + 500 एंटीबायोटिक antimycotic समाधान (100x के μl) + 100 μl 7.5% सोडियम बाइकार्बोनेट। साथ हुड के तहत 0.2 माइक्रोन नायलॉन झिल्ली फिल्टर फिल्टर।
    2. दो दिन पहले संस्कृति:
      1. पाली एल Lysine काम कर समाधान के 2 मिलीलीटर, और डाकू हे / एन के तहत रखने के साथ कोट बारह 35 मिमी गिलास नीचे व्यंजन।
    3. एक दिन पहले संस्कृति:
      1. व्यंजन से खाली कोटिंग एजेंट और DDH 2 ओ के साथ कुल्ला व्यंजन हुड के तहत एक घंटे के लिए शुष्क करने की अनुमति दें।
      2. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (कुल समाधान के 10%) के साथ चढ़ाना मध्यम (DMEM / F12 तैयार करें। पिपेट 2 मिलीलीटर माध्यम मेंप्रत्येक पकवान, और 37 सी, 5% सीओ 2 पर सेते हे / एन।
        नोट: यह जब संवर्धन प्लास्टिक संस्कृति व्यंजन से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। गिलास नीचे व्यंजन (उल्टे सूक्ष्मदर्शी के लिए) या कांच coverslips (ईमानदार सूक्ष्मदर्शी के लिए) का उपयोग तेज और स्पष्ट छवियों पैदावार। एक प्लास्टिक-नीचे पकवान की तुलना में, गिलास नीचे पकवान फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के दौरान अवांछित रंग या चमक से बचा जाता है।
  2. सेल संस्कृति प्रोटोकॉल:
    1. प्रशीतित रखो HBSS बफर (100-150 मिलीलीटर), 100 मिमी पेट्री डिश, संदंश, कैंची, 50 मिलीलीटर ट्यूब, और हुड में पराबैंगनी प्रकाश के तहत 15 मिलीलीटर ट्यूब।
    2. संस्कृति कमरे के बाहर हुड के तहत 5% sevoflurane की घातक साँस लेना के साथ गर्भवती चूहे euthanize।
    3. 70% EtOH, तम्बू संदंश का उपयोग पेट cavity.Open गर्भाशय कैंची का उपयोग नाल बेनकाब करने के लिए के बीच में पूंछ ऊपर से कटौती करते हुए पेट के निचले हिस्से की त्वचा के साथ बाँझ।
    4. 8-10 E18 भ्रूण निकालें। पीएलएHBSS समाधान युक्त पेट्री डिश में 8-10 भ्रूण सीई।
    5. संदंश के साथ भ्रूण के सिर के पीछे पकड़ो, तो कैंची का उपयोग शरीर से सिर तोड़ने के लिए। यह एक और पेट्री HBSS के 5-7 मिलीलीटर से भरा डिश में रखें। हुड के लिए पकवान स्थानांतरण।
    6. ठंड HBSS के साथ दो अतिरिक्त 100 मिमी पेट्री डिश भरें।
    7. पील तरफ खोपड़ी, और HBSS से भरा एक नया पेट्री डिश में मस्तिष्क स्कूप।
    8. दिमाग से तेज घुमावदार संदंश, अलग सेरिबैलम और मस्तिष्क स्टेम प्रयोग करें, तो उस में ठंड HBSS के साथ एक नया पेट्री डिश के लिए मस्तिष्क हस्तांतरण।
    9. सुरक्षित करने के लिए चिमटी का प्रयोग करें, घुमावदार संदंश के साथ गोलार्द्धों अलग। तानिका निकालें; चिह्नित 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में ललाट प्रांतस्था और हस्तांतरण टुकड़े अलग।
    10. ताजा 2 मिलीलीटर HBSS के साथ 15 मिलीलीटर ट्यूब भरें और प्रत्येक 15 मिलीलीटर ट्यूब को 20 μl Trypsin EDTA (0.5% trypsin और 5.3 मिमी EDTA। साथ 10x केंद्रित मिश्रण) जोड़ें।
    11. आरटी पर 10-15 मिनट सेते हैं। धीरे ट्यूब हर कुछ मिनट चक्कर आने, बसने की अनुमति नहीं है।
    12. वायु सेनाआतंकवाद 10-15 मिनट, उपयोग गिलास पिपेट वर्ष HBSS को हटाने और नए HBSS के साथ दो बार कुल्ला करने के लिए।
    13. trypsin अवरोध में विसर्जित कर दिया (1 मिलीग्राम / एमएल, 2 मिलीग्राम ट्रिप्सिन 2 मिलीलीटर HBSS में अवरोध), अच्छा मिश्रण है और इसे 5 मिनट बैठते हैं। ताजा HBSS के साथ दो बार धोएं।
    14. रबर बल्ब के साथ कांच विंदुक का प्रयोग, Triturate मस्तिष्क टुकड़े 10-15 बार बहुत धीरे धीरे इतनी के रूप में फिर से एक calibrated पिपेट और सजातीय जब तक बहुत धीरे धीरे एक कम टिप व्यास के साथ एक बाँझ टिप का उपयोग कर bubbles.Triturate से बचने के लिए।
    15. स्थानांतरण वांछित घनत्व में कोशिकाओं को अलग करने के लिए पूर्व तैयार लेपित संस्कृति व्यंजन (50 कोशिकाओं / मिमी 2)। 37 सी, 5% सीओ 2 पर सेते हे / एन।
    16. 24 घंटे के बाद, ताजा बना पूर्ण विकास सीरम मुक्त Neurobasal माध्यम के साथ DMEM / F12 मध्यम जगह।
    17. प्रयोग से पहले कम से कम 12-14 दिनों के लिए एक 5% सीओ 2/95% कमरे में हवा humidified इनक्यूबेटर में हर समय कोशिकाओं को बनाए रखें। ताजा Neurobasal मध्यम पुराने मध्यम का लगभग 50% की जगह के साथ कोशिकाओं अनुपूरक हर 5-6 दिनों के लिए।

2. फ्लोरोसेंट लेबल और Immunocytochemistry

नोट: प्राथमिक cortical सेल संस्कृतियों के immunofluorescent लेबलिंग 1 मिलीलीटर की एक काम की मात्रा के साथ गिलास नीचे 35 मिमी सेल संस्कृति बर्तन में बाहर किया गया था।

  1. गिलास नीचे पकवान फॉस्फेट बफर खारा 7.4 पीएच (पीबीएस) के साथ दो बार धोएं।
  2. आरटी पर 15 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde के साथ कोशिकाओं को ठीक करें।
  3. कोशिकाओं पीबीएस के साथ दो बार धोएं और 5 मिनट के लिए पीबीएस में 0.1% ट्राइटन X-100 के साथ permeabilize।
  4. एक एफ actin विशिष्ट दाग के साथ आरटी पर 20 मिनट के लिए कोशिकाओं को समझो, AlexaFluor 488 Phalloidin (1:40, 1 मिलीलीटर पीबीएस में Phalloidin के 25 μl)।
  5. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार कुल्ला और 1-2 घंटे के लिए आरटी पर 10% सामान्य बकरी सीरम के साथ ब्लॉक।
  6. 2% सामान्य बकरी सीरम के साथ पीबीएस में और ओ / एन सेते 4 सी पर: चिकन पॉलीक्लोनल विरोधी MAP2 एंटीबॉडी (2500 1) पतला
  7. ऊष्मायन के बाद, दो बार पीबीएस में कुल्ला।
  8. माध्यमिक एंटीबॉडी (एलेक्सा आर पतलाएड 594 संयुग्मित बकरी विरोधी चिकन आईजीजी (1: 500) 2% सामान्य बकरी सीरम के साथ और आरटी पर 2 घंटे के लिए सेते हैं।
  9. पीबीएस के साथ कुल्ला और 10 μl / Hoescht डाई के पकवान जोड़ें।
  10. आरटी पर 3 मिनट सेते हैं और दो बार पीबीएस से धो लें।
    नोट: अब लेबल की कोशिकाओं चरण 3 (एफ actin puncta गिनती) के लिए तैयार है।
  11. एक एजेंट के रूप में coverslipping antifade अभिकर्मक के 100 μl के साथ सेल नमूना संरक्षण और लंबी अवधि के भंडारण के लिए अंधेरे में 4 सी पर रहते हैं।
    नोट: Phalloidin अपेक्षाकृत के लिए 1 सप्ताह और प्रतिदीप्ति को antifade coverslipping अभिकर्मकों के साथ संरक्षित किया जा सकता अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में स्थिर है। हालांकि, इष्टतम छवियों धुंधला के बाद 1-3 दिनों से प्राप्त कर रहे हैं के बाद से Phalloidin विस्तारित भंडारण के साथ बाहर फैलाना शुरू कर सकते हैं।

3. एफ actin puncta गिनती

  1. फ्लोरोसेंट खुर्दबीन पर मुड़ें और 20 × उद्देश्य के लिए स्विच। ओपन माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर, और 1280 × 960 पिक्सेल छवि आकार में कार्यक्रम निर्धारित करते हैं, और 0.11 × ज़ूम पर 7 माइक्रोन / पिक्सेल छवि संकल्प।
  2. ग्रीन (495 एनएम) / लाल (613 एनएम) फ्लोरोसेंट चैनलों के तहत सह-लेबल एफ actin / MAP2 न्यूरॉन्स की छवियों मोल।
  3. 5 ग्रीन (एफ actin) / लाल (MAP2) immunolabeled / ब्लू (Hoescht) स्पष्ट रूप से परिभाषित वृक्ष के समान arbors के साथ व्यक्तिगत न्यूरॉन के फ्लोरोसेंट छवियों का चयन करें।
  4. निरंतर MAP2 immunofluorescence के साथ दूसरे क्रम वृक्ष के समान खंड (लंबाई रेंज 25-75 माइक्रोन) में एफ actin अमीर संरचनाओं को पहचानें।
  5. एक क्षैतिज स्तर के लिए छवियों के चयनित क्षेत्र घुमाएँ। कॉपी और एक नई छवि के रूप में पेस्ट करें।
  6. छवियों की पृष्ठभूमि घटाना, प्रत्येक पकवान के लिए एक सुसंगत समायोजन का उपयोग कर।
  7. चमकीले हरे एफ actin puncta गणना और मैन्युअल प्रशिक्षित स्वतंत्र पर्यवेक्षकों द्वारा चयनित वृक्ष के समान खंड की लंबाई का पता लगा। एक स्प्रेडशीट फ़ाइल में डेटा निर्यात।
  8. लंबाई (एल) के MAP2 लेबल डेन्ड्राइट द्वारा कुल एफ actin लेबल puncta (एन) को विभाजित करके घनत्व की गणना। एफ-एसी की संख्या के रूप एक्सप्रेस डेटाडेन्ड्राइट के 10 माइक्रोन प्रति टिन puncta
    नोट: puncta वृक्ष के समान शाफ्ट में धुंधला की तीव्रता औसत से ऊपर कम से कम 50% की एक चोटी तीव्रता के साथ एफ actin प्रतिदीप्ति की (आकार ≤1.5 माइक्रोन) प्रत्येक चयनित वृक्ष के समान खंड में शामिल थे।

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Representative Results

वर्तमान तरीकों में, हम पहले संस्कृति चूहा 35 मिमी गिलास नीचे बर्तन में कम घनत्व है, जो हमें व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की dendrites की पहचान करने की अनुमति देता है पर cortical न्यूरॉन्स। चित्रा 1 में, अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) छवियों दिन 4, 6, 10, 14, 21 और 27 पर इन विट्रो में भ्रूण चूहे cortical न्यूरॉन्स के विकास में रूपात्मक बदलाव दिखा। ध्यान दें कि लंबाई और dendrites की संख्या सुसंस्कृत चूहे प्राथमिक न्यूरॉन्स की परिपक्वता के साथ वृद्धि हुई है। न्यूरॉन्स के बाद ही 14 दिनों परिपक्वता प्रयोगों में इस्तेमाल किया जाता है।

वृक्ष के समान और synaptic परिवर्तन का पता लगाने के लिए, हम dendrites के MAP2 एंटीबॉडी का पता लगाने के साथ Phalloidin एफ actin लेबलिंग गठबंधन। चूंकि एफ actin के Phalloidin लेबलिंग बहुत तेजी से होता है (20-30 मिनट), यह संभव है कि नेत्रहीन आईसीसी एंटीबॉडी लेबलिंग (चित्रा 2 के साथ आगे बढ़ने से पहले synaptodendritic नेटवर्क की अखंडता अनुमान लगाने के लिए

अगला, हम सह लेबल Phalloidin (एफ actin) / MAP2 न्यूरॉन्स के उच्च संकल्प छवियों के अधिग्रहण और बेतरतीब ढंग से चुनी न्यूरॉन्स का विश्लेषण किया। ललित filopodia, रीढ़ की हड्डी उभार, और एफ actin पैच एफ actin अमीर संरचनाओं विचार किया गया और हमारे अध्ययन (चित्रा 3) में शामिल थे। दूसरा आदेश डेन्ड्राइट (MAP2 सकारात्मक) के क्षेत्रों एफ actin puncta घनत्व के विश्लेषण के लिए चयन किया गया था। MAP2 सकारात्मक धुंधला एफ actin puncta के न्यूरोनल स्थानीयकरण पुष्टि करने के लिए प्रयोग किया जाता है। कम्प्यूटर की सहायता का पता लगाने और Phalloidin (एफ actin) लेबल (हरी प्रतिदीप्ति चैनल) की गिनती synaptic puncta विशेष सॉफ्टवेयर के उपयोग के माध्यम से प्रदर्शन किया गया था। वहाँ चित्रा 4 में कदम विस्तृत प्रोटोकॉल द्वारा एक कदम है (2 आर = 0.97) रहा है।

इससे पहले, हम synaptodendritic चोट एचआईवी -1 गूंथना प्रेरित synaptopathy 10 से एचआईवी -1 9 गूंथना और वसूली से प्रेरित आकलन करने के लिए एफ actin puncta की मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया। चित्रा 5 में, चूहे cortical न्यूरॉन्स सह लेबल थे एचआईवी -1 गूंथना उपचार के बाद 50 एनएम Phalloidin और MAP2 एंटीबॉडी के साथ। MAP2 धुंधला कम वृक्ष के समान शाखाओं का पता चला और एचआईवी -1 जैसे-इलाज के बाद कम एफ actin।

हमने पाया है कि एफ actin puncta या तो वृद्धि या प्रयोगात्मक उपचार के जवाब में कम हो सकती है। चित्रा 6 में, सभ्य न्यूरॉन्स वें के साथ इलाज किया गयाई अप्रतिस्पर्धी NMDA रिसेप्टर प्रतिपक्षी memantine, काफी एफ actin सकारात्मक puncta बढ़ रही है। इसके विपरीत, methamphetamine + एचआईवी -1 गूंथना के संयोजन के साथ इलाज एफ actin puncta के महत्वपूर्ण नुकसान में हुई।

आकृति 1
चित्रा सेल संस्कृति में 1. भ्रूण चूहे cortical न्यूरॉन्स के बीच 4 भ्रूण चूहे cortical न्यूरॉन्स के अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) छवियों -। इन विट्रो में 27 दिन (20X)। न्यूरॉन्स इन विट्रो में 14 दिनों में परिपक्व दिखाई देते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. Phalloidin / MAP2 चूहे cortical न्यूरॉन्स में सह-लेबलिंग। संवर्धित नक्शे के साथ लेबल न्यूरॉन्स2 एंटीबॉडी (लाल) और Phalloidin (हरा)। मर्ज किए गए छवियों दृढ़ संकल्प है कि Phalloidin धुंधला न्यूरोनल डेन्ड्राइट (20X) के लिए स्थानीय है। अनुमति देते हैं कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा चूहे cortical न्यूरॉन्स की 3. एफ actin synaptic संरचनाओं। (ए) वाम - एफ actin सकारात्मक संरचनाओं Phalloidin (60X) के साथ लेबल। तीर का संकेत एफ actin लेबल संरचनाओं मशरूम कांटा (बैंगनी), पैच की तरह आकारिकी (नीला) और लंबी filopodia (नारंगी) शामिल हैं। मध्य - मर्ज किए गए छवि इन एफ actin संरचनाओं का प्रदर्शन डेन्ड्राइट (20X) के लिए स्थानीय कर रहे हैं। राइट - निचले सही में बॉक्स दूसरा आदेश वृक्ष के समान विश्लेषण (20X) के लिए चयनित शाखा को इंगित करता है (बी) Phalloidin (एफ actin) (ग्रीन) / MAP2 के वृक्ष के समान खंडों। (लाल) के सह-लेबल cortical न्यूरॉन्स (20X) एफ actin puncta के न्यूरोनल मूल सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। हरे रंग की ही छवि (Phalloidin / एफ actin) आगे की कार्रवाई की है। (सी) Phalloidin / एफ actin (हरा) तीन वृक्ष के समान puncta गिनती के लिए चुने गए क्षेत्रों की छवियों। घनत्व विभाजित एन / एल से निर्धारित होते हैं। एन = puncta, एल = वृक्ष के समान खंड की लंबाई की संख्या। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. सॉफ्टवेयर पैकेज का प्रदर्शन:। कदम से कदम निर्देश यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 5. एचआईवी -1 जैसे चूहे cortical न्यूरॉन्स में synaptodendritic चोट मध्यस्थता। सेल संस्कृतियों एचआईवी -1 जैसे प्रोटीन उपचार (50nm) के बाद एफ actin और MAP2 के लिए सह दाग रहे थे। अपर दिखा मजबूत एफ actin, जटिल शाखाओं में बंटी पैटर्न, और व्यापक ठीक neuronal प्रक्रियाओं इलाज न्यूरॉन्स panels-। कम पैनल - कम एफ actin और कम वृक्ष के समान शाखाओं में बंटी के साथ एचआईवी -1 जैसे प्रोटीन का इलाज किया न्यूरॉन्स। (20X) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6 एफ actin चूहे cortical न्यूरॉन्स में puncta:। अलग बनाम Methamphetamine + गूंथना उपचार Memantine द्वारा उत्पादित प्रभाव इलाज सभ्य न्यूरॉन्स की छवियाँ (20X), Memantine (10 माइक्रोन) के साथ इलाज किया न्यूरॉन्स, और न्यूरॉन्स Methamph के साथ इलाजetamine (20 माइक्रोन) गूंथना (10nm) का 10 एनएम। Memantine उपचार, एफ actin धुंधला वृद्धि हुई जबकि Methamphetamine + एचआईवी -1 गूंथना उपचार एफ actin धुंधला कमी आई है और वृक्ष के समान शाखाओं में कमी आई है। Memantine उपचार काफी एफ actin puncta घनत्व, अनुपचारित नियंत्रण संस्कृतियों के सापेक्ष वृद्धि हुई है। इसके विपरीत, methamphetamine + एचआईवी -1 गूंथना उपचार काफी एफ actin puncta घनत्व, अनुपचारित नियंत्रण संस्कृतियों के सापेक्ष कम किया है। मतलब + SEM, * पी ​​<0.05। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में, हम 35 मिमी गिलास नीचे बर्तन में कम घनत्व जो हमें व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की dendrites की पहचान करने की अनुमति देता है पर चूहा cortical न्यूरॉन्स संवर्धन का वर्णन है। अगला, हम वृक्ष के समान परिवर्तन का पता लगाने के लिए Phalloidin और MAP2 धुंधला का उपयोग करें। तो, हम विशेष सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल एफ actin puncta में परिवर्तन यों की।

एफ actin puncta एक व्यक्ति के न्यूरॉन के पूरे नेटवर्क न्यूरोनल स्पष्ट रूप से दिखाई होना चाहिए में परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए, यह एक न्यूरॉन से उपयुक्त दूसरा आदेश वृक्ष के समान क्षेत्रों के चयन की अनुमति देता। कम घनत्व चढ़ाना दोनों अलग-अलग न्यूरॉन्स कल्पना के साथ ही glial कोशिकाओं की उपस्थिति को कम करने के क्रम में करने के लिए महत्वपूर्ण है। Astrocytes भी एफ actin होते हैं और एक neuronal मार्कर के बिना, एफ actin सकारात्मक puncta के विश्लेषण उलझाना सकता है। कम घनत्व संस्कृतियों और Neurobasal माध्यम का प्रयोग सेल संस्कृतियों में astrocytic प्रसार को कम करने में सहायक होते हैं। हालांकि, दी चेतावनी है कि एफ actin प्रोटीन होता हैन्यूरॉन्स, ऐसे MAP2 के रूप में विशिष्ट न्यूरोनल प्रोटीन मार्कर, के लिए विशिष्ट नहीं, Phalloidin के साथ एक साथ इस्तेमाल किया जाना चाहिए। अन्य प्रोटीन एंटीबॉडी भी Phalloidin, ऐसे वें के रूप में (tyrosine hydroxylase) संस्कृति में विशिष्ट neuronal आबादी की पहचान के लिए के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

synapses और synaptic आकृति विज्ञान के अध्ययन के लिए एक सामान्य तकनीक immunocytochemistry (आईसीसी) है। आईसीसी लोकप्रिय है के बाद से synaptic प्रोटीन के लिए कई एंटीबॉडी PSD सहित 95 आसानी से उपलब्ध हैं, NMDAR (बाद synaptic) के साथ ही synaptophysin, अलगोजा और मैं (पूर्व synaptic) synapsin 11. हालांकि, कुछ संरचनाओं आईसीसी (जैसे से नहीं पाया जा सकता है पतली filopodia), लेकिन एंटीबॉडी का पता लगाने (या दो अलग अलग एंटीबॉडी के साथ डबल लेबलिंग के साथ एफ actin Phalloidin लेबलिंग का एक संयोजन) synaptic उप-जनसंख्या और प्रयोगात्मक उपचार के लिए अंतर प्रतिक्रियाओं के विशिष्ट और जटिल जांच के लिए अनुमति हो सकती है।

एफ actin puncta खास हो सकता हैularly प्रयोगात्मक उपचार के प्रति संवेदनशील। हमने हाल ही में खबर दी है कि एचआईवी -1 जैसे प्रोटीन के साथ इलाज के एफ actin puncta (24 घंटे) प्रकट neuronal मौत (48 घंटा) 10 के लिए किसी भी सबूत के लिए पूर्व में कमी का उत्पादन किया। यह ध्यान रखें कि प्रयोगात्मक उपचार या तो वृद्धि (memantine) या कमी (methamphetamine + एचआईवी -1 बुनना) एफ actin puncta की है। हम यह भी पाया कि एफ actin puncta नुकसान विशिष्ट प्रयोगात्मक उपचार के बाद एक 10 प्रतिवर्ती प्रतिक्रिया है। जैसे, एफ actin puncta मात्रा का ठहराव न केवल तीव्र synaptopathy, लेकिन यह भी synaptic वसूली और प्रयोगात्मक neurorestoration प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए निगरानी के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass MatTek Corporation P35G-1.5-20-C
DMEM/F12 medium Life Technologies 10565-018
Trypsin-EDTA Life Technologies 15400-054
Poly-L-Lysine Sigma P9155
Boric acid Sigma B0252
Borax Sigma B9876
GlutaMax Life Technologies 35050-061 100X
Glucose VWR 101174Y
HBSS Sigma H4641 10X
Neurobasal medium Life Technologies 21103-049
B-27 supplement Life Technologies 17504-044 50X
Antibiotic-Antimycotic solution Cellgro 30004CI 100X
Sodium Bicarbonate Life Technologies 25080
Vannas Scissors World Precision Instruments 500086
Iris Scissors World Precision Instruments 500216
Iris Forceps World Precision Instruments 15914
Dumont #7 Forceps World Precision Instruments 14097
Dumont #5 Forceps World Precision Instruments 14095
ProLong Gold Life Technologies P36930
Paraformaldehyde  Sigma P6148
Cover glass VWR 631-0137
AlexaFluor 488 Phalloidin Life Technologies A12379
Normal horse serum Life Technologies 26050-070
Chicken polyclonal anti-MAP2 abcam Ab92434
Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG Life Technologies A11042
NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342 Life Technologies R37605
NIS-Elements software package Nikon Instruments
Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope  Nikon Instruments
0.2 μm Nalgene nylon membrane filter Fishersci 151-4020

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References

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  2. Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker, G. Selective clustering of glutamate and gamma-aminobutyric acid receptors opposite terminals releasing the corresponding neurotransmitters. Proc Natl Acad Sci USA. 91, 12373-12377 (1994).
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चूहा cortical न्यूरॉन्स में filamentous actin (एफ actin) puncta की मात्रा
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Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (108), e53697, doi:10.3791/53697 (2016).More

Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (108), e53697, doi:10.3791/53697 (2016).

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